Ensaios de Retardamento de Gel de Agarose Protein-tRNA para Análise do<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -Treonilcarbamoyladenosina TcdA Function

Resumo

Um protocolo é apresentado para a produção de tRNA (UUU) e a análise de tRNA (UUU) em complexo com a enzima TcdA por ensaios de retardamento de gel de agarose.

Resumo

Demonstramos métodos para a expressão e purificação de tRNA (UUU) em Escherichia coli e a análise por ensaios de retardamento de gel da ligação de tRNA (UUU) a TcdA, uma N6-teronilcarbamoil-videina (t ⁶ A) desidratase, que cicliza o treonilcarbamoílo Cadeia lateral anexada a A37 no circuito anticodon (ASL) de tRNAs para t ⁶ A cíclico (ct ⁶ A). A transcrição do gene sintético que codifica tRNA (UUU) é induzida em E. coli com β-D-1-tiogalactopiranósido isopropílico 1 mM (IPTG) e as células contendo tRNA são colhidas 24 h após a indução. A fração de ARN é purificada usando o método de extração de fenol ácido. O ARNt puro é obtido por cromatografia de filtração em gel que separa eficientemente as moléculas de tRNA de tamanho pequeno de ácidos nucleicos intactos ou fragmentados maiores. Para analisar a ligação TcdA ao tRNA (UUU), TcdA é misturado com tRNA (UUU) e separado em um gel de agarose nativo a 4 ° C.O tRNA livre (UUU) migra mais rápido, enquanto os complexos TcdA-tRNA (UUU) sofrem um retardo de mobilidade que pode ser observado após a coloração do gel. Demonstramos que TcdA é uma enzima de ligação de tRNA (UUU). Este ensaio de retardamento de gel pode ser usado para estudar mutantes de TcdA e os efeitos de aditivos e outras proteínas na ligação.

Introdução

O teste de retardamento de gel ¹ (também conhecido como ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, EMSA) é um método eletroforético projetado para estudar e caracterizar interações proteína-ácido nucleico. Ele permite a análise do DNA da proteína e das interações proteína-ARN e, em particular, as interações entre as proteínas de ligação de ARNt e ARNt, utilizando componentes purificados ou misturas complexas de proteínas ( por exemplo , lisados ​​celulares) ou ácidos nucleicos ( por exemplo , tRNA Piscinas). Nós aplicamos ensaios de retardamento de gel ao estudo da interação entre ARNt purificado (UUU) e TcdA, uma N6-teronilcarbamoiladenosina (t ⁶ A) desidratase, que cicliza a cadeia lateral de treonilcarbamoílo anexada a A37 no anel de tronco anticodon (ASL) De tRNAs para t ⁶ cíclico (ct ⁶ A) ^{2 , 3} . TcdA também é conhecido como CsdL ^{3 ,}F "> 4. O gene tcdA / csdL forma um cluster com os genes csdA e csdE ⁵ , que codificam a dessulfurase de cisteína e o aceitador de enxofre do sistema de desulfinato de cisteína sulfinase (CSD) e é necessário para manter a função TcdA in vivo ³ .

O raciocínio por trás dos ensaios de retardamento de gel é que, enquanto as moléculas de ácido nucleico livres migram rapidamente para a frente da acrilamida ou géis de agarose em virtude da sua grande carga negativa, a mobilidade eletroforética de complexos de proteína dos mesmos ácidos nucleicos é dramaticamente reduzida. A redução da mobilidade é visualizada como uma "mudança" nos complexos de ácido nucleico-proteína, que se resolvem como bandas discretas. O complexo de ácido nucleico e proteína positivamente carregado e maior apresenta uma maior mudança ou redução na mobilidade em um gel.

Uma vez que a neutralização da carga do complexo é um fenômeno universalPara os complexos proteína-ácido nucleico, o teste de retardamento do gel pode ser aplicado a uma ampla gama de complexos e tipos de ácidos nucleicos. O método é simples, barato e pode ser realizado em laboratórios com equipamentos mínimos. Requer apenas pequenas quantidades de proteínas e ARNt. Esta é uma vantagem em relação às técnicas biofísicas alternativas, que geralmente consomem maiores quantidades de amostra.

O teste de retardamento de gel tem sido amplamente utilizado para o estudo de fatores de transcrição. O ensaio tem sido utilizado para analisar a cinética de ligação, a força e a especificidade dos fatores de transcrição para muitas seqüências de DNA diferentes. Foi nesse campo que a EMSA foi desenvolvida pela primeira vez ^{6 , 7} . Os ensaios de retardamento de gel com moléculas de ARN ^{8 , 9 , 10 , 11} e tRNA também foram utilizados na pesquisa de ribossomosE analisar, como fazemos aqui, as enzimas que modificam os nucleósidos de tRNA pós-transcrição.

