Técnica laparoscópica para a coleção de série do fígado e mesentérica linfonodos em macacos

Resumo

Aqui, descrevemos uma técnica laparoscópica minimamente invasiva para a amostragem de série do fígado e linfonodos mesentéricos (MLN) em macacos que permite o aumento da frequência de amostragem, e reduz o potencial de complicações cirúrgicas quando comparada a realização de uma laparotomia.

Resumo

Os linfonodos mesentéricos (MLN) e o fígado são expostos aos micróbios e produtos microbianos a partir do tracto gastrointestinal (GI), tornando-os imunologicamente única. O tracto GI e MLN associado são sítios de replicação viral no início da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o MLN são prováveis ​​locais de reservatórios importantes que abrigam células latentemente infectados, mesmo depois de a terapia anti-retroviral prolongada (ART). O fígado foi mostrado para desempenhar um papel significativo nas respostas imunes de lentivírus e parece desempenhar um papel significativo na depuração do vírus de circulação. primata não humano (NHP) modelos para o HIV e Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA) imitam de perto estes aspectos da infecção por HIV e de amostragem longitudinal série de sítios primários de replicação viral e as respostas imunológicas associadas a este modelo ajudará a elucidar acontecimentos críticos na infecção, patogênese e o impacto de várias estratégias de intervenção sobre estes eventos. Currtécnicas ent publicada a amostra de fígado e MLN juntos envolvem grande cirurgia e / ou necropsia, o que limita a capacidade de investigar estes locais mais importantes de uma forma de série, no mesmo animal. Nós já descreveu uma técnica laparoscópica para coleção de MLN. Aqui, nós descrevemos uma técnica minimamente invasiva laparoscópica para amostragem de série longitudinal de fígado e MLN através dos mesmos dois locais de porta necessários para a recolha de MLN. O uso das mesmas duas portas minimiza o impacto para os animais como não há necessidade de incisões adicionais. Esta técnica pode ser utilizada com o aumento da frequência de amostragem comparada com a grande cirurgia abdominal e reduz o potencial para complicações cirúrgicas e associado respostas inflamatórias locais e sistémicas que poderia complicar a interpretação dos resultados. Este procedimento tem o potencial para facilitar estudos envolvendo modelos NHP, melhorando o bem-estar animal.

Introdução

O tracto gastrintestinal (GI) é a maior superfície da mucosa do corpo e é exposto a uma variedade de antigénios derivados de agentes patogénicos, e comunidades bacterianas endossimbióticas vulgarmente referido como o microbiome ^{1, 2.} Os nódulos linfáticos mesentéricos (MLN) alinham o tracto GI e são um sítio principal da função imunitária para promoção de respostas inflamatórias ou tolerogénicos para estes antigénios diferentes. A organização física do MLN cria um sistema compartimentado que possa responder aos antígenos localmente sem obter respostas sistêmicas ^3. Da mesma forma, o sangue dos drenos do tracto GI para o fígado através da veia porta antes de voltar para a circulação, e é, portanto, expostas a micróbios e produtos microbianos que translocados a partir do tracto GI para a lâmina própria e entrou na corrente sanguínea ^4. O fígado funciona também como um órgão linfóide secundário umND tem um grande número de células do sistema imunológico, incluindo macrófagos especializados, para remover micróbios translocados ^{5, 6.} Assim, a MLN e o fígado são os órgãos imunes primárias expostas a comensais e patogénicos bactérias do trato GI, bem como o meio de antigénios a partir de outras fontes, o que os torna única e importante do ponto de vista imunológico.

O MLN são locais críticos para a avaliação dos efeitos virológicos e imunológicos de vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou infecção patogénica do vírus da imunodeficiência símia (SIV), e estão provavelmente envolvidos na disseminação precoce de SIV seguinte desafio intra-rectal. Tecido linfóide associado aos intestinos é conhecido por ser um dos principais locais da replicação do HIV persistente, apesar do controlo eficaz da viremia por terapias anti-retrovirais modernos (ART) ^7. Em modelos de infecção com SIV, MLN foram mostrados para ser reservatórios importantes de vírus latente e podeser o principal reservatório ^{8, 9.} O fígado é também importante na infecção de lentivírus, como é evidenciado pela acumulação de células T CD8 ⁺ específicas de SIV nos fígados de macacos durante a infecção por VIS aguda ^10. Além disso, é o principal órgão responsável por limpar o vírus de circulação ^11.

