Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Summary

Apresentamos uma solução de software para o rastreamento semi-automatizado da concentração relativa de proteína ao longo do comprimento de protrusões celulares dinâmicas.

Abstract

Filopodia são protrusões celulares dinâmicas, semelhantes a dedos, associadas à migração e à comunicação célula-célula. Para entender melhor os complexos mecanismos de sinalização subjacentes à iniciação filopodial, alongamento e posterior estabilização ou retração, é crucial determinar a atividade da proteína espaço-temporal nessas estruturas dinâmicas. Para analisar a função de proteína em filopodia, desenvolvemos recentemente um algoritmo de rastreamento semi-automatizado que se adapta às mudanças de forma filopodial, permitindo análises paralelas da dinâmica de protrusão e da concentração relativa de proteína ao longo de todo o comprimento filopodial. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo detalhado para otimizar o gerenciamento de células, a aquisição de imagens e a análise de software. Além disso, fornecemos instruções para o uso de recursos opcionais durante a análise de imagem e representação de dados, bem como diretrizes de solução de problemas para todos os passos críticos ao longo do caminho. Finalmente, também incluímos uma comparação do dEscreveu software de análise de imagem com outros programas disponíveis para quantificação de filopodia. Juntos, o protocolo apresentado fornece uma estrutura para análise precisa da dinâmica de proteínas em protrusões filopodiais usando software de análise de imagem.

Introduction

O controle espaço-temporal das proteínas reguladoras da actina está associado à dinâmica do filopodium ^{1 , 2} . O rastreamento da concentração de proteína resolvida espacialmente ao longo do comprimento todo filopodial através do tempo é, portanto, crucial para avançar a nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à iniciação, alongamento, estabilização ou colapso dessas estruturas dinâmicas ^{3 , 4} . Ao contrário da análise de proteínas no citossolo, onde muitas mudanças de formas de células ocorrem em uma escala maior, filopodia são micro estruturas dinâmicas que constantemente se curvam ⁵ e se dobram, impedindo a análise usando uma abordagem simples, como uma varredura de linha.

Diferentes soluções de software para rastrear a forma filopodial estão disponíveis ^{6 , 7 , 8 , 9} . LikewIse, software para o rastreamento ratiométrico da dinâmica das proteínas dentro do corpo celular foi desenvolvido ^{10 , 11} . Para combinar o rastreamento automatizado da forma filopodial e da análise da proteína espaço-temporal, recentemente desenvolvemos um software de análise de imagem baseado no algoritmo convexo-casco ¹² . Este novo método de análise, que é operado através de uma interface de usuário gráfica (GUI), combina pela primeira vez, a concentração relativa de proteína ao longo do comprimento filopodial e da velocidade de crescimento, permitindo assim a medição precisa da distribuição da proteína espaço-temporal independente do movimento desses Estruturas dinâmicas ¹² .

A idéia por trás do software (o código fonte está disponível gratuitamente, veja abaixo) é que um dos vértices do casco convexo coincidirá com a ponta do filopodium ( Figura 1A ). Ao olhar para o quadro subsequente paraO vértice mais próximo do casco convexo, a dica móvel pode ser rastreada em todo o filme. Uma vez que a ponta é detectada em cada quadro, sua posição é usada para desenhar um eixo juntando a ponta com um ponto de referência na base do filopodium ( Figura 1B ). Finalmente, o uso de pontos nodais equidistantes, cujas posições são determinadas pelo pixel médio com intensidade máxima ao longo da linha ortogonal ao eixo, são usados ​​para determinar uma espinha dorsal que segue a forma filopodial. Aproveitando esse backbone adaptativo, é gerado um kymograph para rastrear o crescimento filopodial e as concentrações de proteína para até três canais ao longo do comprimento filopodial ( Figura 1C ).

