Redes neuronais modificadas por micro-tecidos tridimensionais com inspiração anatômica para a reconstrução, modulação e modelagem do sistema nervoso

Summary

Este manuscrito detalha a fabricação de redes neurais manipuladas com micro-tecidos: construções tridimensionais de tamanho micrométrico, constituídas por longos trilhos axonais alinhados que abrangem a (s) população (s) neuronal agregada (s) envolvida (s) em um hidrogel tubular. Esses andaimes vivos podem servir como relés funcionais para reconstruir ou modular circuitos neurais ou como bancas biofidais que imitam a neuroanatomia de matéria cinza-branca.

Abstract

A recuperação funcional raramente ocorre após uma lesão ou degeneração induzida por doença no sistema nervoso central (SNC) devido ao ambiente inibitório e à capacidade limitada de neurogênese. Estamos desenvolvendo uma estratégia para abordar simultaneamente a perda de via neuronal e axonal no SNC danificado. Este manuscrito apresenta o protocolo de fabricação de redes neurais modificadas com micro-tecidos (micro-TENNs), construções implantáveis ​​constituídas por neurônios e traços axonais alinhados que abrangem o lúmen da matriz extracelular (ECM) de um cilindro de hidrogel pré-formado com centenas de microns de diâmetro que podem se estender centimetros em comprimento. Os agregados neuronais são delimitados aos extremos do encasamento tridimensional e são abrangidos por projeções axonais. Os MicroTENNs são unicamente posicionados como uma estratégia para a reconstrução do SNC, emulando aspectos da citoarquitetura de conexão do cérebro e potencialmente fornecendo meios para a substituição da rede. O neuOs agregados ronais podem sinapse com o tecido hospedeiro para formar novos relés funcionais para restaurar e / ou modular circuitos faltantes ou danificados. Essas construções também podem atuar como "andaimes vivos" pró-regenerativos capazes de explorar mecanismos de desenvolvimento para a migração celular e a localização do axonal, fornecendo pistas sinergísticas estruturais e solúveis com base no estado de regeneração. Micro-TENNs são fabricados por vazamento de hidrogel líquido em um molde cilíndrico contendo uma agulha centrada longitudinalmente. Uma vez que o hidrogel tenha gelado, a agulha é removida, deixando uma micro-coluna oca. Uma solução ECM é adicionada ao lúmen para fornecer um ambiente adequado para adesão neuronal e crescimento axonal. Os neurônios dissociados são agregados mecanicamente para semeadura precisa dentro de uma ou ambas as extremidades da micro-coluna. Esta metodologia produz de forma confiável construções em miniatura autônomas com traços axonais de longa projeção que podem recapitular características da neuroanatomia cerebral. Synaptic immIndicadores de cálcio não genéricos e codificados genômicamente sugerem que micro-TENNs possuem ampla distribuição sináptica e atividade elétrica intrínseca. Conseqüentemente, os microTENNs representam uma estratégia promissora para a reconstrução neurocirúrgica direta de caminhos cerebrais e também podem ser aplicados como modelos biofidelicos para estudar fenômenos neurobiológicos in vitro .

Introduction

Uma característica comum de distúrbios e doenças do sistema nervoso central (SNC), como lesão cerebral traumática (TCE), lesão da medula espinhal (AVC), acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer e doença de Parkinson é a desconexão das vias axonais e células neuronais Perda ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Por exemplo, quando um acidente vascular cerebral isquêmico não é tratado, estima-se que os axônios sejam perdidos a uma taxa de 7 milhas de axônios por minuto

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais na Universidade da Pensilvânia e no Centro Médico de Assuntos de Veteranos de Michael J. Crescenz e aderiram às diretrizes estabelecidas na Política do Serviço de Saúde Pública do NIH sobre Cuidados Humanos e Uso do Laboratório Animais (2015).

1. Desenvolvimento do hidrogel de agarose (componente acelular dos micro-TENNs)

1. Preparação da solução de agarose
   1. Dentro de um gabinete de biossegurança, prepare reservatórios para as micro colunas transferindo 20 mL de solução salina tamponada com f....

Results

Micro-TENNs foram monitorados usando microscopia de contraste de fase para avaliar sua citoarquitetura e crescimento axonal ( Figura 4 ). Dentro dos micro-TENNs unidireccionais de 2 mm de comprimento, os agregados neuronais estavam restritos a uma extremidade da micro-coluna e projetaram um feixe de axônios através do núcleo interno. Os axões abrangiam todo o comprimento da coluna por 5 dias in vitro (DIV) ( Figura 4A ). Houve uma maior taxa de .......

