Method Article

LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics

DOI:

10.3791/55626

⸱

April 9th, 2017

 ,  , 
1Division of Structural Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui apresenta-se um protocolo passo-a-passo do método (LERLIC-MS / MS) de longa duração electrostática espectrometria de massa repulsão-hidrofílico interacção cromatografia em tandem. Esta é uma nova metodologia que permite pela primeira vez a quantificação e caracterização dos glutamina e asparagina isoformas de desamidação por proteómica espingarda.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caracterização de desamidação proteína é imperativo para decifrar o papel (s) e as potencialidades desta modificação pós-tradução da proteína (PTM) em patologia humana e outros contextos bioquímicos. A fim de realizar uma caracterização da desamidação proteína, nós desenvolvemos recentemente um longo comprimento electrostática interacção espectrometria de cromatografia em tandem romance repulsão-hidrofílico massa (LERLIC-MS / MS) que pode separar a glutamina (Gln) e asparagina isoforma (Asn) produtos de desamidao de compostos modelo para amostras biológicas altamente complexas. LERLIC-MS / MS é, portanto, a primeira estratégia de proteómica espingarda para a separação e quantificação de isoformas de desamidação Gln. Nós também demonstram, como uma novidade, que o protocolo de processamento da amostra descrito aqui estabiliza o intermediário succinimida permitindo a sua caracterização por LERLIC-MS / MS. Aplicação de LERLIC-MS / MS como mostrado neste artigo de vídeo pode ajudar a elucidar a actualmente desconhecidamatrizes n moleculares de desamidação proteína. Além disso, LERLIC-MS / MS fornece uma maior compreensão das reacções enzimáticas que envolvem desamidação em contextos biológicos distintos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A desamidação é uma modificação pós-tradução da proteína (PTM), que introduz uma carga negativa para o esqueleto da proteína através da modificação de asparagina (Asn) e / ou resíduos de glutamina (Gln) 1. Esta modificação, enquanto que afectam os resíduos Asn gera a produtos isoméricos ácido isoaspartic (isoAsp) e n ácido aspártico (Asp) a um comum proporção de 3: 1 2. Não obstante, esta proporção pode ser alterada pela intervenção da enzima de reparação de L-isoaspartyl metiltransferase (PIMT) 3, 4. Da mesma forma, a desamidação de resíduos Gln gera o ácido isomérica gama-glutâmico (γ-Glu) e isoformas de ácido alfa-glutâmico (α-Glu) a uma esperada razão de 1: 7 3, 5, mas esta proporção pode ser deslocado por acção de a transglutaminase ubíqua enzima 2 e outras transglutaminases, incluindo uma transglutaminase, uma mensagemnzyme recentemente identificada como associada com vesículas extracelulares no cérebro 6.

A origem de desamidação pode ser espontânea ou enzimática, o primeiro é especialmente comum em resíduos de Gln em que as transglutaminases e outras enzimas medeiam reticulação / intra-molecular entre através de transamidação (ver 3 para mais detalhes sobre Gln transamidação e suas implicações em várias crónica e doenças humanas fatais). Portanto, desamidação é um PTM que tem uma repercussão crucial sobre a estrutura e função das moléculas afectadas 4, 7, 8 e requer uma caracterização química em profundidade 3 em função das suas diversas consequências bioquímicas incluindo o seu serviço de relógio como molecular de envelhecimento 9 .