Muitos parâmetros diferentes afetam o resultado de um teste de retardamento de gel, como temperatura, qualidade da proteína e amostra de tRNA, e a força da ligação. O planejamento cuidadoso ea execução do experimento são cruciais para a interpretação dos resultados do ácido nucleico livre e das espécies ligadas a proteínas. Aqui, usamos o gene sintético que codifica tRNA (UUU) clonado em um vetor de expressão cujo promotor não possui o local de ligação do ribossoma Shine-Dalgarno, levando à síntese de grandes quantidades do tRNA ² . Este protocolo detalhado destina-se a fornecer um guia claro para realizar experiências de retardamento de gel de ARNt, evitando erros comuns.

Protocolo

Cuidado: consulte todas as folhas relevantes de dados de segurança de material (MSDS) antes de usar. Vários dos produtos químicos utilizados neste protocolo são tóxicos e corrosivos. Use práticas adequadas ao realizar a extração de ARNt usando fenol, incluindo o uso de uma chaminé e equipamento de proteção pessoal (óculos de segurança, luvas, bata de laboratório, calças completas, sapatos fechados, etc. ). Este protocolo usa uma mancha de ácido nucleico não tóxico. O uso de manchas alternativas pode exigir precauções adicionais e disposição especializada do agente de coloração se for tóxico e / ou cancerígeno ( por exemplo , brometo de etidio).

1. Preparação do Gel de Agarose

1. Pesar 2 g de agarose e adicioná-lo a uma garrafa de vidro para preparar um gel de agarose a 2% p / v.
2. Adicione 100 mL de tampão de transição de ácido tris-borato-etilenodiaminotetraacético (EDTA) (TBE) ao frasco contendo agarose. Derreta-se por aquecimento em um microondas. Com intervalos de 30 s, arraste o conteúdo para misturarBem e repita este passo até que a agarose esteja completamente dissolvida. Deixe a solução de agarose arrefecer até aproximadamente 50-60 ° C.
3. Tape as bordas abertas de uma bandeja de gel para criar um molde, coloque um pente apropriado para criar os poços e coloque a agarose fundida nele. Evite a formação de bolhas e deixe-o solidificar à temperatura ambiente.
4. Uma vez solidificado, coloque a bandeja de gel em uma unidade de eletroforese e preenchê-lo com tampão TBE até o gel estar completamente coberto.