HIV e infecção por SIV são associados com microbiota GI alterada, interrompida a integridade do epitélio GI, e aumentou a translocação de micróbios e produtos microbianos a partir do cólon para a periferia e circulação ^{12, 13.} Estes processos estão associados com a activação imunitária local e sistémica, e o aumento da morbidade e mortalidade em indivíduos infectados pelo HIV ^14. Na infecção por SIV, bactérias translocados foram observados no MLN ^15, enquanto que a acumulação de microfoneprodutos robial no fígado foi mostrado resultar em inflamação e danos no órgão ^16. Assim, no contexto do HIV e infecções SIV, a MLN e no fígado pode ser altamente informativa para a compreensão dos processos inflamatórios accionados por bactérias GI-residente.

Aqui, nós apresentamos uma técnica minimamente invasiva laparoscópica para amostragem em série da MLN e fígado em primatas não humanos (PNH). Nós demonstramos desempenho bem sucedido desta técnica em dois macacos rhesus fêmea saudáveis ​​(valor eficaz), amostragem cada animal duas vezes, com 160 dias entre cada cirurgia. Nós continuamos a usar estas amostras para avaliar e comparar as principais populações de leucócitos e linfócitos no interior de cada órgão utilizando citometria de fluxo, e demonstram dados altamente consistentes entre os dois pontos de tempo.

Protocolo

Os animais foram alojados e tratados na Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care Internacional (AAALACi) instalações credenciados, e todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Washington e Washington National Primate Research Center.

1. Preparação cirúrgica, Anestesia and Analgesia

1. Sedação e Indução
   1. Sedar o Macaque com uma injecção intramuscular de 10 mg / kg de cetamina e 0,015 mg / kg de dexmedetomidina (combinados em uma seringa). Assegurar a ausência de reflexos de retirada antes da remoção da gaiola.
   2. Entubar o animal, e manter o animal num plano de anestesia geral, utilizando isoflurano (1,0-2,5%) e 100% de oxigénio. Ver referências para mais informações sobre intubação e anestesia geral em macacos ^17,ref "> ^{18, 19.}
2. Suporte Anestesia e Monitoramento
   1. Inserir um cateter venoso periférico e fornecer fluidos intravenosos isotónicos (tais como lactato de Ringers Solution) a uma taxa de 5 mL / kg / h ao longo de anestesia e cirurgia. Aplicar lubrificante ocular esterilizada para evitar a secura da córnea.
   2. Proporcionar analgesia, tais como uma formulação de libertação sustentada de buprenorfina (0,2 mg / kg, por via subcutânea).
      NOTA: um NSAID (tais como meloxicam ou cetoprofeno) pode também ser fornecido durante a recuperação da anestesia, desde que o protocolo experimental permite a administração de NSAID e esse animal é normotensos e bem-hidratado durante a anestesia.
   3. Monitorizar a profundidade de anestesia (ex tom mandíbula), o ritmo cardíaco, o ritmo respiratório, ECG, pressão sanguínea, a oxigenação de pulso, corrente final de CO _2, e a temperatura do corpo durante todo anestesia e cirurgia.
      NOTA: Quando o abdômen é insuflado, o animal pode hipoventilar.Fornecer ventilação mecânica, se diminui a taxa de respiração, ou as extremidades das marés níveis _{de CO2} está acima de 45 mmHg.
   4. No seguimento da cirurgia, administrar atipamezol (0,15 mg / kg, por via intramuscular) para a inversão da dexmedetomidina.
3. Preparação cirúrgica
   1. Executar múltiplos enemas de água quente para reduzir o volume de fezes no cólon para auxiliar a visualização e manipulação intestinal durante o procedimento de ^20.
   2. Use tesouras com uma lâmina de número 40 para remover os pêlos do campo cirúrgico. Shave do cume costal ao púbis e da esquerda para o flanco direito.
   3. Assepticamente preparar o campo cirúrgico utilizando anti-sépticos adequados, como alternando clorexidina e álcool ou iodopovidona de álcool esfrega.
   4. Coloque o animal na mesa de operação em seu dorso, em uma metade ângulo entre dorsal e decúbito lateral direito. Amarrar os braços e as pernas com uma corda numa posição estendida. Fornecer um chlorhexi definitivajantar e de preparação de álcool, uma vez que o animal se desloca para a sala de operações e está posicionado para cirurgia.

2. Cirurgia

Nota: Para mais informações de laparoscopia em pequenos animais, ver referência ^21.