Figura 1: Princípio de Trabalho do Software de Análise de Imagem. ( A ) O algoritmo por tráso software. No Passo 1, o usuário especifica a referência (base) e o vértice (a ponta) do filopodium. Na Etapa 2-1, a espinha dorsal do filopodium é obtida usando o pixel médio com valor de intensidade máxima. Na Etapa 3, a espinha dorsal é usada para o perfil de intensidade da proteína espacial. Na Etapa 2-2, o software acompanha automaticamente a ponta no quadro subseqüente. Todo o procedimento itera. ( B ) Instantâneo do algoritmo com filopodium real que apresenta elementos importantes, como o casco convexo que está sendo usado para o rastreamento. ( C ) Visão geral dos parâmetros que podem ser medidos com o algoritmo. Esta figura foi modificada a partir da referência ¹² . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

O software de análise de imagem é operado no Matlab (conhecido como software de programação) por meio de um uso gráficoR interface. Para maximizar a flexibilidade e a robustez para a configuração experimental particular, o usuário pode ajustar uma série de parâmetros de rastreamento ( por exemplo, ângulo de flexão permitido e movimento entre moldura) e também fazer algumas correções nos filmes ( por exemplo , corte, rotação, remoção de objetos indesejados) ( Figura 2A e Tabela 1) .

GUI	Não.	Obrigatório	Descrição					Nome (em GUI)
# 1	1a	Y	Carregando o arquivo .tiff empilhado que representa o corpo da célula (com caixa marcada) ou crie o corpo celular sobreposto a partir de canais					Corpo celular
# 1	1b	Y		Proteína 1
# 1	1c	Y	Carregando arquivo de imagem empilhado correspondente à proteína 2					Proteína 2
# 1	1d	Y	Carregando arquivo de imagem empilhado correspondente à proteína 3					Proteína 3
# 1	1e	N	Redefine tudo para arquivos de imagem empilhados pré-carregados					Restabelecer
# 1	2a	Y	Barra de rolagem para determinar a moldura inicial para análise na janela GUI # 2					N / D
# 1	2b	Y	Barra de rolagem para determinar o quadro final para análise na janela GUI # 2					N / D
# 1	2c	Y	Barra de rolagem representando curdaQuadro nt					N / D
# 1	2d	N	O valor cinza dos pixels abaixo do qual todos os pixels serão definidos como zero					N / D
# 1	2e	N	O valor cinza dos pixels acima do qual todos os pixels serão definidos como valores máximos					N / D
# 1	2f	N	Defina os valores de intensidade dos pixels especificados em <2e> & <2f>					Conjunto
# 1	2g	N	Jogue o filme ajustado pela intensidade					Toque
# 1	2h	N	Cortar imagem					Colheita
# 1	2i	N	Girar imagem					Girar
# 1	2j	N	Eliminar regiões na pilha inteira					Eliminar regiões
# 1	3a	Y	Clique para abrir a 'Janela de análise' (janela GUI # 2)					Janela de rastreamento
# 1	3b	Y	Digite o tamanho de um pixel em microns					Digite o tamanho do pixel
# 2	4	Y	Clique para gerar a imagem limite / borda do corpo celular sobreposto					fronteira
# 2	5	Y	Clique para selecionar a base e a ponta do filopodia					Referernce
# 2	6a	Y	Digite o número de segmentos ou nós					Número de segmentos
# 2	6b	Y	Digite o comprimento da varredura (perpendicular ao eixo)					Largura de digitalização
# 2	6c	Y	Digite o comprimento acima do qual o filopodia começa a dobrar					Precise Meas after
# 2	6d	Y	Digite o raio do círculo de detecção da ponta (ou seja, a área onde o vértice pode ser localizado no próximo quadro)					Radius of tip detection
# 2	6e	Y	Insira o ângulo máximo que o filopodium pode dobrar do eixo vertical					Limiar de ângulo
# 2	6f	N	Adicione pontos de referência para a base e a dica para esse quadro específico					Selecione referência
# 2	6 g	N	Digite o comprimento acima do qual o filopodia começa a dobrar esse quadro específico					Precise Meas after
# 2	6h	N	Digite o raio do círculo de detecção para esse quadro específico					Radius of tip detection
# 2	6i	N	Depois de inserir todos os parâmetros para o quadro específico, clique para armazenar os valores na memória e no arquivo para referência adicional					Adicionar
# 2	6j	N	Clique para excluir os parâmetros manualmente configurados para essa moldura					Excluir
# 2	6k	N	Clique para excluir todos os parâmetros armazenados manualmente usando o "painel de recursos opcionais" para todos os quadros					Restabelecer
# 2	6l	N	Verifique antes de rastrear para armazenar todos os resultados de rastreamento na memória para futuras referências					Traço de história
# 2	7	Y	Clique para iniciar o rastreamento					Acompanhar e Analisar
# 2	8a	N	Clique para iniciar o rastreamento da intensidade do canal protéico					Analisar Intensidades de Proteínas
# 2	8b	N	Verifique para rastrear a intensidade do canal protéico ao longo do comprimento filopodial					Filopodias inteiras
# 2	8c	N	Verifique o rastreamento da proteína de referência ou proteína A					ProteinA
# 2	8d	N	Verifique o rastreamento da proteína B					ProteinB
# 2	8e	N	Verifique o rastreamento da proteína C					ProteinC
# 2	8f	N	Cheque para rastrear a intensidade média da proteína naE dica					Ponta principal
# 2	8g	N	Digite o comprimento da dica					Comprimento da ponta
# 2	8h	N	Digite a distância mínima da base acima da qual a ponta começa a formar					limite
# 2	8i	N	Clique para salvar os resultados da análise de ponta líder para arquivar					Botão de apertar
# 2	9a	N	Clique para iniciar a análise da proteína ratiométrica					Comparar
# 2	9b	N	Verifique para comparar a proteína B com respeito a A					Log10 (B / A)
# 2	9c	N	Verifique para comparar a proteína C em relação a A					Log10 (C / A)
# 2	9d	N	Verifique para comparar a proteína B com respeito a A na ponta					Log10 (B / A)
# 2	9e	N	Verifique para comparar a proteína C com respeito a A na ponta					Log10 (C / A)
# 2	10a	N	Escolha outro mapa de cores (padrão: Jetplot)					Mapa de cores
# 2	10b	N	Edite o mapa de cores					Editar o mapa de cores

