Um protocolo é apresentado para a produção de tRNA (UUU) e a análise de tRNA (UUU) em complexo com a enzima TcdA por ensaios de retardamento de gel de agarose.
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Artigo de método
Ensaios de Retardamento de Gel de Agarose Protein-tRNA para Análise do
Neste artigo
Resumo
Resumo
Demonstramos métodos para a expressão e purificação de tRNA (UUU) em Escherichia coli e a análise por ensaios de retardamento de gel da ligação de tRNA (UUU) a TcdA, uma N6-teronilcarbamoil-videina (t 6 A) desidratase, que cicliza o treonilcarbamoílo Cadeia lateral anexada a A37 no circuito anticodon (ASL) de tRNAs para t 6 A cíclico (ct 6 A). A transcrição do gene sintético que codifica tRNA (UUU) é induzida em E. coli com β-D-1-tiogalactopiranósido isopropílico 1 mM (IPTG) e as células contendo tRNA são colhidas 24 h após a indução. A fração de ARN é purificada usando o método de extração de fenol ácido. O ARNt puro é obtido por cromatografia de filtração em gel que separa eficientemente as moléculas de tRNA de tamanho pequeno de ácidos nucleicos intactos ou fragmentados maiores. Para analisar a ligação TcdA ao tRNA (UUU), TcdA é misturado com tRNA (UUU) e separado em um gel de agarose nativo a 4 ° C.O tRNA livre (UUU) migra mais rápido, enquanto os complexos TcdA-tRNA (UUU) sofrem um retardo de mobilidade que pode ser observado após a coloração do gel. Demonstramos que TcdA é uma enzima de ligação de tRNA (UUU). Este ensaio de retardamento de gel pode ser usado para estudar mutantes de TcdA e os efeitos de aditivos e outras proteínas na ligação.
Introdução
O teste de retardamento de gel 1 (também conhecido como ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, EMSA) é um método eletroforético projetado para estudar e caracterizar interações proteína-ácido nucleico. Ele permite a análise do DNA da proteína e das interações proteína-ARN e, em particular, as interações entre as proteínas de ligação de ARNt e ARNt, utilizando componentes purificados ou misturas complexas de proteínas ( por exemplo , lisados celulares) ou ácidos nucleicos ( por exemplo , tRNA Piscinas). Nós aplicamos ensaios de retardamento de gel ao estudo da interação entre ARNt purificado (UUU) e TcdA, uma ....
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Protocolo
Cuidado: consulte todas as folhas relevantes de dados de segurança de material (MSDS) antes de usar. Vários dos produtos químicos utilizados neste protocolo são tóxicos e corrosivos. Use práticas adequadas ao realizar a extração de ARNt usando fenol, incluindo o uso de uma chaminé e equipamento de proteção pessoal (óculos de segurança, luvas, bata de laboratório, calças completas, sapatos fechados, etc. ). Este protocolo usa uma mancha de ácido nucleico não tóxico. O uso de manchas alternativas pode exigir precauções adicionais e disposição especializada do agente de coloração se for tóxico e / ou cancerígeno ( por exemplo , brometo de etidio).
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Resultados
Grandes quantidades de ARNt (UUU) podem ser obtidas expressando o gene de ARNt em E. coli sob o controle de um forte promotor de T7 indutível. O tRNA expresso (UUU) se acumula no citoplasma e é enriquecido sobre o conjunto de tRNAs naturalmente abundantes. Um processo de purificação em duas etapas consistindo em um passo de captura / extração e um passo de filtração / polimento de gel foi utilizado para obter o ARNt da classe EMSA. O passo de captura / extração usa pH 4.3 fenol .......
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Discussão
O teste de retardamento de gel de proteína-ARNt de agarose aqui descrito pode ser modificado de várias maneiras. Primeiro, a porcentagem de agarose no gel pode ser reduzida para permitir a separação e visualização de complexos proteína-ARNt significativamente maiores que os analisados aqui (120 kDa). Em segundo lugar, se a proteína alvo for termolábil, devem ser tomadas precauções adicionais para garantir que a temperatura seja mantida abaixo da temperatura máxima aceitável, movendo o aparelho de eletroforese para uma.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
MCV é membro do programa Intramural CIB "Molecular Machines for Better Life" (MACBET). A pesquisa que conduziu a esses resultados recebeu financiamento do Instituto Espanhol de Saúde Carlos III (PI12 / 01667 a MCV), o Ministério da Economia e Competitividade (CTQ2015-66206-C2-2-R e SAF2015-72961-EXP para MCV) ), O Governo Regional de Madri (S2010 / BD-2316 a MCV) e o Projeto ComplexINC (Contrato n.º 279039 a MCV) da Comissão Européia (Programa-Quadro 7 (FP7)). Os financiadores não tiveram papel no design do estudo, na coleta e análise de dados, na decisão de publicação ou na elaboração do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contém T7 polimerase após indução de IPTG. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confere resistência à ampicilina; T7. |
| Caldo LB, baixo teor de sal (caldo Lennox L), granulado | Melford | GL1703 | Caldo LB convencional, alto teor de sal, também pode ser usado. |
| Ampicilina | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubadora Shaker (Termostada) | NBS | Excella E24 | Qualquer incubadora agitadora com controle de temperatura pode ser usada. |
| Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), > = 99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Acetato de sódio, anidro, >99% | Melford | B4017 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), sal dissódico, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Nocivo se inalado. |
| Centrífuga (refrigerada) | Eppendorf | 5430 | |
| Rotor de centrífuga (refrigerada) | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrífuga | Sorvall | RC5C | |
| Rotor de centrífuga | Sorvall | SLA-3000 | |
| Solução de fenol, saturada com tampão citrato 0,1 M, pH 4,3 ± 0,2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Toxicidade aguda (oral, dérmica, inalatória), corrosivo |
| Absoluto de etanol para análise, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Fosfato de sódio dibásico di-hidratado, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Dihidrogenofosfato de potássio, KH2PO4 | Merck | 48.730.250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris (hidroximetil) aminometano HCl] | Melford | T1513 | |
| Ácido bórico | Melford | B0503 | |
| Microondas | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Cloridrato de Tris (2-carboxietil) fosfina] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosivo para metais e pele. |
| ATP [Adenosina 5′-trifosfato disódico sal hidratado], Grau I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Cloreto de magnésio (MgCl2), anidro, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Cloreto de sódio (NaCl), >99% | Fisher Biorreagents | BP358 | |
| Cloreto de potássio (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Fonte de alimentação | Consort | EV261 | |
| Unidade de eletroforese | Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe coloração de ácido nucleico | Laboratory | RBMSAFE | 20.000X estoque |
| Transiluminador UV (G: Box / EF) | Syngene | ||
| Coomassie Azul Brilhante G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Marca Fisher | 13214789 |
Referências
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.
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Reimpressões e permissões