1. Preparação Instrumento laparoscópico
   1. Armar o animal com uma cortina fenestrado estéril.
   2. Com a ajuda de um assistente não estéreis, embrulhe a câmera digital com a cortina câmera estéril e conecte o cabo à torre. Anexar o alcance rígida para a cabeça da câmera.
   3. Anexar o cabo de luz estéril para o âmbito rígida e ligar o cabo à fonte de luz. Branco equilibrar a câmera de acordo com as instruções do fabricante.
   4. Conectar o tubo insuflador estéril para o insuflador.
2. laparoscópica Entry
   1. Usando um # 15 bisturi, fazer um 5 milímetros incisão ~ através da pele para a profundidade da musculatura abdominal, approximately 1 - 2 cm à esquerda do umbigo.
   2. Usando a mão não-dominante, levante a craniana parede abdominal para o local da incisão. Com a mão dominante, colocar a ponta da agulha de Veress através da incisão e o ângulo de ponta cranialmente.
      NOTA: O ângulo de penetração da agulha de Veress irá variar com base na condição do corpo do animal. Por exemplo, em uma gordura animal, terão de ser introduzidas quase perpendicular à parede abdominal da agulha de Veress. Em um animal fina, a agulha de Veress deve ser inclinado cranialmente para reduzir o risco de entrar em contato com as vísceras.
      1. Segurando o eixo (não o concentrador) da agulha de Veress, firmemente empurrar a agulha para penetrar a parede abdominal para dentro da cavidade abdominal. Um distinto "clique" e diminuição da resistência será sentida como a ponta aguçada penetra o peritoneu e a ponta romba das molas agulha de Veress para a frente para dentro da cavidade abdominal.
         NOTA: Se a agulha passa apropriadamente em the cavidade abdominal, haverá pouca resistência, quando é avançado e retirado 1 - 2 cm.
   3. Ligar a tubagem insuflador de CO ₂ para a agulha e abrir a torneira de segurança. Pressurizar o abdômen para não mais do que 10-12 mmHg para criar um pneumoperitônio.
      NOTA: O abdômen alcançou insuflação ideal quando se expandiu de forma simétrica e há uma perda do contorno nítido normal das margens costais. A pressão deve proporcionar um espaço adequado para a inserção da cânula / trocarte sem risco de entrar em contato com as vísceras.
3. Colocação cânula
   1. Uma vez que o abdômen é totalmente insuflado, fazer uma ~ 5 - mm incisão 7 com uma lâmina de bisturi nº 15 através da pele do abdome cranial esquerda para a musculatura abdominal ~ 2 - 4 cm caudal à última costela.
   2. Coloque um mecanismo de trocarte-cânula de 5mm através da incisão na pele e o ângulo de TI ~ 45 - 60 graus caudomedially. Penetrar na cavidade abdominal, a uma profundidade de 1-2 cm. screw a cânula roscado no abdómen através da rotação da cânula (~ 0,5 - 1 centímetro mais) a uma profundidade de 1,5 - 3 cm, e remover o trocarte.
   3. Remover o tubo insuflador a partir da agulha de Veress, desligar a torneira de passagem, e remover a agulha. Ligar a tubagem insuflador para a cânula e abrir a torneira para manter um pneumoperitoneu em não mais do que 10 - 12 mmHg.
   4. Inserir o âmbito rígida através da cânula e para dentro da cavidade abdominal.
   5. Sob visualização câmara, continuar a fazer uma pequena incisão com uma lâmina de bisturi # 15 através da musculatura abdominal e o peritoneu na incisão na pele anteriormente utilizado para a inserção da agulha de Veress. A câmara é utilizada para visualizar o lado abdominal da incisão para evitar vasos e minimizar o sangramento.
      NOTA: Garantir a incisão através do músculo e do peritoneu é suficientemente grande para facilitar a entrada da sonda e exteriorização do mesentério (~ 0,5 cm). Uma incisão maior pode ser necessária para exteriorizar mesentery em animais com gordura mesentérica excessiva.
   6. Colocar o animal na posição de Trendelenburg ²¹ com os pés elevados em cerca de 15 - 30 graus acima da cabeça. Isto é opcional, mas pode permitir um acesso mais fácil para os nódulos linfáticos mesentéricos do cólon, tal como o tracto intestinal pequena irá mover-se para uma posição mais craniana.
4. Mesentérica biópsia de linfonodo
   1. Sob visualização câmara, inserir uma sonda sólida através da incisão abdominal feita no passo 2.3.5.
   2. Coloque a sonda entre o omento e intestino e usar um movimento de varredura para varrer suavemente o omento fora do intestino para permitir a visualização do mesentério subjacente. Continuar a usar o movimento de varredura do caudal ao abdómen craniano. O omento pode ser colocado no abdómen craniana direita, de modo que está fora do campo operatório.
   3. Use a sonda para mover o cólon descendente em direção à parede abdominal esquerda ou direita. Isto irá permitir uma melhor visualização de tele mesentério para ajudar na busca de nódulos linfáticos mesentéricos.
   4. Usar a sonda para varrer o mesentério para localizar os nódulos linfáticos mesentéricos ao longo dos vasos do cólon e mesentéricas.