Tabela 1: Visão geral de todas as funções presentes na GUI Windows # 1 e # 2.

Uma vez que isso é realizado, o programa cria um casco convexo e rastreia automaticamente a dica ao longo do filme. Parâmetros extraídos do filme, como um kymograph ratiométrico, velocidade de crescimento e comprimento filopodial aÉ exibido e também armazenado na pasta de trabalho como imagens e como arquivos de dados. Outros parâmetros, tais como vida útil filopodial, taxa de crescimento e taxa de retração, podem então ser extraídos e analisados ​​a partir dos arquivos de dados armazenados ( Figura 2B ).

Figura 2: Interface gráfica do usuário para usar o software de análise de imagem. ( A ) GUI Janela # 1 é usada para carregar e processar imagens. O programa pode carregar até 3 canais de proteína, pelo que 2 canais são comparados em par. A janela vem com características obrigatórias (azuis) e opcionais (verde) para pré-processamento das imagens antes do rastreamento ( B ) GUI A Janela # 2 é usada para rastrear análises de proteínas filopodium e spatio-temporais e métricas. Novamente, os recursos opcionais estão marcados em verde. Esta figura foi modificadaDa referência ¹² . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para preparação de amostras e manipulação de software. Começamos com instruções detalhadas sobre cultura de células e aquisição de filmes otimizados para análise de imagens. Esta seção sobre aquisição de dados é seguida por uma descrição detalhada para operar o software de análise de imagem. Ao longo do protocolo, apresentamos etapas críticas e recursos opcionais que devem ser considerados ao coletar e processar dados. Finalmente, analisamos filopodia de sistemas modelo diferentes com o software de análise de imagem, antes de fechar com uma comparação do software de análise de imagem descrito com outros programas disponíveis para quantificação filopodial e uma discussão sobre limitações e direção futura.

Protocol

1. Cultura celular

1. Cultura HeLa ou células COS no Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g / L de D-glucose, L-alanina-L-glutamina dipeptídico, piruvato, 10% de soro bovino fetal e 10 unidades / ml de penicilina / estreptomicina. Os neurônios culturais em meios culturais sem L-glutamina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, suplementados com 0,5-diperptídeo L-alanina-L-glutamina, suplementos neuronais sem soro e 10 unidades / ml de penicilina / estreptomicina.
2. Uma vez que se alcança 40% de confluência, transfira células com construções de escolha usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha as células transfectadas na incubadora a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 15-18 h.
3. Para reduzir as alterações no pH e na osmolaridade (devido à evaporação) durante a aquisição da imagem, encha as câmaras de cultura de células (antes da imagem) até 90% com meio pré aquecido a 37 ° C contendo 20% de 4- (2-hidroxietil) -1 -piperazino-etossulfónico (HEPES). SelarNa tampa, aplique uma fina camada de graxa de vácuo no interior da tampa e pressione-a suavemente sobre a câmara de cultura que contém as células transfectadas.

