Artigo de método

Dissecação do pâncreas Mouse para análise histológica e perfis metabólicos

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DOI:

10.3791/55647

⸱

19 de agosto de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, Miami University, 2College of Medicine, Central Michigan University

Neste artigo

Resumo

Este artigo de vídeo fornece uma demonstração detalhada das formalidades necessárias para remover com êxito o pâncreas de um rato por dissecação para análise histológica e perfis metabólicos.

Resumo

Nós temos investigado o fator de transcrição específico do pâncreas, 1a cre-recombinase; sarcoma de rato LOX-paragem-lox-Kristen, glicina, ácido aspártico no codão 12 (Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / +) cepa de rato como modelo de câncer no pâncreas humano. O objetivo dos nossos estudos atuais é identificar biomarcadores metabólicos romance de progressão do câncer pancreático. Efetuamos a criação de perfil metabólico de urina, fezes, sangue e extratos de tecido do pâncreas, bem como a análise histológica do pâncreas para encenar a progressão do câncer. O pâncreas de rato não é um órgão sólido bem definido como nos seres humanos, mas pelo contrário, é um tecido mole difusamente distribuído que não é facilmente identificado por indivíduos que não estão familiarizados com a anatomia interna do mouse ou por indivíduos que têm pouca ou nenhuma experiência realizando dissecções de órgão do rato. O objetivo deste artigo é fornecer uma detalhada step-wise demonstração visual para orientar noviços na remoção do pâncreas rato por dissecação. Este artigo deve ser especialmente valioso para estudantes e investigadores de novo à investigação que requer a colheita do pâncreas de rato por dissecação para criação de perfil metabólico ou análise histológica.

Introdução

O mouse tem emergido como um importante modelo animal de câncer no pâncreas humano1,2. No Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + modelo do rato, a Kristen oncogene de sarcoma (K-Ras) de rato é ativado exclusivamente no pâncreas, resultando em iniciação de lesões pré-cancerosas no pâncreas, conhecido como neoplasias intra-epitelial pancreáticas (PanINs), que o progresso para adenocarcinoma ductal do pâncreas, comumente referido como PDACs3. Este sistema de modelo do mouse fornece dentre os melhores modelos animais disponíveis para4,câncer de pâncreas humano5, com a vantagem adicional dos PanINs emergem dentro os primeiros cinco meses de vida e, frequentemente, progresso a PDAC dentro um único ano4,5, Considerando que o câncer de pâncreas ocorre mais frequentemente em humanos 60-70 anos de idade.

Extração do pâncreas por dissecação do Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + ratos em várias idades permite detalhado exame histológico longitudinal do desenvolvimento de câncer no pâncreas, desde os primeiros estágios de PanIN através da progressão PDAC3,4 , 5. colheita do pâncreas em idades que variam de cinco a quinze meses também pode ser usada para preparar o tecido extratos para caracterizar mudanças globais no metabolismo de4 pâncreas que ocorrem durante a transição de saudável para o tecido doente 6,7.

Este artigo apresenta um guia visual completo das etapas necessárias para realizar uma extração de pâncreas de rato e fornece diretrizes para o armazenamento de um pâncreas para posterior análise. Este guia será igualmente valioso para indivíduos realizando pesquisa sobre outras doenças do pâncreas, incluindo diabetes tipo e devem ser especialmente útil para estudantes e investigadores novos para pesquisas envolvendo a colheita do pâncreas de rato usando dissecação para criação de perfil metabólico ou análise histológica.

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Protocolo

os procedimentos realizados no vídeo e descritos a seguir foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) na Universidade de Miami e institucional Cuidado Animal.