      NOTA: Os nós do cólon correm ao longo da fronteira mesentérica do cólon, nós cólica esquerda pode ser encontrado perto os pontos de ramificação dos vasos, e os nós mesentérica inferior podem ser encontrados ao longo dos vasos mesentéricos inferiores. linfonodos mesentéricos são facilmente visíveis em animais magros. Quando enterrados na gordura mesentérica muitas vezes eles vão dar uma ligeiramente levantada, brilhando aparência para o mesentério sobrejacente e pode ser mais um bronzeado cor mais acinzentada, em seguida, em torno de gordura mesentérica. Além disso, os nódulos linfáticos mesentéricos tendem a assentar ao longo linfáticos e da vascularização mesentérica.
   5. Uma vez que um nó de linfa é identificado, remover a sonda e inserir os fórceps Maryland ratcheted para dentro da cavidade abdominal. Utilizar as pinças para agarrar o mesentério adjacente ao nó de destino. Puxe o mesentério para a incision, e remover o âmbito da cânula.
   6. Desligue o insuflador e deixar a torneira aberta cânula para despressurizar o abdome para facilitar a exteriorização do mesentério. Puxar o mesentério do lado de fora do corpo através da incisão. Uma vez exteriorizados, agarrar o mesentério com pinças hemostáticas mosquito curvos ou fórceps polegar para assegurar o acesso através da incisão.
   7. Identificar o nó (s) de linfa dentro do mesentério exteriorizada por palpação para o nódulo linfático mais firme e / ou visualização directa da cor mais cinzenta ou aparência nodular do nódulo linfático.
      1. Uma vez identificados, fazer uma pequena abertura (~ 3-5 mm) no mesentério perto do nó usando pinças hemostáticas curvos. anexos gratuitos para o mesentério utilizando dissecção romba com as hemostats curvas. Ligadura a vasculatura com 4-0 não absorvíveis sutura monofilamento como necessário. Use dissecção afiada com um bisturi para remover o nódulo linfático. Coloque os nós no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 emgelo.
   8. Examine o mesentério exteriorizada para o sangramento. Se o sangramento é conhecida, proporcionar hemostase adequada por oclusão dos vasos com hemostáticos ou ligaduras (4-0 não-absorvível de suturas de monofilamento), ou por utilização de cauterização. Solte o mesentério e insuflar o abdômen de volta para 10 - 12 mmHg para permitir que o mesentério para retornar para a cavidade abdominal.
   9. Repita os passos 2.4.1 através de 2.4.8 para obter biópsias de linfonodos adicionais.
5. biópsia hepática
   1. Voltar à mesa para uma posição horizontal.
   2. Coloque uma cânula roscado no abdómen através da incisão previamente utilizado para a recolha de linfonodo biópsia (incisão feita no passo 2.3.5). Assegurar a incisão seja suficientemente grande (~ 5-7 mm) para permitir a colocação de uma cânula, sem inserção do trocarte. Inserir o âmbito rígida através desta cânula no sentido da cavidade abdominal craniano e visualizar o abdómen craniano e fígado.
   3. Sob visualização câmara, inserir a biópsia forceps através da cânula previamente colocado no abdómen craniana esquerda (incisão feita no passo 2.3.1).
   4. Para obter biópsias hepáticas, coloque a pinça de biópsia abaixo da margem de lobo hepático selecionada com a parte móvel da mandíbula de frente para o fígado, abrir a pinça, e permitir que a margem a cair nas mandíbulas abertas. Garantir que nenhum omento é entre o fígado e pinça de biópsia. Ajustar a posição da pinça e fechar o instrumento através da região de amostra desejada.
      1. Manter a pressão durante cerca de 20 - 30 s para garantir a hemostase. Com a pinça fechada, remover a amostra puxando suavemente os fórceps-se através da cânula. Isto irá gentilmente rasgar a biópsia do fígado. Coloque biópsias hepáticas em RPMI 1640 no gelo.
         NOTA: O tamanho da biópsia do fígado é, aproximadamente, 5 mm x 2 mm x 2 mm, utilizando 5 mm pinça de biópsia.
   5. Examinar o local da biópsia de hemorragia usando a visualização da câmera. Se a hemorragia é observado, coloque um moistene salinad cotonete esterilizado através da cânula e aplicar pressão no local da biópsia. Alternativamente, embalar os locais de biópsia com espuma de gel estéril para auxiliar a hemostasia.
   6. Repita os passos 2.5.3 através de 2.5.5 para obter biópsias hepáticas adicionais.
      NOTA: Aqui, 3 biópsias por animal por procedimento foram recolhidas, o que é suficiente para todas as análises a jusante.
6. Encerramento cirúrgica
   1. Examinar a cavidade abdominal para a sangria.
      NOTA: Este não ocorreu até o momento. No entanto, se a hemorragia excessiva é anotado, determinar o local da hemorragia e proporcionar hemostase adequada através de pressão com cotonetes de algodão estéril ou o uso de espuma de gel.
   2. Desligue o insuflador e abrir as torneiras cânula. Aplicar pressão manual suave para o abdome para despressurizar totalmente a cavidade peritoneal. Retirar as cânulas.
   3. Fechar cada uma das incisões na parede abdominal com 1 a 2 suturas interrompidas simples por site. 4-0 sutura absorvível é recomendado.
   4. Execute um bloco respingo colocando 0,1-0,3 cc bupivacaína em cada incisão para analgesia local antes do fechamento da pele.
   5. Feche a pele com 1 - 2 suturas interrompidas enterrados (4-0 sutura absorvível é recomendado) por site. cola de tecidos pode ser aplicado.