2. Aquisição de imagens

NOTA: O comprimento do filopodia varia de 2-10 μm ¹³ . Filopodia cresce a uma velocidade média de 0,05-0,1 μm / s ^{13 , 14} .

1. Adquira imagens usando um microscópio com objetivo 60X ou 100X e sem binário de pixels (aqui, um microscópio confocal de disco giratório). Use taxas de aquisição superiores a 1 Hertz (Hz) para rastrear a dinâmica filopodial. Para minimizar os artefatos fora de foco, imagens filopodia perto da membrana basal ( ou seja , superfície do substrato).
2. Para garantir um rastreamento suave, ajuste o tempo de exposição da câmera e a intensidade do laser, de modo que a relação sinal / ruído (SNR) seja maior que 4. Evite a saturação de canais individuais ( ou seja, valores de pixels de255 para imagens de 8 bits e 65,535 para imagens de 16 bits), pois isso impedirá a análise de imagem subseqüente.
3. Para evitar o sangramento, use apenas etiquetas de fluorescência compatíveis com linhas laser e filtros do microscópio (para detalhes veja a referência ¹⁵ ).

3. Pré-processamento de imagem

NOTA: Use ImageJ ou outro software disponível para pré-processar imagens ^{16 , 17} .

1. Se a amostra estiver em movimento, corrija a deriva lateral usando o software disponível ( por exemplo, https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) antes da análise. Exclua filmes com deriva axial (ou seja, movimento em direção z).
2. Fundo correto ( ou seja, valores de cinza de áreas fora da célula), branqueamento ( ou seja, perda contínua, se a intensidade de fluorescência devido ao dano a proteínas de fluorescência) e possíveis cortes de sangramento ( ou seja, sinal de uma gripeSonda de orescência nos dois canais) usando o software disponível ( por exemplo, http://imagej.net/Category:Plugins e ^{16 , 17} ).
   Nota: as intensidades de fluorescência dos canais individuais não são alteradas pelo software.
3. Para garantir a análise de imagem subsequente, guarde os filmes correspondentes a canais específicos de proteínas em escala de cinza como formato de arquivo empilhado '.tiff' na pasta de trabalho.
   NOTA: As dimensões (tamanho, comprimento) das pilhas devem ser iguais para todos os canais.

4. Análise de imagem - Etapa 1: carregar imagens

NOTA: O software descrito aqui foi escrito em Matlab (conhecido como software de programação) e será executado somente com este programa.

1. Baixe a pasta compactada contendo todos os arquivos necessários para análise de imagens a partir do seguinte site: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwestamos/. Descompacte e copie arquivos na pasta de trabalho.
2. Uma vez instalado, abra o software de programação e execute 'filopodiaAnalysisM3.fig'. GUI Window # 1 irá abrir como mostrado na Figura 2A .
3. Carregue os arquivos ".tiff" empilhados salvos correspondentes a uma proteína específica de interesse na GUI Window # 1 usando os botões <1b> para a proteína A, <1c> para a proteína B, <1d> para a proteína C. Veja a Figura 2 e a Tabela 1 para detalhes.
   NOTA: A Proteína A mostrada na GUI A Janela # 1 atua como o canal de referência para a análise ratiométrica final.
4. Crie uma imagem superpuesta da célula a partir dos canais de proteína clicando em <1a>.
5. Clique em <2a> para atribuir o primeiro quadro e <2b> para o último quadro usado para análise.
6. Opcionalmente, coloque a região de interesse (ROI) contendo o filopodium de interesse usando o botão <2h>, gire a imagem.Toque o botão <2i> ou elimine regiões indesejadas usando a ferramenta de desenho de mão livre <2j>.
   NOTA: Para simplificar a análise de imagens, recomenda-se isolar o ROI ( isto é , cortar, girar, excluir) juntamente com as outras etapas de pré-processamento (resta, correção de branqueamento, etc.) usando o ImageJ.
7. Mova o controle deslizante <2c> para cada quadro para controle de qualidade e verifique se o filopodium permanece claramente visível durante todo o filme.

