Artigo de método

Um multi-furo criotubo Elimina congelação Artifacts quando tecidos musculares são directamente Imerso em azoto líquido

11.3K vistas

⸱

DOI:

10.3791/55616

⸱

6 de abril de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology, Jiangxi Agricultural University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um processo para congelar os tecidos musculares, mergulhando-os directamente em azoto líquido. Este protocolo também realça um novo frasco de congelação que pode evitar o "efeito manta" de gás de azoto quando os contactos de azoto líquido da superfície do tecido de um espécime.

Resumo

Estudos sobre a fisiologia do músculo esquelético enfrentar o desafio técnico de processar adequadamente as amostras para obtenção de cortes com compartimentos citoplasmáticos claramente visíveis. Outro obstáculo é a aposição apertada de miofibras para os tecidos circundantes. Uma vez que o processo de fixação do tecido e parafina leva ao encolhimento das fibras musculares, congelamento é um meio óptimas de endurecimento tecido muscular para seccionamento. No entanto, um problema vulgarmente encontrado, a formação de cristais de gelo, ocorre durante a preparação de secções congeladas por causa do elevado teor de água de músculo. O protocolo aqui apresentado descreve um primeiro método simples e eficiente para a congelação de tecidos musculares adequadamente por imersão em azoto líquido. O problema com o uso de azoto líquido sozinho é que ele provoca a formação de uma barreira de gás de azoto ao lado do tecido, que actua como um isolador e inibe o arrefecimento dos tecidos. Para evitar este efeito "cobertor de vapor", a new criotubo foi concebido para aumentar a velocidade do fluxo de líquido em torno da superfície do tecido. Isto foi conseguido por perfuração de um total de 14 orifícios de entrada na parede do frasco. De acordo com a dinâmica de bolha, uma taxa mais elevada de resultados de escoamento de líquido em bolhas mais pequenas e menos possibilidades de formar uma barreira ao gás. Quando azoto líquido flui para dentro do frasco de congelação através dos orifícios de entrada de ar, a velocidade do fluxo em torno do tecido é suficientemente rápido para eliminar a barreira de gás. Em comparação com o método de congelação dos tecidos musculares usando isopentano pré-arrefecido, este protocolo é mais simples e mais eficiente e pode ser usada para congelar músculo de um modo de transferência. Além disso, este método é ideal para instituições que não têm acesso a isopentano, que é extremamente inflamável à temperatura ambiente.

Introdução

O músculo esquelético é o componente mais valioso de um animal produtor de carne a partir do ponto de vista nutricional e processamento. Na indústria da carne, há dois aspectos especialmente críticos: a eficiência de crescimento muscular e a qualidade da carne resultante. Como um componente principal do músculo, as fibras musculares estão directamente relacionadas com o desempenho do crescimento e qualidade da carne fresca em animais 1. Por exemplo, o número total de fibras (TNF) e a área da secção transversal das fibras (CSAF) principalmente determinar a massa muscular e a qualidade da carne; Também, Tipo de fibra Composição (FTC) afeta fortemente a qualidade da carne fresca 2. Portanto, a manipulação de características da fibra muscular em animais é um método altamente eficaz para aumentar a rentabilidade do núcleo e da competitividade de quintas 1.

Até à data, vários factores intrínsecos e extrínsecos têm sido identificados para manipular characterist fibra muscularics 1. Esta manipulação pode ser obtida através da escolha adequada dos animais com genes específicos, tais como o gene da miostatina em gado 3, o gene Callipyge em ovelhas 4, e o RYR1 e genes IGF2 em porcos 5. Além disso, o controle da dieta e tratamentos com hormônios específicos desempenham um papel importante em características da fibra muscular 6. Assim, uma abordagem que combina fatores genéticos e nutricionais pode ser capaz de melhorar o teor de carne magra e qualidade da carne. No entanto, os estudos sobre fibras musculares estão limitados na indústria da carne, porque a elucidação da estrutura de fibras musculares é ainda um desafio.

propriedades da fibra muscular são identificados utilizando métodos histoquímicos, tais como o ensaio de miosina adenosina trifosfatase (ATPase). Este método baseia-se no facto de enzimas localizadas em secções finas (6-8? M) congelados defibras musculares pode ser feito reagir quimicamente com determinados produtos. No entanto, o teor de água de músculos é maior do que 75% em porcos, coelhos, ratos e seres humanos, independentemente da posição (isto é, costas, abdómen, ou dos membros posteriores) 7. Tal teor de humidade elevado em músculos provoca um problema vulgarmente encontrado - congelação artefactos - durante a preparação dos criocortes, como anteriormente descrito 8, 9. Na maioria dos casos, é quase impossível para congelar adequadamente tecidos musculares em uma linha de produção matadouro, de acordo com a nossa experiência.