3. biópsia hepática Processamento e Análise de Linfócitos

1. Armazenar várias peças de tecido hepático (cerca de 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm de tamanho) em tubos de criopreservação, em uma solução de armazenamento de ARN preferido, e 10% de formalina para futuro molecular e análise histológica.
   1. Coloque as biópsias hepáticas remanescentes em 50 ml de meio RPMI 1640 suplementado com 1x penicilina / estreptomicina, 40 ng / mL de uma solução de colagenase disponível comercialmente, e 4 ug / ml de DNAse em um copo de 250 ml estéril de plástico com uma tampa. Agita-se vigorosamente com uma barra de agitação magnética e uma placa de agitação durante 1 h a 37 ° C.
2. Distribuir uniformemente vertendo o tecido digerido. Grind o tecido digerido (a partir do passo 3.1.1) ao longo de dois filtros 70? m se encaixam em dois tubos cónicos de 50 mL a uma suspensão de células individuais utilizando a extremidade de uma seringa de 5 mL estéril. Trazer o volume de ambos os tubos de 50 mL em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1x penicilina / estreptomicina (R10).
3. Centrifugar as células a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Decantar o sobrenadante. Concentram-se as células para um único tubo cónico de 50 ml através da suspensão de células a partir de ambos os tubos em 5 mL R10 e combinando em um tubo de 50 mL cónico. Levar o volume a 50 mL utilizando R10. Contagem de células utilizando um hemocitómetro para determinar o rendimento celular.
   1. Centrifugar as células a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Ressuspender as células em 1 mL de R10, distribuir uniformemente em dois tubos de 5 ml de fundo redondo de poliestireno e trazer o volume de cada tubo a 4 ml com R10, direccionamento para> 500.000 células de cada tubo.
4. Centrifugar as células a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Decantar o supernatant e ressuspender o sedimento de células em 4 ml de tampão fosfato salino (PBS). Centrifugar a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C.
5. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 ul de PBS com vortex suavemente. Adicionar 1,5 mL de uma mancha de células mortas fixável. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
6. Adicionar os seguintes anticorpos de coloração da superfície não diluído em tulos recomendadas pelo fabricante: CD45-PerCP (clone D058-1283), CD3-PE-CF594 (clone SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (clone 2H7), CD4-BV605 ( clone OKT4), CD8-BV570 (clone RPA-T8), e CD14-BV785 (clone M5E2). Incubar a 4 ° C durante 20 min.
7. Adicionar 4 ml de PBS e centrifugar a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células em 250 uL de paraformaldeído a 1% em PBS.
   Cuidado: O paraformaldeído é tóxico. Use equipamento de proteção pessoal apropriado.
8. Analisar as populações de células, utilizando um citómetro de fluxo, tal como descrito na referência ^22.

Resultados

Métodos pormenorizados para processamento de MLN laparoscopicamente recolhidos, bem como os rendimentos celulares, e frequências de leucócitos nestes órgãos foram anteriormente relatadas ^13. A Figura 1 mostra de rendimento celular e viabilidade de dados que comparam a MLN e as biópsias de fígado recolhidas em dois pontos de tempo de 160 dias de intervalo a partir de dois RM femininos saudáveis, utilizando esta técnica laparoscópica. Descobrimos que o rendimento celular de MLN foi significativamente maior do que a partir do fígado (P = 0,0021), com uma média de 33,5 x 10 ⁶ e 6,74 x 10 ⁶ culas obtidas, respectivamente. coloração de células mortas e análise por citometria de fluxo indicou que> 90% das células isoladas a partir de ambos os órgãos foram viáveis.