Embora desamidação de resíduos Asn tem sido relativamente bem caracterizados por proteómica espingarda de baixo para cima 1, 10, desamidação de resíduos Gln ainda não tem um método de caracterização adequada para além da análise de um desafio por compostos modelo à base de electrões fragmentação radical 11. Nós desenvolvemos recentemente um novo uma dimensão proteómica espingarda estratégia (LERLIC-MS / MS) 3 que permite a separação de Gln e Asn isoformas de desamidação em amostras biológicas complexas e compostos modelo em uma única análise. LERLIC-MS / MS baseia-se na separação de péptidos trípticos digerido usando um longo comprimento (50 cm) de coluna de permuta iónica (LAX) que trabalha no modo de cromatografia de interacção electrostática repulsão-hidrofílico (ERLIC) e acoplada a espectrometria de massa em tandem (LC- MS / MS). Esta nova estratégia de análise foi usado para caracterizar e quantificar relativamente a extensão de cada resíduo desamidada nos tecidos cerebrais humanosf "> 3. No entanto, o protocolo delineado aqui vai fornecer imagens de vídeo de LERLIC-MS / MS visa estudar as peculiaridades de desamidação proteína no contexto bioquímica de interesse.

DECLARAÇÃO DE ÉTICA

Todos os procedimentos deste protocolo ter sido aprovado pelo conselho de revisão institucional da Universidade Tecnológica de Nanyang, em Cingapura e foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Embalagem O ani-intercâmbio de longa-metragem Coluna (LAX) Capilar

(Nota: Embora a coluna LAX pode estar em casa-embalados como descrevemos neste protocolo, LAX colunas estão também disponíveis comercialmente, ver Tabela de Materiais e Reagentes para mais detalhes).

  1. Suspender 50 mg de material de embalagem de permuta aniónica fraca em 3,5 mL de tampão de embalagem (Tabela 1) para preparar a suspensão.
  2. Montar a extremidade da coluna capilar (50 cm de comprimento - 200 um de diâmetro interno (ID) tubo) utilizando uma fêmea-para-encaixe fêmea, um ferule e uma porca fêmea. Coloque um ecrã de 1/16" OD de 1 micron de tamanho de poros no interior do encaixe fêmea-para-feminino (Nota:. O ecrã utilizado aqui deve ter tamanho de poro mais pequeno do que o tamanho de partícula do material de embalagem para evitar a fuga do material a partir da coluna).
  3. Embalar o capilar com a pasta, usando uma bomba de pressão operado a 4500 psi. (Nota: Embale o column até que o material de embalagem é visível na entrada da coluna).
  4. Montar a outra extremidade da coluna capilar como descrito no ponto 1.2.

Preparação 2. Amostra

Este protocolo descreve a aplicação de LERLIC-MS / MS para analisar tecidos cerebrais humanos como modelo proteoma. (Nota: Em caso de utilizar outros tecidos ou amostras proteomic, os procedimentos de preparação da amostra deve ser adaptado.)