2. Preparação do ARNt

1. Expresso tRNA (UUU) em E. coli
   1. Na parte da manhã, use um frasco de E. coli BL21 (DE3) congelado transformado com o vetor de expressão pET23d-EcUUU ² (abriga o gene que codifica o tRNA de E. coli (UUU)), para criar um Luria Broth (LB) de baixo teor de sal, Placa suplementada com 100 μg / mL de ampicilina. Inverta a placa e coloque-a em uma incubadora de 37 ° até que as colônias apareçam (tarde da tardeOon).
   2. Inocular uma colônia única bem cultivada em 5 mL de LB mais 100 μg / mL de ampicilina e crescer durante a noite a 220 rpm a 37 ° C.
   3. Na manhã seguinte, elimine as células (6.500 xg por 10 minutos a 4 ° C), substitua o meio com 5 mL de LB fresco mais 100 μg / mL de ampicilina e ressuspenda. Use esta suspensão para inocular 200 ml de LB mais 100 μg / mL de ampicilina. Cresça durante 5 h a 220 rpm a 37 ° C.
   4. Quando a densidade óptica da cultura a 590 nm (OD ₅₉₀ ) atingiu 0,6 - 0,8, adicione 1 mM de IPTG à cultura para desencadear a expressão do gene tRNA (UUU). Incubar a 37 ° C durante 3 h.
   5. Colher as células por centrifugação da cultura a 6.500 xg durante 10 min a 4 ° C.
2. Lise e extração
   1. Ressuspender o sedimento celular em 5 mL de tampão de lise (acetato de sódio 0,3 M, EDTA 10 mM). A partir deste ponto, usam buffers autoclavados e mantenham todas as amostras contendo tRNA a 4 ° C para evitar que tDegradação de ARN.
   2. Adicione 1 volume de fenol ácido (pH 4,3) ao sedimento de células ressuspensas na exaustão. Misture durante 1 min por inversão para lisar as células e centrifugar a 10 000 xg (10 min, 4 ° C).
   3. Recolher a fase aquosa superior que contém o tRNA solúvel (UUU) (e menores concentrações dos outros grupos de ARNt) usando uma pipeta com o cuidado de não aspirar a fase orgânica (inferior). Descarte a camada inferior e o grânulo, que consiste na fase orgânica e nos detritos celulares, num recipiente adequado.
   4. Precipite o tRNA misturando completamente a fase solúvel (aquosa) com 2,5 volumes de etanol a 100% v / v por inversão durante 1 h a 4 ° C. Centrifugar a mistura a 15 000 xg (30 min, 4 ° C).
   5. Decantar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento rico em ARNt em 4 mL de tampão de filtração em gel (fosfato de sódio 20 mM ou fosfato de potássio, pH 7,4, EDTA 0,1 mM). Execute 5 μL do conjunto de ARNt ressuspenso em um gel de agarose a 2% p / v.
      NOTA:O ARNt de boa qualidade aparece como uma banda única (tamanho molecular entre 50-100 pb).
3. Purificação do tRNA (UUU)
   1. Seguindo a prática cromatográfica padrão ¹² , carregue o tRNA ressuspenso (UUU) em uma coluna de filtração de gel preparativa de alta resolução (dimensões: 16 x 600 mm, volume do leito: 120 mL, intervalo de resolução: 1.000-70.000 Da) previamente equilibrado em tampão de filtração em gel (na fase móvel). Defina o caudal para 1 mL / min para eluir as amostras.
      NOTA: O pico de ARNt (UUU) elui aproximadamente a 75,5 mL. Tipicamente, pode ser obtido um rendimento de 0,5-1,0 mg / L de tRNA de cultura.
   2. Analisar as amostras em volumes de eluição representativos por eletroforese de 5 a 10 μL de cada amostra em um gel de agarose a 2% p / v.

3. Preparação da amostra

1. Expresse e purifique TcdA de acordo com López-Estepa et al . ² .
   NOTA: Até 250 μMTcdA pode ser usado para o estudo.
2. Pipetar a quantidade correspondente de TcdA conforme a Tabela 1 em tubos de centrífuga de 1,5 mL devidamente rotulados. Adicionar 1,6 mM tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) (concentração final) e misture suavemente com uma pipeta. Feche a tampa e incube a mistura à temperatura ambiente durante 5 min.
3. Adicionar 10 μM de adenosina trifosfato (ATP) e 50 mM de MgCl2 (concentrações finais). Misturar com uma pipeta e incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente.
4. Adicione tRNA purificado (UUU) (seção 2.3) de acordo com a Tabela 1 , misture com uma pipeta e incube à temperatura ambiente durante 5 min.
5. Adicione solução salina tamponada com fosfato (PBS) até 100 μL de volume final. Misturar adequadamente e adicionar glicerol até uma concentração final de 10% v / v.
6. Vortex a amostra e centrifugue brevemente o conteúdo do tubo (10 000 xg, 1 min, 4 ° C).

4. Desenvolvimento de carregamento de gel e eletroforese

1. Coloque a unidade de eletroforese em uma bandeja cheia de gelo triturado para manter a câmara a 4 ° C durante a corrida de eletroforese.
2. Com cuidado, pipetar 5 μL de cada amostra no poço correspondente. Adicione um marcador de tamanho de DNA adequado.
3. Conecte os eletrodos nas ranhuras correspondentes da fonte de alimentação. Ligue a fonte de alimentação e ajuste a tensão para 100 V e execute o gel por 90 min.

5. Coloração de gel para observar a interação de proteína de ARNt

1. Prepare a solução de coloração misturando 50 mL de TBE com 1x de uma mancha de DNA adequada. Evite expor a solução de coloração à luz solar cobrindo o recipiente de coloração com papel alumínio.
   NOTA: As manchas de DNA geralmente são armazenadas como ações concentradas de 10.000 ou 20.000x.
2. Após 90 min de eletroforese, retire cuidadosamente o gel da bandeja e coloque-o em um recipiente com solução de coloração. Coloque-o em um balancim a baixa velocidade de balanço na temperatura ambienteUre por 30 min.
3. Retire o gel de agarose do recipiente de coloração, aperte-o cuidadosamente em um pedaço de tecido de celulose ou papel de filtro para remover o excesso de líquido e coloque-o diretamente em um transiluminador. Ligue a luz UV para visualizar bandas contendo tRNA. Pegue uma fotografia do gel.
4. Coloração de proteínas (opcional).
   1. Descarte a solução de coloração de DNA de forma segura (de acordo com os procedimentos de segurança) e substitua-a por solução de 50 ml de Blue Brilliant Blue (CBB). Coloque a bandeja em um balancim à temperatura ambiente e coloque durante a noite (> 12 h). Descarte a solução de coloração CBB e substitua-a por 50 mL de PBS para remover o excesso de corante. Destain durante 1 h em um rocker.
5. Visualize os complexos de ARNt que contêm proteínas sob um transiluminador leve e tirar fotografias do gel para comparar com a imagem de ARN tRNA UV.