Utilizando citometria de fluxo, foi avaliada e comparada a abundância de leucócitos e linfócitos no MLN e fígado. Um esquema representativo de intermitcia para o fígado é mostrado na + células, e, finalmente, as células CD3 ^+. A partir da população de células CD3 ^+, avaliou-se a abundância de células T CD4 ⁺ e CD8 ^+, enquanto que avaliada abundâncias de culas CD14 ⁺ e CD20 ⁺ células a partir das populações CD3-. Fluxo representativas citometria de gráficos que mostram CD45 ⁺ e CD3 ⁺ a partir de populações a MLN e fígado de ambos os animais no Dia 0 e Dia 160 são mostrados na Figura 3, enquanto a Figura 4 mostra de leucócitos e de linfócitos abundâncias para as duas amostras de dois animais. O MLN mostrou abundâncias significativamente mais elevados de células CD45 ⁺ do que o fígado (média de 76,9% e 7,66% de células viáveis, respectivamente, P = 0,0002). Não surpreendentemente, o MLN mostrou proporções significativamente mais elevados de células T CD3 ⁺ (P0; 0,0001) e as células T CD4 ⁺ (P = 0,0004). Por outro lado, o fígado foi significativamente enriquecida para CD14 ⁺ leucócitos em comparação com a MLN (P = 0,0036). O MLN mostrou uma média mais elevada de células T CD8 ^+, mas esta não foi significativa. Surpreendentemente, para estes dois animais ambos os órgãos demonstrado abundâncias semelhantes de células B CD20 ^+. Os rendimentos celulares e as abundâncias de diferentes subconjuntos de leucócitos e linfócitos a partir de MLN neste estudo confirmou anteriormente relatados valores ^23.

Figura 1. Rendimento Celular Total (em cima) e Viabilidade celular (inferior) a partir de MLN Serially recolhidos e fígado biópsias. O MLN mostraram rendimentos celulares significativamente mais elevadas do que o fígado. No entanto, ambos os tipos de amostras fornecidos para células amplas análises a jusante. A viabilidade celular, medido pelo fluxo cytometrically usando uma mancha amina célula morta fixável, mostraram que ambos os tipos de amostras, tipicamente produziu> viabilidade celular de 90% após a dissociação de tecidos. As barras de erro representam o desvio padrão entre amostras. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Representante Citometria de Fluxo Estratégia Gating. Em primeiro lugar, foram excluídos células agregadas, seguido por selecção de células viáveis ​​após a coloração única usando uma mancha amina célula morta fixável. Em seguida, foram seleccionados os leucócitos CD45 ^+, seguido de seleco de culas T CD3 ^+. A partir da população de células CD3 ^+, foram analisadas as células T CD4 ⁺ e CD8 ^+. A partir do CD3 ^- população, CD14 ⁺ e CD20 ⁺ células foram analisadas. Thi estratégia de gating s também foi usado para o MLN. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Terrenos Citometria de Fluxo de MLN e fígado de Dois animais longitudinalmente. MLN e as amostras de fígado foram recolhidos 160 dias de intervalo para ambos os animais. (A). MLN CD45 ⁺ células (leucócitos); (B) fígado CD45 ⁺ células (leucócitos); Células ⁺ (células T) (C) ⁺ MLN CD3; (D) Fígado CD3 ⁺ (células T). Para ambos os animais, a MLN mostrou maiores proporções de CD45 ⁺ e CD3 ⁺ células em comparação com o fígado. Ao longo do tempo, as frequências destas populações foi semelhante para ambos os animais.s / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. As frequências de CD45 ⁺ células (esquerda) e várias subpopulações de leucócitos e linfócitos (à direita), em 23 amostragens individuais. Os MLNs exibida significativamente maiores frequências de CD45 ^+, CD3 ^+, e CD4 ^+, enquanto que o fígado mostrou significativamente maiores frequências de leucócitos CD14 ^+, o que demonstra as funções originais de cada órgão. As barras de erro representam o desvio padrão entre amostras. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui, nós demonstramos uma técnica minimamente invasiva para a coleta de série do MLN e biópsias hepáticas que teve uma taxa de sucesso de 100% nesses e em outros animais não descritos neste estudo. Além disso, o uso desta técnica nos mesmos animais através do tempo não tem sido associada com eventos adversos. Com efeito, não houve complicações resultantes da utilização desta técnica em outros grupos de animais que foram infectados com SIV, simian / vírus da imunodeficiência humana (SHIV), ou vírus Zika (dados não publicados). Da mesma forma, esta cirurgia tem sido bem sucedida, mesmo em animais que tinham anteriormente sido submetidos a cirurgia abdominal de grande porte, e em animais trombocitopenia (dados não publicados). Demonstrou-se que estas amostras podem ser recolhidas através das mesmas duas portas através da inversão da localização da câmara quando se muda de MLN de fígado evitando a necessidade de incisões adicionais. Fatores que afetam a coleção de MLN foram anteriormente relatados ^13.