1. preparação e estímulo teste

  1. estabelecer duas áreas distintas para o procedimento cirúrgico, mesa de operações e a tabela de pós operação. Estágio de ambas as áreas com todos os materiais e utensílios necessários. Tabela de
    1. fase a operar sob uma capa exalada. Organizar a mesa com o equipamento de uma forma que permite o desempenho contínuo e sem entraves do processo.
    2. Estabelecer uma tabela pós-operatória na mesma sala e perto da mesa principal da operação. Manter ambas as tabelas como ambientes estéreis durante o procedimento.
  2. Lugar o seguinte fornece na mesa de operações: um frasco com tampa, um tubo de 15 mL, um par de tesouras cirúrgicas, uma garrafa de etanol a 70%, duas placas de espuma, duas pinças, duas seringas de calibre 1 mL 21, dois tubos de 50 mL, tubo de centrifugação de uma , um frasco criogênico, quatro almofadas cirúrgicas, dez pinos, um distribuidor de toalhetes esterilizantes e um recipiente de objectos cortantes.
  3. Coloque o seguinte material na mesa de pós operação: uma balança analítica, um 4 L dewar de nitrogênio líquido, uma rasa grande boca dewar, um rack de microtubo flutuante, um par de tesouras cirúrgicas, pinças de dois, quatro frascos criogênicos e um dispensador de Toalhetes esterilizados.
  4. Preencher um de 50 mL e um tubo de 15 mL, volume 75% com formalina.
  5. Usando um alfinete em cada esquina, apor um bloco cirúrgico para uma placa de espuma de aproximadamente 30 cm x 30 cm para servir como o tabuleiro de dissecação. Use os restantes quatro pinos durante a operação. Preparar uma placa de espuma menor com um bloco cirúrgico para transferir os órgãos à tabela pós-operatório.
    Cuidado: Isoflurano (99,9%) é um químico do tóxico e deve ser usado em uma capa do respiradouro para garantir o máximo nível de segurança da eliminação de resíduos de gás anestésico 8. Informações adicionais sobre os riscos para os pesquisadores associados com o uso do método aberto-gota utilizando isoflurano podem ser encontradas em um artigo por Taylor e Mook 8.
  6. Colocar um bloco cirúrgico, o frasco de vidro e embeba com algumas gotas de isoflurano (99,9%) e coloque um papel toalha por cima para evitar o contato direto do mouse com o isoflurano. Da mesma forma, use um bloco cirúrgico para o restante do tubo de linha e mergulhe com algumas gotas de isoflurano e coloque uma almofada adicional por cima para evitar o contato direto entre o rato e o isoflurano.
  7. Pour nitrogênio líquido na boca larga superficial dewar até o máximo preencher linha é alcançado.
  8. Lugar o mouse selecionado para dissecção para a anestesia de câmara, ou seja, o frasco de vidro com um pad embebido com algumas gotas de isoflurano (99,9%) coberto com a tampa, para ~ 1 min.
    Nota: Esse tempo varia de rato de rato. Uma vez que o mouse é inconsciente, removê-lo da câmara e colocá-lo no quadro de funcionamento.
  9. Oriente do mouse para que o lado ventral é uma mentira e com sua cabeça apontada longe o cientista. Coloque a cabeça dentro do tubo alinhado com um bloco cirúrgico embebido com algumas gotas de isoflurano (99,9%) e executar um teste de estímulo uma pitada de pé para garantir que o mouse não responde a estímulos.
    1. Se este teste falha e o mouse responde para o teste do beliscão de pé, repita o passo 1.8.

