Extração e purificação de polifenóis a partir de pó de baga liofilizado para o tratamento de células musculares lisas vasculares<em&gt; In Vitro</em

Resumo

Este trabalho detalha um método passo a passo para preparar extratos ricos em polifenóis de pó de baga liofilizado. Além disso, fornece uma descrição completa de como usar esses extratos ricos em polifenóis em cultura celular na presença do hormônio peptídico angiotensina II (Ang II) usando células musculares lisas vasculares (VSMCs).

Resumo

Estudos epidemiológicos indicam que o aumento da ingestão de flavonóides correlaciona-se com a diminuição da mortalidade por doenças cardiovasculares (DCV) nos Estados Unidos (EUA) e na Europa. As bagas são amplamente consumidas nos EUA e têm um alto conteúdo polifenólico. Os polifenóis demonstraram interagir com muitos alvos moleculares e exercer numerosas funções biológicas positivas, incluindo efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e cardioprotetores. Os polifenóis isolados do blackberry (BL), da framboesa (RB) e da framboesa preta (BRB) reduzem o estresse oxidativo e a senescência celular em resposta à angiotensina II (Ang II). Este trabalho fornece uma descrição detalhada do protocolo usado para preparar os extratos de polifenóis de bagas liofilizadas. As extracções de polifenóis a partir de pó de baga liofilizado foram realizadas utilizando 80% de etanol aquoso e um método de extração assistida por ultra-som. O extracto em bruto foi ainda purificado e fraccionado utilizando clorofórmio e acetato de etilo,respectivamente. Os efeitos de extratos brutos e purificados foram testados em células musculares lisas vasculares (VSMCs) em cultura.

Introdução

Os polifenóis são compostos contendo pelo menos um anel fenólico em sua estrutura e estão abundantemente presentes no reino vegetal ¹ . Os seres humanos têm consumido plantas por milênios para fins medicinais sem estar ciente da existência de tais compostos ² . Muitas frutas e vegetais têm alguns compostos polifenólicos compartilhados, embora com diferentes quantidades, incluindo flavonóides, stilbenos e ácidos fenólicos ³ . Embora os polifenóis sejam freqüentemente associados a frutas e vegetais coloridos, isso não é estritamente verdadeiro. Por exemplo, a zeaxantina e a xantina estão presentes ....

Protocolo

1. Preparação de Reagentes

1. Prepare 80% de etanol (100 mL) misturando 80 mL de etanol absoluto (grau de biologia molecular) e 20 mL de água estéril de grau de cultura celular.
2. Para preparar extrato de polifenol (10 mg / mL), pesa 10 mg de CE ou PE. Adicione 1 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sob uma capa de cultura de células. Vortex a solução. Alíquota em porções de 200 μL e armazene a -20 ° C.
3. Prepare o tampão de lise.
   1. Adicionar 5 mL de solução de reserva de HEPES 1 M (pH 7,4, final de 50 mM), 1 mL de solução de reserva de NaCl 5 M (50 mM de final), 1 mL de solução de reserva de EDTA 0,5 M (final 5 mM), 2 mL d....

Resultados

Foi demonstrado anteriormente que os extratos de polifenóis isolados de BL, RB e BRB reduziram a senescência de VSMCs em resposta a Ang II ²¹ . Verificou-se que estes extratos de polifenóis purificados modulam a sinalização de Ang II através da redução da fosforilação de Akt, p38 Mitrogen-activated Protein Kinase (MAPK) e ERK1 / 2. BL evita a senescência ao reduzir a expressão da NADPH oxidase (Nox) 1, uma enzima que produz aniões superóxido e está fortemente regu.......

Discussão

Os polifenóis isolados das bagas contêm composições distintas. O protocolo de extração baseado em etanol descrito aqui permitiu a identificação de diferentes níveis de ácidos fenólicos e flavonóides presentes em extratos de polifenóis brutos e purificados de BL ( Tabela 1 ). CE foi enriquecido em ácido gálico, ácido ferúlico, ácido 4-O-cafeoilquinico e ácido 5-O-cafeoilquinico. O processo de purificação não alterou significativamente os níveis de ácido gálico e ácido p-cumarico. No entanto, aumentou os .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Angiotensina II	Sigma-Aldrich, Inc.	A9525-10MG	Tratamento de VSMCs
β-actina	Sigma-Aldrich, Inc.	A2228	Anticorpo primário (1:5000)
Fruta de amora	Mercer Foods		Pó de amora liofilizado
Catalase	Calbiochem	219010	Anticorpo primário (1:1000)
Chloroform	Biotech Grd, Inc.	97064-678	Preparação de extratos de polifenóis purificados
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)	Mediatech, Inc.	10-014-CV	Cultura de VSMCs
Etanol (grau absoluto de biologia molecular)	Sigma-Aldrich, Inc.	E7023-500ML	Preparação de extratos de polifenóis
Etilacetato	Sigma-Aldrich, Inc.	439169	Preparação de extratos de polifenóis purificados
ERK1/2	Cell Signaling Technology, Inc.	9102S	Anticorpo primário (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8,0	Teknova, Inc.	E0306	Tampão de lise
liofilizador	Labconco	VirTis Benchtop K	Preparação de extratos de polifenóis
Soro bovino fetal (FBS)	Seradigm	1400-500	Cultura celular
HEPES	Sigma-Aldrich, Inc.	H3375	Tampão de lise
NaCl	EMD Millipore, Inc.	7760	Tampão de lise
NaF	J.T.Baker, Inc.	3688-01	Tampão de lise
Na3VO4	Sigma-Aldrich, Inc.	450243	Tampão de lise
Na4P2O7 , decahidratado	Sigma-Aldrich, Inc.	S-9515	Tampão de lise
fosfofo ERK1/2	Tecnologia de Sinalização Celular, Inc.	9101S	Anticorpo primário (1:1000)
Coquetel inibidor de protease	Sigma-Aldrich, Inc.	P8340-5ml	Tampão de lise
Reagente de corante de ensaio de proteína	Bio-Rad Laboratories, Inc.	500-0006
Membrana de transferência de PVDF	Thermo Scientific, Inc.	88518	Western blots
Evaporador Rotativo	Buchi Labortechnik	Rotavapor R3000	Preparação de extratos de polifenóis
Água estéril	Mediatech, Inc.	25-055-CV	Preparação de extratos de polifenóis
Sonicator	QSonica, LLC	Q125	Preparação de extratos celulares
SOD2	Enzo Life Sciences, Inc.	ADI-SOD-110-F	Anticorpo primário (1:1000)
Triton-X-100	Sigma-Aldrich, Inc.	X100	Western borrões
Whatman #2 papel de filtro	GE Healthcare, Inc.	28317-241	Preparação de extractos de polifenóis

para medição de concentração de proteínas