Até quatro coleções de 3 MLN e 3 biópsias hepáticas cada foram realizados através do tempo em animais específicos, sem complicações, mudanças nas taxas de sucesso, ou alterações para os dados coletados. Além disso, esta técnica de recolha / fígado MLN laparoscópica foi combinada com êxito com outros processos, tais como a recolha de LNs periféricas, endoscópicos biópsias do tracto GI superior e inferior, aspirado de medula óssea, a recolha de fluido cerebrospinal, e punção venosa no mesmo evento anestésico permitindo a análise extensiva virológica e respostas imunológicas em série (dados não publicados).

Todo o processo demora tipicamente 30 - 45 min para completar e é realizada através de duas incisões ~ 0,5 cm. Em animais obesos, pode ser necessário fazer uma incisão maior (~ 1-1,5 cm) para recuperar MLN através e pode necessitar de tempo adicional para completar. Animais com extensa gordura mesentérica muitas vezes exigem experiência significativa para differentiate MLN da gordura envolvente. MLN são freqüentemente encontrados ao longo da vasculatura mesentérica e parecem ser mais prevalente perto de pontos de ramificação dos vasos. Um aspecto fundamental desta técnica é que ele exige a MLN seleccionado para ter mobilidade suficiente no mesentério para ser exteriorizado através da incisão abdominal. Como resultado, esta técnica não pode ser utilizada para recolher MLN perto da raiz do mesentério. Devido à ampliação, às vezes é mais fácil identificar MLN com a câmera, e agarrando em estreita proximidade com o MLN pode ajudar com localizar e identificar o nó uma vez que é exteriorizado.

Uso da posição Trendelenburg nem sempre pode ser necessário para a coleta MLN, e se MLN pode ser facilmente recuperado sem o uso de posição Trendelenburg pode fazer biópsias hepáticas mais fácil uma vez que irá impedir que os órgãos de deslocamento cranial. Às vezes, após a colocação em posição de Trendelenburg, o fígado é deslocado para cima contra o diafragma e obrigação ser cuidadosamente manipulada volta para a posição antes da recolha de biópsia. Como a colocação da porta para a recolha MLN é para a esquerda, biópsias hepáticas são normalmente tomadas a partir dos lobos hepáticos mediais e laterais esquerda, à medida que estão mais próximos da cânula.

Recolhido MLN e biópsias hepáticas fornecida amplas rendimentos de células para uma variedade de análises a jusante e mostrou uma alta viabilidade das células colhidas. Aqui, as células foram coradas para anise de citometria de fluxo das populações de leucócitos e linfócitos, e as principais diferenças entre estes dois órgãos imunes importantes foram elucidados. Por exemplo, o MLN foram altamente enriquecidas em células T CD4 ⁺ em comparação com o fígado, devido à importância da MLN como pontos centrais para recolha e de difusão respostas imunes adaptativas, bem como para a importância das células CD4 ⁺ T para gerir inflamatória e respostas tolerogénicas ao meio antigénios derivados de consumo alimentar e microrganismos GI-residentes = "xref"> 24. No entanto, o fígado foi significativamente enriquecida para células CD14 ⁺ leucócitos em comparação com o MLN. CD14 é expresso predominantemente em monócitos e macrófagos e é um componente essencial do complexo de receptor para o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) ^25. Na verdade, concentrações plasmáticas aumentadas de CD14 solúvel está associado com a translocação microbiana e activação imunitária em HIV e SIV infecções patogénicas ^26. Assim, as frequências mais elevadas de leucócitos CD14 ⁺ no fígado provavelmente o resultado de uma maior carga bacteriana neste órgão quando comparado com o MLN.