5. Análise de imagem - Etapa 2: gerar rastreamento

1. Clique no botão <3a> na Janela GUI # 1 para abrir a janela GUI # 2 (veja a Figura 2B ).
2. Clique no botão <4> na Janela GUI # 2 para gerar a máscara do corpo celular sobreposto (gerado na Janela GUI # 1 depois de clicar em <1a>). O programa também gera o limite da máscara, onde o casco convexo é implementado para obter os vértices.
3. CliBotão ck <5>; Um cursor aparecerá. Use o cursor para selecionar a base (de onde a distância da ponta filopodial é medida) seguida pela ponta do filopodia no quadro onde aparece pela primeira vez. Para fazer isso, mova o controle deslizante na janela # 2).
   NOTA: Para minimizar erros na saída de dados, coloque o ponto base verticalmente abaixo da ponta filopodial ao longo do eixo. Posicionar o ponto base em outros locais ( por exemplo, deslocados lateralmente) pode introduzir uma polarização direcional em valores de fluorescência dentro do corpo da célula.
4. Selecione o comprimento do limiar (acima do qual o filopodia se dobrará) usando <6c>.
   Nota: Este comprimento é definido como a distância entre o ponto base (selecionado usando <5>) e o limite do corpo da célula ( ou seja, a região de onde o filopodia começa a crescer). A distância é medida é em pixels.
5. Especifique o número de segmentos usados ​​para aproximar a forma do filopodia na caixa <6a>.
   NOTA: o mO número mínimo de segmentos depende do comprimento máximo alcançado pelo filopodium, mas também como o filopodium se dobra. Não selecione um número de segmentos maiores do que o número de pixels entre a base e a ponta ( ou seja, o comprimento do limiar). Selecionando mais segmentos do que o limite definido na etapa 5.4. ( Ou seja, o número de pixels entre a base e a ponta) resultará em uma superestimação do comprimento do filopodium.
6. Especifique a largura da varredura, que atua como scanner horizontal para colocar os nós, em <6b>.
   NOTA: Estes nós são usados ​​pelo programa para ajustar a linha que une a base e a ponta com o corpo do filopodium ( ou seja, para criar a espinha dorsal). Como ponto de partida, coloque um valor em pixels igual ao comprimento máximo multiplicado por um fator de .
7. Especifique o raio de varredura (em pixels) na caixa <6d>. Use um valor que é aproximadamente 50% maior do que o obServido deslocamento da ponta entre moldura.
   NOTA: Usar um raio de varredura muito grande pode pegar os pontos do casco convexo indesejados em quadros onde não existe uma dica filopodial real ( por exemplo , movimento fora do plano ou SNR baixo).
8. Especifique o ângulo de flexão na caixa <6e>.
   NOTA: O limiar de ângulo é determinado pelo ângulo máximo que o filopodium está dobrando durante toda a análise. Especificar o limite de ângulo ajuda o software a excluir o rastreamento de estruturas indesejadas que crescem do lado da filopodia quando o filopodia se dobra em direção ao corpo celular. O programa funciona de forma confiável para filopodia com ângulos basculantes inferiores a 45 graus do eixo vertical.
9. Para iniciar o rastreamento, clique no botão na janela GUI # 2. Clique na caixa "Histórico rastreio" na GUI Janela # 2 para salvar todo o protocolo de rastreamento para futuras referências.
   NOTA: Após o procedimento de rastreamento ser concluído, o comprimento do filopodium em cada quadro é armazenado emA folha chamada 'length_vel' de 'dynamics.xlsx' para futuras referências. Da mesma forma, todos os outros parâmetros de rastreamento são armazenados na folha denominada 'parameters' de 'dynamics.xlsx'.
10. Opcionalmente, se o filopodia não for detectado automaticamente em todos os quadros, use as seguintes etapas para corrigi-lo manualmente.
    1. Visite o respectivo quadro usando o controle deslizante na Janela # 2 e selecione manualmente a ponta do filopodium.
       Nota: Os quadros, onde nenhum ponto convexo do casco são detectados, serão representados por uma região azul na janela de rastreamento da janela GUI # 2. É obrigatório verificar o botão 'Histórico rastreio' antes que o programa de rastreamento fosse iniciado para acessar as coordenadas nodais nesse quadro.
    2. Selecione os pontos de referência (base seguido de dica) usando <6f> na janela da GUI # 2. Especifique os outros parâmetros, como "comprimento da varredura", "Medição precisa após" e "ângulo de flexão máximo"; Para esse quadro como descrito nos passos 5.4-5.8.
    3. Clique no botão <6i> para salvar os novos parâmetros (específicos desse quadro). As etapas devem ser repetidas para todos os quadros indicados pela região azul.
    4. Quando terminar, reinicialize o procedimento de rastreamento usando <7>.
       NOTA: Esta correção também pode ser usada se o programa mudar repentinamente de um filopodial para outro dentro de um filme. Como alternativa, considere cortar filmes que contenham filopodios múltiplos.

