Artigo de método

Atuador baseado em células musculares cardíacas e auto-estabilizante Biorobot - Parte 2

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DOI:

10.3791/55643

9 de maio de 2017

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Neste estudo, um atuador biológico e um biorobot de natação auto-estabilizante com braços elastoméricos em cantilever funcionalizados são semeados com cardiomiócitos, cultivados e caracterizados por suas propriedades bioquímicas e biomecânicas ao longo do tempo.

Resumo

Nos últimos anos, foram desenvolvidos dispositivos híbridos que consistem numa célula viva ou componente de tecido integrado com uma espinha dorsal mecânica sintética. Estes dispositivos, chamados biorobots, são alimentados apenas pela força gerada a partir da atividade contrátil do componente vivo e, devido às suas muitas vantagens inerentes, poderia ser uma alternativa aos robôs convencionais totalmente artificiais. Aqui, descrevemos os métodos para semear e caracterizar um atuador biológico e um biorobot que foi projetado, fabricado e funcionalizado na primeira parte deste artigo em duas partes. O actuador biológico fabricado e os dispositivos biorobot compostos por uma base de polidimetilsiloxano (PDMS) e um cantilever de película fina foram funcionalizados para ligação de células com fibronectina. Após a funcionalização, os cardiomiócitos de ratos neonatais foram semeados no braço cantilever PDMS a uma densidade elevada, resultando numa folha de células confluentes. Os dispositivos foram visualizados todos os dias eo movimento do cantiBraços de alavanca foi analisada. No segundo dia após a semeadura, observamos a flexão dos braços em consola devido às forças exercidas pelas células durante as contrações espontâneas. Após análise quantitativa da dobra em cantilever, observou-se um aumento gradual no stress superficial exercido pelas células à medida que amadureciam ao longo do tempo. Da mesma forma, observamos o movimento do biorobot devido à atuação do braço cantilever PDMS, que atuou como uma aleta. Após a quantificação dos perfis de natação dos dispositivos, foram observados vários modos de propulsão, que foram influenciados pelo ângulo de repouso da barbatana. A direção do movimento e a freqüência de batimento também foram determinadas pelo ângulo de repouso da barbatana, e observou-se uma velocidade máxima de natação de 142 μm / s. Neste artigo, descrevemos o procedimento para preencher os dispositivos fabricados com cardiomiócitos, bem como para a avaliação do atuador biológico e atividade biorobot.

Introdução

Biorobots são dispositivos baseados em células vivas que são incorporados dentro de um backbone mecânico que é geralmente composto de materiais macios, elásticos, como PDMS ou hidrogéis 1 . As células sofrem contrações rítmicas, espontaneamente ou em resposta a estímulos, e assim funcionam como um atuador. A energia gerada a partir da célula de contração drives vários biorobots. As células do coração de mamíferos (cardiomiócitos) e as células do músculo esquelético são frequentemente utilizadas para a actuação biorobot devido às suas propriedades contrácteis. Além de cardiomiócitos e células musculares esqueléticas, foram utilizados outros tip....

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Protocolo

Todos os procedimentos aqui descritos foram realizados utilizando um protocolo aprovado e de acordo com os regulamentos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Notre Dame.

1. Semente e Cultura de Células

  1. Antes de iniciar, prepare os itens necessários: um pequeno funil, pipetas e meio de Eagle modificado Dulbecco morno (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico penicilina (DMEM completo).
  2. Tome frascos T-25 juntamente com o dispositivo funcionalizado (atuador biológico ou biorobot) dentro dele. Consulte a seção 4 da Parte 1 deste manuscrito em duas partes p....

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Resultados

O atuador biológico feito de um cantilever PDMS fino (25 μm de espessura) e cardiomiócitos constitui o núcleo do biorobot de natação, conforme mostrado na esquemática e captura de tela dos dispositivos na Figura 1 . As células começam a apresentar contracções após 24 h em cultura e a flexão dos braços em consola foi observada até ao dia 2. O perfil lateral do dispositivo foi registado todos os dias e o stress superficial foi quantificado a partir da dobra dos braços em c.......

