LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics

Summary

Aqui apresenta-se um protocolo passo-a-passo do método (LERLIC-MS / MS) de longa duração electrostática espectrometria de massa repulsão-hidrofílico interacção cromatografia em tandem. Esta é uma nova metodologia que permite pela primeira vez a quantificação e caracterização dos glutamina e asparagina isoformas de desamidação por proteómica espingarda.

Abstract

Caracterização de desamidação proteína é imperativo para decifrar o papel (s) e as potencialidades desta modificação pós-tradução da proteína (PTM) em patologia humana e outros contextos bioquímicos. A fim de realizar uma caracterização da desamidação proteína, nós desenvolvemos recentemente um longo comprimento electrostática interacção espectrometria de cromatografia em tandem romance repulsão-hidrofílico massa (LERLIC-MS / MS) que pode separar a glutamina (Gln) e asparagina isoforma (Asn) produtos de desamidao de compostos modelo para amostras biológicas altamente complexas. LERLIC-MS / MS é, portanto, a primeira estratégia de proteómica espingarda para a separação e quantificação de isoformas de desamidação Gln. Nós também demonstram, como uma novidade, que o protocolo de processamento da amostra descrito aqui estabiliza o intermediário succinimida permitindo a sua caracterização por LERLIC-MS / MS. Aplicação de LERLIC-MS / MS como mostrado neste artigo de vídeo pode ajudar a elucidar a actualmente desconhecidamatrizes n moleculares de desamidação proteína. Além disso, LERLIC-MS / MS fornece uma maior compreensão das reacções enzimáticas que envolvem desamidação em contextos biológicos distintos.

Introduction

A desamidação é uma modificação pós-tradução da proteína (PTM), que introduz uma carga negativa para o esqueleto da proteína através da modificação de asparagina (Asn) e / ou resíduos de glutamina (Gln) ^1. Esta modificação, enquanto que afectam os resíduos Asn gera a produtos isoméricos ácido isoaspartic (isoAsp) e n ácido aspártico (Asp) a um comum proporção de 3: 1 ^2. Não obstante, esta proporção pode ser alterada pela intervenção da enzima de reparação de L-isoaspartyl metiltransferase (PIMT) ^{3, 4.} Da mesma forma, a desamidação de resíduos Gln gera o....

Protocol

1. Embalagem O ani-intercâmbio de longa-metragem Coluna (LAX) Capilar

(Nota: Embora a coluna LAX pode estar em casa-embalados como descrevemos neste protocolo, LAX colunas estão também disponíveis comercialmente, ver Tabela de Materiais e Reagentes para mais detalhes).

1. Suspender 50 mg de material de embalagem de permuta aniónica fraca em 3,5 mL de tampão de embalagem (Tabela 1) para preparar a suspensão.
2. Montar a extremidade da coluna capilar (50 cm de comprimento - 200 um de diâmetro interno (ID) tubo) utilizando uma fêmea-para-encaixe fêmea, um ferule e uma porca fêmea. Col....

Results

A desamidação de resíduos Gln e Asn é considerada uma modificação da proteína degenerativa (DPM) implicados em várias doenças crónicas e fatais ^14. Tem sido demonstrado que esta PTM pode prever a meia-vida e degradativas estados de anticorpos e outras moléculas no corpo humano e origens biológicas semelhantes ^{1, 15.} O significado de desamidação proteína, na verdade, ultrapassa o contexto biomédico, portant.......

Discussion

Neste vídeo-artigo apresentamos um protocolo passo-a-passo de LERLIC-MS / MS ^3, um método para realizar uma caracterização em profundidade e para determinar com precisão a extensão da desamidação da proteína e os processos enzimáticos envolvidos nesta modificação de proteínas. LERLIC-MS / MS baseia-se no uso de um longo comprimento (50 cm) LAX sob o princípio de cromatografia electrostática repulsão-hidrofílico interacção (ERLIC) ^27. A utilização de uma coluna de longa dur.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PolyCAT 3 e micro; m 100-Å (material a granel)	PolyLC Inc.	Coluna
capilar de troca iônica de comprimento longo 50 cm - 200 µ m ID	PolyLC Inc.	Pedido
de tubulação PEEKsil 1/16" OD x 200 e micro; m ID x 50 cm de comprimento	SGE Analytical Science sob Trajan Scientific Australia	620050
Conexão fêmea para fêmea para tubulação de 1/16" OD	Upchurch Scientific	UPCHF-125
Porca fêmea para microférula	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Microférula	Upchurch Scientific	UPCHF-132
Bomba de Pressão NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
Shimadzu Proeminência UFLC sistema	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
Tubos de trava segura	Eppendorf	T9661-1000EA
Contas de aço inoxidável. 0,9 - 2,0 mm. 1 lb. Não estéril.	Próximo Centrífugo	Advance SSB14B
	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
Banho de Circulação Aquecido Digital Padrão, 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack c18 cartucho de dessalinização 50 mg	Concentrador	de água WAT020805
Vacumm	Eppendorf		Concentrator Plus
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC
Espectrômetro de massa Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray	Michrom-Bruker Inc.	Incubadora TCSI-SS2
INCUCELL	MMM Grupo	INCUCELL111
Tripsina modificada de grau de sequenciamento	Promega	V5111
Comprimidos de coquetel inibidor de protease	Roche	11836170001 (ROCHE)
Solução tampão fosfato 10x (diluído para 1x)	Sigma-Aldrich	P5493
Acetato de amônio	Sigma-Aldrich	A1542
Desoxicolato de sódio	Sigma-Aldrich	D6750
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Iodoacetamida	Sigma-Aldrich	i6125
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	F0507 (HONEYWELL)
Hidróxido de amônio	Sigma-Aldrich	338818 (HONEYWELL)
Acetonitrila HPLC grau	Sigma-Aldrich	675415
HPLC de isopropanol grau	Sigma-Aldrich	675431
água HPLC grau	Sigma-Aldrich	14263