O protocolo aqui apresentado descreve um método simples e eficiente utilizado no nosso laboratório para congelar tecidos musculares para cryosectioning de um modo de elevado rendimento. O destaque do presente método é um novo frasco de congelação que é concebido para tecidos musculares de flash-congelação em azoto líquido. O fluxo de trabalho de corrente pode simultaneamente facilitar tecidoscongelamento e processamento para uma excelente criocorte muscular, com um compartimento citoplasmático claramente visível e a aposição apertada de miofibras para o tecido circundante. Além disso, este protocolo pode ser aplicado a uma grande variedade de opções para a análise de tecido por causa de azoto líquido não se mistura com os tecidos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

O método atual foi estabelecido e validado para colher e armazenar mais de 1.000 amostras de músculo para a coloração histológica em nosso laboratório. Todos os procedimentos envolvendo cuidados com os animais e uso seguiu as diretrizes estabelecidas pelo Ministério da Agricultura da China.

1. Equipamentos para Coleta de Amostras

  1. Rotular a identidade da amostra em cada frasco criogénico.
    Nota: O criotubo foi especialmente concebido para congelar amostras de tecido fresco para o procedimento criocorte (Figura 1A). Os frascos para injectáveis são feitas de polipropileno numa fábrica de molde (Figura 1C).
  2. Obter o seguinte equipamento: azoto líquido em um tanque de azoto líquido apropriado, óculos de segurança ou uma viseira, luvas congeladores, 10 cm fórceps, 25 pinças cm, uma caixa de isopor (dimensões internas: 20 cm de comprimento x 12 cm de largura x 13,5 cm de altura ; dimensões externas: 24 cm de comprimento x 16 cm de largura x 15 cm de altura), película de plástico (2,5 cm de comprimento x 0,8 cm de largura x 0,1 mm de espessura),um bisturi, e as tampas de ligação A4 PVC (21 cm x 29,5 centímetros) (Figura 1B).

2. Preparação de amostras de músculo

  1. Encher a caixa de isopor com azoto líquido 5 min antes da recolha da amostra.
    NOTA: O grande coluna de azoto líquido é essencial porque parte do azoto líquido evapora e se transforma em gás quando amostras frescas tocá-lo. A fim de reduzir a frequência de transferência de azoto líquido para repor a perda, uma caixa de isopor dimensionado apropriadamente deve ser adquirida antecipadamente de acordo com o número de amostras.
  2. Uma vez que uma amostra é obtida, gentilmente colocá-lo sobre uma peça de cobertura de ligação A4 PVC e observar o sentido das fibras musculares.
    NOTA: Aqui, usamos o corte transversal do músculo longissimus doris da primeira para a última vértebra lombar em porcos. Os espécimes são cerca de 12 cm de comprimento, 8 cm de largura e 5 cm de altura.
  3. Use um bisturi para fazer duas incisões paralelas através do i espécimen a direcção das fibras musculares, aproximadamente 3 cm de comprimento e 0,6 cm de distância. Aparar a incisão do músculo num rectângulo de aproximadamente 0,6 cm de largura x 0,6 cm de altura x 1,5 cm de comprimento.
    NOTA: A fiabilidade da medição da área da secção transversal das fibras musculares depende principalmente da orientação das fibras do músculo incisa.
  4. Usar 10 cm fórceps para colocar suavemente a amostra sobre uma peça de película de plástico, com o eixo longitudinal do músculo paralelo incisão ao longo do bordo do filme (Figura 2A).
    NOTA: O filme plástico tem duas funções: uma função de exploração, que ajuda na fixação da orientação das fibras musculares e uma função de adesão que impede fissuras na amostra devido a congelação rápida.
  5. Usando fórceps, colocar o tecido muscular em parte inferior central de um criotubo marcado, apenas entre os orifícios de entrada de ar, e, em seguida, tapar bem o frasco (Figura 2B).