  1. homogeneização do tecido:
    uma. tecidos cerebrais de lavagem (50 a 100 mg) com solução de tampão fosfato de 1x, durante cinco minutos, três vezes.
    b. Homogeneizar o tecido em 1: 1: 2,5 tecido / esferas metálicas / tampão de homogeneização SDC (Tabela 2) proporção (w / w / v) durante 5 min a 4 ° C em tubos de cofre-bloqueio com a máxima intensidade utilizando um homogeneizador de tecidos. (Nota: tampão de homogeneização SDC podem incluir inibidores de protease como anteriormente indicado em 3)
    c. Centrifugar o homogenado de tecido, obtida from o passo anterior, a 10000 x g, 4 ° C durante 10 minutos e recolher o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.
    d. Repetir os passos bc para os peletes remanescentes e combinar os sobrenadantes tantas vezes quanto necessário, até que nenhum sedimento é observada. (Nota: Se você tem de repetir os passos bc mais de duas vezes, mover a amostra e as contas para um novo tubo de seguro-lock para evitar a perda de amostra durante a etapa de centrifugação).
    e. Quantificar a concentração de proteína dos homogenatos obtidos por ensaio de ácido bicinconínico (BCA) 12.
  2. O desoxicolato de sódio (SDC) -assisted em solução de digestão tríptica 13 de homogeneizados de cérebro.
    uma. Adicionar uma concentração final de ditiotreitol 10 mM (DTT) (utilizando a solução estoque indicado em Solução 5 da Tabela 3) para o homogenato obtido para iniciar a redução de ligações dissulfureto proteína.
    b. Incubar o homogeneizado durante 30 minutos num banhopré-programada para 60 ° C.
    c. Adicionar ao homogenato numa concentrao final de iodoacetamida 20 mM (IAA), utilizando a solução estoque indicado em Solução 7 da Tabela 4.
    d. Incubar o homogeneizado contendo IAA à temperatura ambiente no escuro durante 45 min.
    e. Dilui-se a homogenato de cérebro de dois-se dobra usando tampão de diluição (solução a 6 da Tabela 3).
    f. Incubar a amostra por um segundo passo de redução durante 30 min a 37 ° C.
    g. Adicionar tripsina de grau de sequenciação modificado dissolvido em Solução 2 da Tabela 2 a 1:50 proporção entre proteína e para a enzima (w / w).
    h. Digerir o homogeneizado com tripsina por incubação durante a noite a 30 ° C.
    Eu. Extingue-se a digestão enzimática no dia seguinte por adição de 0,5% de concentração final de ácido fórmico (FA). (Nota: A adição de FA irá provocar a precipitação dos sais SDC em condições ácidas).
    j. Suavemente vortex as amostras contendo SDC precipitates.
    k. Sedimentar para baixo os sais SDC por centrifugação das amostras a 12000 x g, 4 ° C durante 10 min.
    eu. Recolhe-se o sobrenadante e transferir o líquido para um novo tubo limpo. (Nota: Tome cuidado durante a pipetagem desta etapa para não re-suspender e / ou recolher sais do sedimento SDC).
    m. Re-dissolver o sedimento em SDC SDC tampão dissolvendo re-(Tabela 5) sob agitação em vórtice vigorosa durante 1 min.
    n. Repita os passos jl duas vezes para recuperar peptídeos precipitados e combinam-se os sobrenadantes. (Nota:. Ver Serra et al 2016 13 para mais detalhes sobre o SDC-assistida em solução protocolo digestão tríptica adaptado aqui.)
  3. A dessalinização de triptico digerido amostras.
    uma. Realizar a dessalinização de amostras digeridas utilizando um cartucho de 1 g de C-18. (Nota: O uso de um cartucho de grande volume (5 mL), independentemente da quantidade de proteína obtida garantias de limpeza adequada dos restantes sais SDC nas amostras antesa injecção de LC-MS / MS).
    b. Realizar o condicionamento do cartucho C-18, 1 g com 5 mL de acetonitrilo (ACN).
    c. Passa 5 mL de tampão de limpeza (Tabela 6) por 1g do cartucho C-18 de ar para remover qualquer solvente orgânico remanescente.
    d. Carregar a amostra para o cartucho de 1 g de C-18.
    e. Realizar 3 - 5 etapas de limpeza para a amostra na coluna 1 g C-18 utilizando 5 mL de solução tampão de limpeza a cada passo.
    f. Eluir os péptidos dessalinizada a partir de 1 g a C-18 do cartucho, utilizando 5 mL de tampão de eluição (Quadro 7).
    g. Secam-se os péptidos eluidos em um concentrador de vácuo.
    c. Reconstituir a amostra seca em um volume final de 200 uL de tampão de eluição. (Nota:. Uso vigorosa e longa (> 10 min), seguido por agitação em vórtex ultra-sons subsequente num banho de ultra-sons durante 30 minutos para re-suspender completamente os péptidos secos em tampão de injecção)
    d. Ajustar o volume de injecção da amostra para LERLIC-MS / MS para analisar entre 1 e 3 ug de proteína.

