Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

Junning Yang; Chuanshen Wu; Ioana Stefanescu; Arie Horowitz

doi:10.3791/55621

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Artigo de método

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

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DOI:

10.3791/55621

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22 de abril de 2017

Junning Yang¹ , Chuanshen Wu² , Ioana Stefanescu¹ , Arie Horowitz¹^,³

¹Department of Medicine, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, ²Department of Molecular Cardiology, Cleveland Clinic Foundation, ³Department of Cancer Biology, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos uma técnica para usar células-tronco embrionárias murinas para gerar dois ou três corpos embrióides dimensionais. Em seguida, explicar como induzir a diferenciação neuronal das células do corpo embrióides por ácido retinóico, e como para analisar o seu estado de diferenciação por imunofluorescência marcador de células progenitoras e imunotransferência.

Resumo

De ratinho de células estaminais embrionárias (CES) isolados a partir da massa interna do blastocisto (tipicamente no dia E3.5), pode ser utilizado como sistema modelo in vitro para estudar o desenvolvimento embrionário precoce. Na ausência de factor inibidor de leucemia (LIF), CES diferenciar pelo padrão para as células precursoras neurais. Eles podem ser acumulados num tridimensional (3D) agregado esférico denominado corpo embrióides (EB), devido à sua semelhança com o embrião em fase precoce. EBs podem ser semeadas em lamelas revestidas com fibronectina, onde eles se expandem através do crescimento duas extensões dimensionais (2D), ou implantado em matrizes de colagénio 3D, onde eles continuar a crescer como esferóides, e diferenciam-se em três camadas germinais: endoderme, mesoderme, e ectodérmica. A cultura de colagénio 3D imita o ambiente in vivo mais perto do que a EB 2D. A cultura 2D EB facilita a análise por imunofluorescência e imunotransferência para controlar a diferenciação. Nós desenvolvemos uma diferenciação neural de duas etapasprotocolo ção. No primeiro passo, EBs são gerados pela técnica de suspensão-gota, e, simultaneamente, são induzidos a diferenciar por exposição ao ácido retinóico (RA). No segundo passo, os rendimentos de diferenciação de células neurais em formato 2D ou 3D, na ausência de RA.

Introdução

CES originam a partir da massa celular interior de blastocistos. Estas células são pluripotentes, isto é, têm a capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de células do organismo de origem. CES diferenciação in vitro é de grande interesse como um sistema experimental para a investigação de vias e de mecanismos de desenvolvimento. Dispõe de um sistema modelo potente e flexível para testar novas abordagens terapêuticas para a correcção da disfunção de células e tecidos. EBs recapitular diversos aspectos da diferenciação celular durante o desenvolvimento embrionário precoce. Em particular, a EBS pode ser utilizado quando a letalidade embrionária tor....