3. Congelamento e Armazenamento de amostra de músculos

  1. Usando pinças 25 cm, rapidamente submergir todo o frasco criogénico em azoto líquido na caixa de isopor pré-arrefecida, espera até que o azoto líquido não ferva (aproximadamente 10-20 s).
    NOTA: O criotubo irá flutuar quando o azoto líquido está em ebulição, então cuidadosamente imergir o frasco em azoto líquido em ebulição durante 10-20 s.
  2. Transferir as amostras de músculo a um tanque de armazenamento de azoto líquido ou uma -80 ° C congelador para armazenamento a longo prazo.

4. Preparação corrediça

  1. Precool um criostato a entre -20 ° C e -22 ° C.
  2. Remover e descartar o velho lâmina micrótomo, limpar o suporte da faca e a placa de anti-rolo no criostato, instalar uma nova lâmina micrótomo no criostato, e definir a espessura de corte de 8? M.
  3. Transfira a amostra muscular no frasco criogico a partir do tanque de armazenamento de azoto líquido ou a -80 ° C para o congelador criostato, transportando-o em azoto líquido ou em gelo seco.
  4. Esperar 30 min para o espécime para equilibrar com a temperatura do criostato.
    NOTA: Qualquer equipamento que possa tocar o espécime tem de ser pré-arrefecido, porque uma temperatura elevada pode provocar a formação de cristais de gelo na amostra.
  5. Montar a amostra no suporte da amostra, sob a formulação temperatura de corte óptima de glicóis e resinas solúveis em água (PTU). Cortar as secções 8 mícrons.
    NOTA: Ajustar o ângulo de corte de forma perpendicular à orientação das fibras musculares, porque o CSAF é a área da secção transversal das fibras musculares.
  6. Montar as secções em direcção ao centro de uma microlâmina à temperatura ambiente. colocar imediatamente a deslizar para uma caixa de corrediça numa -80 ° C congelador. Não permita que o slide para secar em temperatura ambiente.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A ilustração criotubo e o equipamento laboratorial comum para a congelação de músculos durante a preparação de secções congeladas são mostrados na Figura 1. Os criotubos são feitos de polipropileno num molde fábrica. Cada frasco tem um total de 14 orifícios de entrada: um está no tampão; outra está na parte inferior; e os restantes 12 formam quatro linhas paralelas, cada uma com quatro orifícios a 90 ° um do outro. Estes orifícios de entrada de ar pode acelerar a velocid...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Aqui, descrevemos um novo, cryovial multi-buraco para congelar e armazenar os tecidos musculares para realizar avaliações histológicas da função muscular. O passo crítico modificado neste protocolo é que a amostra no criotubo multi-furo é directamente imerso em azoto líquido. Para o nosso conhecimento, esta é a maneira mais simples e rapidest obter excelentes amostras congeladas para cryosectioning muscular entre os métodos de congelação existentes (ver os resultados representativos).

O desa...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Não há conflitos de interesse, financeiro ou outro, são declarados pelos autores.

Agradecimentos

Este projecto foi apoiado pela National Science Foundation Natural da China (NSFC): 31301950 e 31671288.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Criostato Microtome  MicroscópioLeica Leica CM1950
NikonNikon DS-U3
  Frasco Criogênico    FilmeProjetado por nós mesmos
Nitrogênio líquido
BisturiComumente usado
10 cm FórcepsPinça de
25 cmpor
de segurançausado por câmera comandiana
Comumente usado
Digital plástico usado Usado mim mesmo Luvas de freezer usadas por mim mesmo Vidro

Referências

  1. Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
  2. Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
  3. Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
  4. Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
  5. Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
  6. Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
  7. Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
  8. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  9. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793(2015).
  10. Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
  11. Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
  12. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
  13. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , Elsevier. (2008).
  14. Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
  15. Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
  16. Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Congelamento com Nitrog nio L quidoPrepara o de Tecido MuscularElimina o da Barreira de VaporSeccionamento de TecidosSeccionamento em CriostatoAn lise da Atividade da ATPaseAlternativa ao IsopentanoFisiologia do M sculo Esquel ticoProtocolo de Congelamento de Tecidos

Artigos relacionados