6. Análise de Imagem - Passo 3: Análise de Proteínas Spatio-temporais

1. Para a análise espaço-temporal, selecione a caixa representada por <8b> seguida do canal de proteína de interesse (<8c> e / ou <8d> e / ou <8e>).
   Nota: É obrigatório selecionar Proteína A antes da análise ratiométrica (<9a>, <9b> e / ou <9c>), pois a Proteína A é usada como referência.
2. Clique em <8a>Para iniciar o rastreamento de proteínas ao longo do comprimento filopodial usando o traço gerado no passo 5.9.

7. Análise de imagem - Etapa 4: análise de proteína métrica

1. Marque a caixa <9b> ou <9c> e clique no botão <9a> para obter o gráfico ratiométrico espaço-temporal.
   NOTA: Para evitar a falsa representação da concentração relativa de proteína, a imagem ratiométrica não é plotada como X / Y, mas como log (X / Y). Para uso futuro, o gráfico ratiométrico é exportado em arquivos de formato '.png' e '.fig', e os dados do gráfico em bruto são armazenados no arquivo 'dynamics.xlsx'.

8. Análise da imagem - Passo 5: Análise de ponta filopodial

1. Marque a caixa <8f> e especifique o comprimento da ponta e o comprimento do limiar da base usando <8g> e <8h>. Clique em para salvar dados no arquivo 'dynamics.xlsx'. Clique em para gerar oRastro de intensidades de proteína da ponta filopodial e para economizar para análise ratiométrica.
   NOTA: O comprimento da ponta determina o número de pixels na ponta utilizada para a análise. O software retornará o valor de intensidade média dos pixels na ponta sobre cada quadro. O comprimento do limiar determina a distância mínima da base à ponta acima da qual o filopodium (ponta filopodial) começa a crescer (e quando o programa começa a rastrear o valor da intensidade da ponta). Portanto, o comprimento da ponta deve ser menor do que o comprimento do limiar.
2. Clique na proporção desejada a ser analisada usando <9d> ou <9e>.
3. Clique no botão de comparação <9a> para gerar os dados ratiométricos.

Results

Usando células COS transfectadas com um marcador para a actina filamentosa (f-tractin ¹⁸ , vermelho) e uma referência citosólica (verde), encontramos protrusões filopodiais ricas em actina ( Figura 3A , painel superior). As séries temporais mostraram que os filopodios se estendiam e retraíam rapidamente ( Figura 3A , painel do meio). Usando o software de análise de imagem, então rastreamos filopodias indi...

Discussion

Aqui apresentamos um protocolo detalhado para rastrear a dinâmica do crescimento filopodial e a análise das concentrações relativas de proteína nessas estruturas dinâmicas através do algoritmo convexo-casco. Usando o software, até 3 canais podem ser comparados por pares em uma única execução, pelo que as concentrações relativas de dois canais ( ou seja, proteínas) são determinadas ao longo do ciclo de extensão / retração e armazenadas como arquivos de imagem e dados em pastas separadas. Além das operações de ro...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	31966-021
10% Soro bovino fetal	Biochrom AG	L11-044
Lipofectamina 2000	Life Technologies	11668-027
1% penicilina/estreptomicina	Biochrom AG	12212
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103-049
B27	Life Technologies	17504-044
HEPES (solução de estoque 1M)	Life Technologies	15630
Citrino-N1	Addgene	54593
Labtech	Thermo	155411
Glutamax-I	Thermo	35050-061
Hela	Leibniz Institute DSMZ	ACC-57
COS 7	Leibniz Instituto DSMZ	ACC-60
3T3 células	Leibniz Instituto DSMZ	ACC-59
Microscópio	Nicon Eclipse
Camera	Andor	DU888 Unidade Ultra
Confocal	Yokagawa	CSU-X1
Pyruvate	Gibco	31966-021