Aqui, nós demonstramos uma técnica cirúrgica rápida e minimamente invasivo para coleta de série do MLN e biópsias hepáticas usando apenas duas pequenas incisões para a entrada laparoscópica que não levou a quaisquer resultados adversos. Estas amostras de fornecer um percurso útil para avaliar os processos de chave imunológica, virológicos e microbiológicos que levam place no MLN e fígado, que são separados e original de imunidade sistémica. Da mesma forma, as biópsias de fígado são críticas para a avaliação a longo prazo dos efeitos do HIV / SIV, drogas terapêuticas, e os micróbios translocados, que muitas vezes se combinam para induzir lesão hepática significativa ^16. Além disso, porque o MLN e fígado são órgãos imunes expostos a GI microbiota, a capacidade de avaliar a imunidade nesses órgãos ao longo do tempo fornece uma excelente plataforma para a compreensão do papel que o microbioma desempenha na manutenção do host homeostase imunológica. Tomados em conjunto, a avaliação do fígado e MLN é de grande importância no contexto de vacinas e eficácias terapêuticas, a depuração viral reservatório SIV, e imunidade mucosa em geral. A capacidade de recolher estas amostras através de uma abordagem minimamente invasiva significa que há menos risco de inflamação relacionada com o procedimento do que existe com as técnicas actualmente publicados e menos impacto sobre a fisiologia do animal. No future, iremos avaliar o potencial de combinar a coleção de MLN e fígado com a coleção de baço através dos mesmos dois locais de porta para permitir amostragem de outra parte importante e distinta do sistema imunitário que tem sido mostrado para jogar um papel significativo na uma série de modelos de doenças.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lágrimas artificiais Lubrificante Pomada Oftálmica	Patterson Veterinary	97-890-8152
Priority Care Clorexidina 2% Esfoliante	Patterson Veterinário	07-842-6153
Álcool Vedco, Isopropil 70%	Patterson Veterinário	07-869-6434
Vedco Vetadine Scrub	Patterson Veterinário	07-869-6772
Hospira Lactato Ringer's 250 mL	Patterson Veterinary	07-800-9325
Campo cirúrgico para laparotomia	Medline	DYNJP3004
Access 40 L Insuflador	Dyonics	7205832
300XL Fonte de luz de xenônio	Dyonics	7206084
460P 3 – Câmera digital CCD com cortina de câmera	72200086		Dyonics
, 7 "x 96"	Serviços de Suporte à Endoscopia	ESS-6920
Guia de Luz Universal, 7.5 Ft	Serviços de Suporte à Endoscopia	US. OU225
Suporte à Endoscopia	Tubulação Insufladora	TM-102
Escopo Rígido Multiuso, 2,7 mm x 187,5 mm, 0 Graus	Serviços de Suporte à Endoscopia	B30-0007-00
Exame e Bainha Protetora para 2,7 mm x 187,5 mm com uma torneira fixa	Serviços de Suporte à Endoscopia	B10-0025-00
Endoscópio rígido, 5 mm x 300 mm	Serviços	de Suporte à EndoscopiaB30-0071-00
Agulha Veress, 2 mm x 80 mm	Serviços de Suporte à Endoscopia	8302.08
Sonda Sólida com Marcas, 5 mm x 320 mm	Serviços de Suporte à Endoscopia	8383.661
Maryland Pinça de Apreensão e Dissecção com Cabo de Catraca de Dupla Ação, 3,5 mm x 240 mm	Serviços de Suporte à Endoscopia	8390.2054
Fórceps de Biópsia, 3,5 mm x 310 mm	R. Wolf	8391.4063
Cânula Roscada de Plástico com Porta Insufladora, 3,5 mm x 60 mm	Serviços de Suporte à Endoscopia	8903.072
Cânula Roscada de Plástico com Porta Insufladora, 5,5 mm x 60 mm	Serviços de Suporte à Endoscopia	8919.333
de Trocarte de Ponta Romba	Serviços de Suporte	8903.101
Trocarte de Ponta Piramidal	Serviços de Suporte para Endoscopia	8903.121
CO2	Airgas	CD USPE
RPMI 1640	Fisher Scientific	SH30027FS	com L-Glutamina
RNAsolução de estabilização posterior	ThermoFisher Scientific	AM7021
Penicilina-Estreptomicina	Sigma Aldrich	P4333
Liberase TM Grau de Pesquisa	Sigma Aldrich	5401119001	Solução de coleganse comercialmente disponível
Dnase I do pâncreas bovino	Sigma Aldrich	D5025
70 µ filtros de células m	Morganville Scientific	CSS0200
Seringa de 5 mL	BD	309646
Tubos de centrífuga cônicos de 50 mL	ThermoFisher Scientific	339652
Soro bovino fetal	Fisher Scientific	SH3007003
Tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL	Fisher Scientific	14-959A
PBS	Fisher Scientific	SH3025601
LIVE/DEAD Aqua Kit de Coloração de Células Mortas	Fixáveis ThermoFisher Scientific	L34957	Coloração de células mortas de amina
CD45-PerCP (clone D058-1283)	BD Biosciences	558411
PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2)	BD Biosciences	562406
BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4)	Biolegend	317438
APC-H7 Camundongo anti-Hu CD8 (clone SK1)	BD Biosciences	560179
PE-Cy5 Camundongo Anti-Hu CD20 (clone 2H7)	BD Biosciences	555624
BV786 Camundongo Anti-Hu CD14 (clone M5E2)	BD Biosciences	563698
16% PARAFORMALDEÍDO AQ SOLUTN	Fisher Scientific	50-980-487
LSR II Citômetro de Fluxo	BD	NA