3. Uma dimensão LERLIC-MS / MS Separação

  1. condições de cromatografia líquida:
    fases móveis:
    A: FA a 0,1% em água (Tabela 8).
    B: 0,1% de FA em ACN (Tabela 9)
    Caudal: 0,4 mL / min
    Coluna: coluna capilar LAX (50 cm de comprimento - 200 um ID)
    uma. Utilizar o seguinte 1,200 min de gradiente: 95% de B durante 40 min, 95-85% de B durante 434 min, 85-70% de B durante 522 min, 70-35% de B durante 124 min, 35-3% de B durante 45 min , isocrática a 3% de B durante 5 min, 3-95% de B ao longo de 7 min e mantido isocrática a 95% de B durante 23 min.
    b. Realizar a separação de péptidos que utilizam o capilar LAX como indicado em Serra & Gallart-Palau et al. 3, utilizando ultra-alta pressão de cromatografia líquida.
  2. configuração do espectrômetro de massa:
    uma. Configurar os detalhes do evento de digitalização para executar aquisição de dados alternada between Fourier completo transformar-espectrometria de massa (FT-MS) e espectrometria de massa em tandem transformar-Fourier (FT-MS / MS) com os seguintes parâmetros:
    a.1. modo de aquisição de dados: positiva
    a.2 parâmetros FT-MS:
    Intervalo de massa: 350 - 2000 m / z
    Resolução: 60.000
    Microscans: 1 por espectro
    Controle automático de ganho: 1 × 10 6
    a.3 parâmetros FT-MS / MS:
    modo de fragmentação: de alta energia de dissociação colisão (HCD)
    Intervalo de massa a.4: 150 - 2000 m / z
    a.5 Resolução: 30.000
    a.6 iões topo N: 10
    Microscans: 1 por espectro
    Cobrança Estado:> 2+
    largura isolamento: 2 Da
    A.7 controle de ganho automático: 1 × 10 6
    b. Realizar a detecção de espectrometria de massa dos péptidos, tal como indicado em 3 utilizando um espectrómetro de massa Orbitrap equipado com uma fonte de iões de nanoelectrospray trabalhando a 1,5 kV.