2. Inicial de incisão, punção de coração e eutanásia

  1. Pin dos membros do rato para a placa de espuma cirúrgica e molhado do lado ventral do mouse com etanol a 70%.
  2. Aperte a pele/pele perto da abertura uretral com pinça e puxe ligeiramente para cima. Fazer uma incisão com a tesoura cirúrgica através da cavidade abdominal a partir da linha mediana, a abertura uretral e terminando no queixo.
    1. Perto de ponto de partida da incisão inicial, pegue um dos lados da pele/pele com a pinça e fazer outra incisão com a tesoura para baixo e na diagonal em direção a pata traseira.
    2. Repetir isto da mesma maneira do lado oposto.
      Nota: A pele/pele pode ser fixada para baixo para criar uma abertura mais larga, mas não é necessária.
  3. Localizar o coração e remover o pericárdio, que é o saco em torno do coração, para evitar entupimento da agulha da seringa.
    1. Segure o pericárdio com a pinça e cortar com a tesoura. Realizar a punção do coração inserindo cuidadosamente a agulha da seringa o coração e comece a retrair o êmbolo lentamente.
    2. Para coleta de sangue ideal, utilize o êmbolo da agulha para imitar a ação de bombeamento do coração e evitar desenhar rapidamente.
      Nota: Normalmente cerca de 1 mL de sangue pode ser coletado.
    3. Depois de concluir a coleta de sangue, dissipar o sangue no tubo de centrífuga e descarte a seringa no recipiente de objectos cortantes.
    4. Depois que é feita a punção do coração, realizar eutanásia removendo os anexos conectando o coração.
      Nota: Heparina, um anticoagulante, não foi adicionada à seringa neste procedimento antes da punção do coração para permitir que o sangue a coagular para coleta de soro neste estudo específico. No entanto, se o pesquisador quis evitar a coagulação de sangue para coleta de plasma, heparina pôde ser adicionada à seringa antes da punção do coração.
  4. Se o estudo envolve a determinação do genótipo do rato, cortar uma parte da orelha com a tesoura e coloque em um tubo de centrífuga para uma verificação de genótipo.

3. extração do pâncreas

  1. localizar o estômago do lado esquerdo do mouse. Comece suavemente (a fim de evitar rasgar) Separe o pâncreas do estômago e duodeno, utilizando duas pinças.
    Nota: Quando desconectar o pâncreas do estômago e intestinos, é muito importante que a pinça é usada suavemente para guiar o tecido do pâncreas longe os órgãos e para não esmagar ou rasgar o pâncreas com a pinça.
    1. Continuar a separar o pâncreas das seções intestino delgado jejuno e íleo e por último do ceco do intestino grosso.
  2. Para o ceco, reposicionar o fórceps e continuar a separação do pâncreas ao longo do cólon restante no sentido reto.
    Nota: Neste ponto, é conveniente cortar e remover a parte do estômago para a região do cólon imediatamente anterior do reto.
  3. Localizar o pâncreas e baço em anexo. Deslize o pâncreas para o lado direito do mouse. Separe as restantes ligações entre o pâncreas e a cavidade torácica com a pinça para retirar totalmente o pâncreas e o baço conjugado.
  4. Remover o pâncreas e espalhá-lo para exame. Deixe o baço anexado ao pâncreas para fins de identificação.
    1. Remover todos do tecido conjuntivo, tecido gordo e mesentérico do pâncreas.
      Nota: Este tecido é mais branco na cor e, portanto, pode ser facilmente distinguido do tecido do pâncreas é mais rosado na cor. Isto é particularmente importante se o pâncreas inteiro precisa ser removido. Por exemplo, se o pâncreas precisa ser pesado e em relação ao peso corporal, ou entre grupos de animais. No Ptf1a cre / +; LSL-Kras G12D / + modelo do rato, especificamente nos meses mais velhos, difícil fibroso tecido pancreático poderia estar presente. Neste caso, a remoção cuidadosa do pâncreas deve ser conduzida como os intestinos podem ser entrelaçados no tecido do tumor. Em casos avançados, baço anormal e tecido do fígado podem também estar presentes.
  5. Se desejado, remover outros órgãos neste ponto.