Resultados

Grandes quantidades de ARNt (UUU) podem ser obtidas expressando o gene de ARNt em E. coli sob o controle de um forte promotor de T7 indutível. O tRNA expresso (UUU) se acumula no citoplasma e é enriquecido sobre o conjunto de tRNAs naturalmente abundantes. Um processo de purificação em duas etapas consistindo em um passo de captura / extração e um passo de filtração / polimento de gel foi utilizado para obter o ARNt da classe EMSA. O passo de captura / extração usa pH 4.3 fenol ...

Discussão

O teste de retardamento de gel de proteína-ARNt de agarose aqui descrito pode ser modificado de várias maneiras. Primeiro, a porcentagem de agarose no gel pode ser reduzida para permitir a separação e visualização de complexos proteína-ARNt significativamente maiores que os analisados ​​aqui (120 kDa). Em segundo lugar, se a proteína alvo for termolábil, devem ser tomadas precauções adicionais para garantir que a temperatura seja mantida abaixo da temperatura máxima aceitável, movendo o aparelho de eletroforese para uma...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
E. coli BL21(DE3)	Novagen	70235	DE3 lysogen contém T7 polimerase após indução de IPTG.
pET23d	Novagen	69748-3	pET23d confere resistência à ampicilina; T7.
Caldo LB, baixo teor de sal (caldo Lennox L), granulado	Melford	GL1703	Caldo LB convencional, alto teor de sal, também pode ser usado.
Ampicilina	Sigma-Aldrich	10419313
Incubadora Shaker (Termostada)	NBS	Excella E24	Qualquer incubadora agitadora com controle de temperatura pode ser usada.
Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), > = 99%	Acros Organics	BP1755
Acetato de sódio, anidro, >99%	Melford	B4017
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), sal dissódico, >99%	Acros Organics	AC327205000	Nocivo se inalado.
Centrífuga (refrigerada)	Eppendorf	5430
Rotor de centrífuga (refrigerada)	Eppendorf	5430/5430P
Centrífuga	Sorvall	RC5C
Rotor de centrífuga	Sorvall	SLA-3000
Solução de fenol, saturada com tampão citrato 0,1 M, pH 4,3 ± 0,2	Sigma-Aldrich	P4682	Toxicidade aguda (oral, dérmica, inalatória), corrosivo
Absoluto de etanol para análise, 100% v/v	Merck Millipore	100983
Fosfato de sódio dibásico di-hidratado, Na2HPO4, >=99%	Sigma-Aldrich	71643
Dihidrogenofosfato de potássio, KH2PO4	Merck	48.730.250
HiLoad 16/60 Superdex 75	GE Healthcare	28989333
Agarose	Melford	MB1200
Tris [Tris (hidroximetil) aminometano HCl]	Melford	T1513
Ácido bórico	Melford	B0503
Microondas	Haier	HDA-2070M
TCEP [Cloridrato de Tris (2-carboxietil) fosfina]	Sigma-Aldrich	C4706	Corrosivo para metais e pele.
ATP [Adenosina 5′-trifosfato disódico sal hidratado], Grau I, >=99%	Sigma-Aldrich	A2383
Cloreto de magnésio (MgCl2), anidro, >=98%	Sigma-Aldrich	M8266
Cloreto de sódio (NaCl), >99%	Fisher Biorreagents	BP358
Cloreto de potássio (KCl), >99%	Melford	P0515
NZYDNA Ladder VI	NZYtech	MB8901
Fonte de alimentação	Consort	EV261
Unidade de eletroforese	Laboratory	RELSMINI10
Real Safe coloração de ácido nucleico	Laboratory	RBMSAFE	20.000X estoque
Transiluminador UV (G: Box / EF)	Syngene
Coomassie Azul Brilhante G	Sigma-Aldrich	B0770
Rocker (Gyro-Rocker)	Stuart	SSL3
Mixer Vortex	Marca Fisher	13214789

Real Real 2216498