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Discussão

O procedimento descrito aqui descreve um método de sementeira bem sucedido para actuadores e biorobots baseados em PDMS, o que facilita a ligação de cardiomiócitos. Além disso, foi descrito o processo de aquisição de imagem e a subsequente análise que caracteriza o comportamento das células eo desempenho dos dispositivos.

Observamos a contração espontânea de células nos braços cantilever após 24 h; A intensidade das contrações continuou a aumentar de forma constante ao longo do tempo e ating.......

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

MT Holley é apoiado pelo programa Graduate Fellows da Louisiana Board of Regents, e C. Danielson é apoiado pelo Programa de Professores do Instituto Médico Howard Hughes. Este estudo é apoiado pelo NSF Grant No: 1530884.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Produtos químicos e reagentes
Cardiomiócitos (células cardíacas primárias)Charles RiverNAIsolado de ratos Sprague Dawley neonatais de 2 dias de idade
Dulbecco' s águia modificada' s media (DMEM)Hyclone Laboratories16750-074com 4500 mg/L de glicose, 4,0 mM de L-glutamina e 110 mg/L de piruvato de sódio
Soro de Fetalclone IIIHyclone industries, GE16777-240Soro fetal de bovino (FBS)
Dulbecco' s tampão fosfato (PBS)Sigma-AldrichD1408-100ML
Penicilina-G sal de sódioSigma-AldrichP3032
Soro de cabraSigma-AldrichG9023
4,6-diamidino-2-fenilindol dihidrocolreto em pó (DAPI)Sigma-AldrichD9542
Fibronectina de plasma bovinoSigma-AldrichF1141Solução (1 mg/ ml)
Kit de calceína-AM e homodímero de etídio-1 (ensaio vivo/morto)Sondas molecularesL3224
Cálcio Fluo-4, AMMolecular ProbesF14217corante indicador de cálcio
Solução salina de TyrodesSolução tampãoSigma-AldrichT2397
Sondas molecularesPlurônicas F-127P3000MPsolução de surfactante não iônico-20% em dimetilsiloxano (DMSO)
Microscopia eletrônica15710do parafomaldeído de 16%Cuidado: Tritão irritante e combustível
x-100Sigma-AldrichX-100 100 mLde detergente de lise celular, (4- (1,1,3,3-Tetrametilbutil) fenil-polietilenoglicol, t-octilfenoxipolietoxietanol, polietilenoglicol éter terc-octilfenílico)
ProLong reagente antidesbotamento de ouroSondas molecularesP10144Agente de montagem
Alexa Fluor 594 PhalloidinMolecular ProbesA12381Marcador de filamento de actina
Cabra anti-coelho IgG (H + L) anticorpo secundário, Alexa Fluor 594 conjugadoSondas MolecularesA-11012
phaSondas MolecularesA-11001
Anti-conexina 43 anticorpoAbcamab11370Marcador de junção gap
Troponina anticardíaca I anticorpoAbcamab10231Proteína contrátil
16% solução de paraformaldeído de grau EMMicroscopia eletrônica100503-916
Polidimetilsiloxano (PDMS)ElsevierSylgard 184
Materiais e Equipamentos
CameraThor LabsDCC1545M
LED light tiraNANAQualquer LED branco sem emissão de espectro
Microscópio confocalNikkon C2NAMicroscópio confocal com conjunto de três filtros.
Lente de zoomInfinityModelo# 252120
Software
MatlabMathworksNAUsado na Seção 4) para análise de atuadores biológicos.
Imagem JNational Institute of HealthNASoftware de processamento de imagem baseado em Java. Usado na Seção 5) para análise de biorobôs.
Software gratuito de processamento e análise de imagens em java. (https://imagej.nih.gov/ij/)
Thor CamThor LabsNASoftware operacional da câmera

Referências

  1. Feinberg, A. W. Biological Soft Robotics. Annu. Rev. Biomed. Eng. 17, 243-265 (2015).
  2. Akiyama, Y., et al. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PLOS ONE. 7, 38274(2012).
  3. Herr, H....

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