Discussion

A lesão e a doença do SNC geralmente resultam na perda ou disfunção das vias axonais de longa distância que compõem o conector do cérebro, com ou sem degeneração neuronal concomitante. Isso é agravado pela capacidade limitada do SNC para promover neurogênese e regeneração. Apesar da busca de estratégias de reparo, como o fator de crescimento, a célula e a entrega do biomaterial como abordagens individuais ou combinatoriais, essas técnicas não respondem simultaneamente tanto à degeneração das células neuronais quanto à p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
universais	PLS4.75	do laser do cortador do laser	Usado para fabricar o molde do micro-canal do laser-cortado.
Dispositivo de fabricação de micro-coluna cortado a laser	Feito sob medida	--------------	Entre em contato com nosso grupo de pesquisa se estiver interessado. Dimensões e plantas fornecidas no manuscrito.
Parafusos	--------------	--------------	#4-40 com diâmetro de rosca de 3,05 mm
Porcas	--------------	--------------	#4-40 com diâmetro de rosca de 3,05 mm Agulha de
acupuntura (180 µ m diâmetro)	Lhasa Medical	sj.16X40	O diâmetro pode variar de acordo com o tamanho desejado para o lúmen da micro-coluna.
Placa de Petri	Fisher	08772B
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)	Invitrogen	14200075
Poliestireno pipeta sorológica descartável	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Tubo capilar (398 µ m diâmetro)	Fisher	21170D	O diâmetro pode variar de acordo com o tamanho desejado para o invólucro da microcoluna.
Placa quente	Fisher	SP88857200
Barra magnética	Fisher	1451352
Micropipeta	Sigma	Z683884-1EA
Agulha de calibre 25 mm	Microbisturi Fisher	14-826-49
	Roboz Surgical	RS-6270
Tesoura	Ciências Finas	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Esterilizador de esferas quentes	Sigma	Z378550-1EA
Estereoscópio	Nikon	SMZ800N	Usado para todas as etapas de dissecação e para fabricação de micro-TENN.
Cauda de rato tipo I colágeno	Corning	354236	Manter em 4 º C e remova somente quando necessário.  Use gelo para preservar sua temperatura quando estiver em uso.
Tubo de microcentrífuga	Fisher	02-681-256
Mouse laminin	Corning	354232	Manter em 4 º C e remova somente quando necessário.  Use gelo para preservar sua temperatura quando estiver em uso.
Meio neurobasal	Invitrogen	21103049	meio basal para a cultura de células neuronais pré-natais e embrionárias. Loja em 4º C e quente a 37 º C antes de usar.
Hidróxido de sódio (NaOH)	Fisher	SS2661
Ácido clorídrico (HCl)	Fisher	SA48-1
Papel de tornassol	Fisher	09-876-18
Solução salina balanceada de Hank (HBSS)	Invitrogen	14170112	Armazenar a 4 °C.
0,25% Trypsin-EDTA	Invitrogen 25200056		Store a -20 º C e quente a 37 º C antes de usar.
Desoxirribonuclease pancreática bovina (DNase) I	Sigma	10104159001	Store a -20 º C e quente a 37 º C antes de usar.
Suplemento B-27	Invitrogen	12587010	Suplemento adicionado ao meio neurobasal para a cultura de neurônios hipocampais e corticais. Armazene em -20 º C e quente a 37 º C antes de usar.
L-glutamina	Invitrogen	35050061	Store em -20 º C e quente a 37 º C antes de usar.
Sprague Dawley dia embrionário 18 ratos	Charles River	Strain 001
Pipeta Pasteur	Fisher	22-042816
Tubo de centrífuga de 15 mL	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrífuga	Fisher	05-413-115
Hemocitômetro	Fisher	02-671-6
Impressora 3D Objet30	Stratasys	--------------	Usado para fabricar os moldes piramidais de micropoços.
Molde de poço piramidal impresso em 3D	Feito sob medida	--------------	entre em contato com nosso grupo de pesquisa se estiver interessado. Dimensões e plantas fornecidas no manuscrito.
Polidimetilsiloxano (PDMS) e agente de cura	Fisher	NC9285739	Vem como kit com elastômero e agente de cura. Use dentro de uma capela de exaustão química.
Funil	Fisher	10-348C
Bulbo de pipeta de 1 ml	Sigma	Z509035
Microespátula	Fisher	S50821
Placa de cultura de 12 poços	EMESCO	1194-353043
Forno	Fisher	11-475-154
Incubadora	Fisher	13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Armazene a -80ºC. Vírus adeno-associado (AAV) disponível comercialmente com o indicador de cálcio GCaMP6f.
Formaldeído 40%	Fisher	F77P-4	O formaldeído é um composto tóxico conhecido por ser cancerígeno e deve ser descartado em um recipiente separado.
Triton X-100	Sigma	T8787	Surfactante não iônico usado para permeabilizar membranas celulares.
Soro de cavalo	Gibco	16050-122
Camundongo anti-Tuj-1 / beta-III tubulina anticorpo primário	Sigma	T8578-200UL	Armazenar em -20ºC.
Anticorpo primário anti-sinapsina 1 de coelho	Sistemas sinápticos	106-001	Armazenar a -20ºC.
Anticorpo secundário anti-rato 568 burro	Invitrogen	A10037	Loja em 4ºC.
Anticorpo secundário anti-coelho 488 de burro	Invitrogen	A21206	Armazenar em 4ºC.
Hoechst 33342, Tricloridrato	Invitrogen	H3570	Loja em 4ºC.  Hoechst é um mutagênico conhecido que deve ser tratado como cancerígeno. Portanto, deve ser descartado em um recipiente separado.
Microscópio Confocal de Varredura a Laser A1RSI	Nikon	--------------	Usado para fazer as reconstruções confocais de construções imunomarcadas.
Microscópio Eclipse Ti-S	Nikon	--------------	Usado para tirar as imagens de contraste de fase.  Com aquisição de imagem digital usando uma câmera QiClick com interface com o software Nikon Elements Basic Research (4.10.01).
Microscópio de fluorescência de alta velocidade Microscópio	Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti emparelhado com uma câmera ANDOR Neo/Zyla para imagens de cálcio.
Software NIS Elements AR 4.50.00	Nikon Instruments	--------------	Usado para identificar transientes de cálcio a partir das gravações feitas com o microscópio de fluorescência de alta velocidade.