Análise 4. Dados

  1. Execute proteem busca de base de dados para o LERLIC-MS / MS de dados usando os seguintes parâmetros utilizando um software de proteómica específico obtido: (Nota: Ver 3 para mais detalhes).
    uma. tolerância de iões: 10 ppm
    b. tolerância iões fragmento: 0,05 Da
    c. Taxa de falso Discovery (FDR): 1%
    d. Base de dados: banco de dados Humano UniProt
    e. modificações fixos: Carbamydomethylation em Cys
    f. modificações variáveis ​​(se exigido pelo software): oxidação (Met), Desamidação (Asn e Gln).
  2. Caracterização confiante e quantificação de produtos desamidados isoméricas em dados LERLIC-MS / MS:
    uma. Exportação de resultados de pesquisa de banco de dados de LERLIC-MS / MS para um software spreedsheet para análise.
    b. Encontrar e extrair toda a lista de péptidos desamidados e os seus homólogos não desamidados.
    c. Utilizando a lista dos péptidos obtidos como referência, extrair os cromatogramas iónicos (XICS) destes péptidos utilizando um software apropriado a 5 ppm de tolerância massa. (Nota:Veja 3 para mais detalhes sobre o software usado para a extração de XICS.)
    d. Inspeccione visualmente os XICS obtidos para identificar a separados eluição dupla pico dos produtos isoméricos como indicado 3. (Nota: produtos isoméricos destes péptidos identificados a nível MS / MS pode ser facilmente encontrado orientada pela presença de dois tempos de retenção diferentes no resultado da pesquisa do banco de dados.)
    e. A quantificação relativa dos produtos isoméricos de cada local desamidada / péptido tem que ser executada com base na área do pico de cada isómero identificados nas XICS obtidos.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A desamidação de resíduos Gln e Asn é considerada uma modificação da proteína degenerativa (DPM) implicados em várias doenças crónicas e fatais 14. Tem sido demonstrado que esta PTM pode prever a meia-vida e degradativas estados de anticorpos e outras moléculas no corpo humano e origens biológicas semelhantes 1, 15. O significado de desamidação proteína, na verdade, ultrapassa o contexto biomédico, portant...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste vídeo-artigo apresentamos um protocolo passo-a-passo de LERLIC-MS / MS 3, um método para realizar uma caracterização em profundidade e para determinar com precisão a extensão da desamidação da proteína e os processos enzimáticos envolvidos nesta modificação de proteínas. LERLIC-MS / MS baseia-se no uso de um longo comprimento (50 cm) LAX sob o princípio de cromatografia electrostática repulsão-hidrofílico interacção (ERLIC) 27. A utilização de uma coluna de longa dur...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi em parte apoiado por subsídios do Ministério da Educação de Cingapura (Tier 2: Conceder ARC9 / 15), National Medical Research Council of Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016) e NTU-NHG Aging Research Grant ( Grant ARG / 14017). Nós gostaríamos de expressar nossa gratidão e mais sinceros agradecimentos ao Dr. Andrew Alpert e equipe PolyLC para gentilmente nos cedeu os materiais de embalagem que tornaram possível este estudo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PolyCAT 3 e micro; m 100-Å (material a granel)PolyLC Inc.Coluna
capilar de troca iônica de comprimento longo 50 cm - 200 µ m IDPolyLC Inc.Pedido
de tubulação PEEKsil 1/16" OD x 200 e micro; m ID x 50 cm de comprimentoSGE Analytical Science sob Trajan Scientific Australia 620050
Conexão fêmea para fêmea para tubulação de 1/16" ODUpchurch ScientificUPCHF-125
Porca fêmea para microférulaUpchurch ScientificUPCHP-416
MicroférulaUpchurch ScientificUPCHF-132
Bomba de Pressão NanoBaumeWestern Fluids EngineeringSP-400
Shimadzu Proeminência UFLC sistemaShimadzuProminence UFLC
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24
Tubos de trava seguraEppendorf T9661-1000EA
Contas de aço inoxidável. 0,9 - 2,0 mm. 1 lb. Não estéril.Próximo CentrífugoAdvance SSB14B
 Hettich ZentrifugenRotina 380 R
Banho de Circulação Aquecido Digital Padrão, 120VACPolyScience 8006 6L8006A11B
Sep-pack c18 cartucho de dessalinização 50 mgConcentradorde água WAT020805
VacummEppendorf Concentrator Plus
Dionex UltiMate 3000 UHPLC DionexUltiMate 3000 UHPLC 
Espectrômetro de massa Orbitrap EliteThermo Fisher Scientific Inc.ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray Michrom-Bruker Inc.Incubadora TCSI-SS2
INCUCELL MMM GrupoINCUCELL111
Tripsina modificada de grau de sequenciamentoPromegaV5111
Comprimidos de coquetel inibidor de proteaseRoche11836170001 (ROCHE)
Solução tampão fosfato 10x (diluído para 1x)Sigma-AldrichP5493
Acetato de amônioSigma-AldrichA1542
Desoxicolato de sódioSigma-AldrichD6750
DitiotreitolSigma-AldrichD0632
IodoacetamidaSigma-Aldrichi6125
Ácido fórmicoSigma-AldrichF0507 (HONEYWELL)
Hidróxido de amônioSigma-Aldrich338818 (HONEYWELL)
Acetonitrila HPLC grauSigma-Aldrich675415
HPLC de isopropanol grauSigma-Aldrich675431
água HPLC grauSigma-Aldrich14263
especial de mesa Sistema

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
  2. Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
  3. Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
  4. Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
  5. Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
  6. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).
  7. Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27(2016).
  8. Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
  9. Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
  10. Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
  11. Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
  12. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  13. Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
  14. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
  15. Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
  16. Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106(2016).
  17. Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005(2016).
  18. Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
  19. Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
  20. Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
  21. Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
  22. Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20(2016).
  23. Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
  24. Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
  25. Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
  26. Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798(2016).
  27. Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
  28. Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111(2011).
  29. Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
  30. Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

LERLIC MS MSGlutamine DeamidationAsparagine DeamidationShotgun ProteomicsProtein DeamidationSuccinimide IntermediateAnion Exchange ChromatographyPeptide SeparationProteome AnalysisPosttranslational Modification

Related Articles