4. coleta de dados e armazenamento

  1. após a extração dos órgãos, mover as amostras para a área de pós-operatório para preservação.
  2. Pesar cada órgão e colocá-los em seus respectivos frascos criogênicos.
    Nota: ao longo de sagacidadeh a massa de cada amostra, as irregularidades devem ser registadas para referência futura.
  3. Uma vez que os órgãos são pesados, colocá-los para o nitrogênio líquido para congelamento de snap.
  4. Após snap congelando, armazenar os órgãos a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.
  5. Colocar as amostras de formalina armazenada na parte superior do banco durante a noite, e na manhã seguinte alterar sua solução de formalina para etanol a 70%.
    Nota: Estas amostras devem ser armazenadas a 4 ° C para armazenamento a longo prazo.
  6. Para o armazenamento de longo prazo, congelar o ponche de sangue e orelha a-80 ° c... Para coleta de soro do sangue, permitir que o sangue a coagular por 30 min, em seguida, centrifugá-lo. Remover a porção de soro com uma pipeta e armazene-o em seguida a -80 ° C.

5. Clean Up

  1. Sanitize a dissecação todas as ferramentas com as toalhitas esterilizantes. Tampa do tubo alinhado com o isoflurano embebido bloco cirúrgico. Substitua o bloco cirúrgico sobre a placa de espuma com um bloco cirúrgico novo. Elimine as porções do mouse que não foram coletadas pela facilidade ' política de eliminação de animais de s.

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Resultados

A Figura 1 mostra uma visão geral da área de ambiente operacional e a Figura 2 mostra a área de operação do post. Enquanto essa configuração fornece a quantidade mínima de equipamentos e preparo, os indivíduos podem optar por alterar isto para melhor atender as necessidades individuais. O protocolo deve ser otimizado de acordo com as necessidades específicas da experiência. Este procedimento é realizado de uma forma que termina a...

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Discussão

Importância no que diz respeito a métodos existentes
Enquanto existem outros vídeos informais de dissecções de rato, este artigo de vídeo fornece a primeira qualidade profissional, par-revistos, demonstração visual de todas as etapas detalhadas necessárias para extração e colheita do pâncreas rato por dissecação10 . Com o pâncreas é um órgão principal para a atividade metabólica e insulina produção, dissecção e colheita do pâncreas permite a preservação das características fisi...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

MAK reconhece apoio para este trabalho a partir do National Institutes of Health / número - 1R15CA152985-01A1 de concessão do National Cancer Institute. Este projeto também foi apoiado pela Miami University graduação prêmio programa de pesquisa, as oportunidades de doutorado-graduação de Universidade de Miami para programa de bolsas e o programa de estudiosos de Verão de Universidade de Miami.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Jarra de Vidro Corning3140-150O frasco de vidro usado no vídeo foi descontinuado.  Este é o seu substituto.
Tampa do Frasco de VidroCorning9985-150A tampa do frasco de vidro usada no vídeo foi descontinuada.  Este é o seu substituto.
Tubos Falcon de 15 mLTesoura Cirúrgica Fisher Scientific339650
Fisher Scientific9201
 Fisher Scientific03-409-10DD
100% EtanolFisher Scientific22-032-103
FormalinaFisher Scientific245-684
Placas de EspumaTherapak562908
FórcepsFisher Scientific200205SHN
1 mL 21G SeringasBD Biosciences309624
Tubos Falcon de 50 mLFisher Scientific339652
Tubos de Microcentrífuga de 2.0 mL Fisher Scientific02-681-258
Almofadas CirúrgicasFisher ScientificS67011
T-Pins Comprimento:  2" Produtos da Loja AdvanceX32T-05
Toalhetes EsterilizantesDescartáveis Profissionais Internacional Inc.Q85084
Recipiente para Objetos CortantesFisher Scientific14-827-122
Balança AnalíticaMarshall ScientificME-AE200
4L DewarTaylor-Wharton4LD
Larga Rasa DewarFisher ScientificF3087-V
Rack de Microtubo FlutuanteVWR60986-100
Frasco Criogênico 1.2 mL, EstérilFisher Scientific10-500-25
Isothesia (Isoflurano) Henry Schein Saúde Animal050033
Nitrogênio LíquidoWright BrothersNIT-60-XX
Cepa Kras de CamundongoThe Jackson LaboratoryOO8179
Cepa Cre de CamundongoMMRRCOOO435-UNC
Garrafa de aperto Boca

Referências

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