Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Summary

Apresentamos uma solução de software para o rastreamento semi-automatizado da concentração relativa de proteína ao longo do comprimento de protrusões celulares dinâmicas.

Abstract

Filopodia são protrusões celulares dinâmicas, semelhantes a dedos, associadas à migração e à comunicação célula-célula. Para entender melhor os complexos mecanismos de sinalização subjacentes à iniciação filopodial, alongamento e posterior estabilização ou retração, é crucial determinar a atividade da proteína espaço-temporal nessas estruturas dinâmicas. Para analisar a função de proteína em filopodia, desenvolvemos recentemente um algoritmo de rastreamento semi-automatizado que se adapta às mudanças de forma filopodial, permitindo análises paralelas da dinâmica de protrusão e da concentração relativa de proteína ao longo de todo o comprimento filopodial. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo detalhado para otimizar o gerenciamento de células, a aquisição de imagens e a análise de software. Além disso, fornecemos instruções para o uso de recursos opcionais durante a análise de imagem e representação de dados, bem como diretrizes de solução de problemas para todos os passos críticos ao longo do caminho. Finalmente, também incluímos uma comparação do dEscreveu software de análise de imagem com outros programas disponíveis para quantificação de filopodia. Juntos, o protocolo apresentado fornece uma estrutura para análise precisa da dinâmica de proteínas em protrusões filopodiais usando software de análise de imagem.

Introduction

O controle espaço-temporal das proteínas reguladoras da actina está associado à dinâmica do filopodium ^{1 , 2} . O rastreamento da concentração de proteína resolvida espacialmente ao longo do comprimento todo filopodial através do tempo é, portanto, crucial para avançar a nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à iniciação, alongamento, estabilização ou colapso dessas estruturas dinâmicas ^{3 , 4} . Ao contrário da análise de proteínas no citossolo, onde muitas mudanças de formas de células ocorrem em uma escala maior, filopodia são micro estruturas d....

Protocol

1. Cultura celular

1. Cultura HeLa ou células COS no Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g / L de D-glucose, L-alanina-L-glutamina dipeptídico, piruvato, 10% de soro bovino fetal e 10 unidades / ml de penicilina / estreptomicina. Os neurônios culturais em meios culturais sem L-glutamina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, suplementados com 0,5-diperptídeo L-alanina-L-glutamina, suplementos neuronais sem soro e 10 unidades / ml de penicilina / estreptomicina.
2. Uma vez que se alcança 40% de confluência, transfira células com construções de escolha usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Mantenh....

Results

Usando células COS transfectadas com um marcador para a actina filamentosa (f-tractin ¹⁸ , vermelho) e uma referência citosólica (verde), encontramos protrusões filopodiais ricas em actina ( Figura 3A , painel superior). As séries temporais mostraram que os filopodios se estendiam e retraíam rapidamente ( Figura 3A , painel do meio). Usando o software de análise de imagem, então rastreamos filopodias indi.......

Discussion

Aqui apresentamos um protocolo detalhado para rastrear a dinâmica do crescimento filopodial e a análise das concentrações relativas de proteína nessas estruturas dinâmicas através do algoritmo convexo-casco. Usando o software, até 3 canais podem ser comparados por pares em uma única execução, pelo que as concentrações relativas de dois canais ( ou seja, proteínas) são determinadas ao longo do ciclo de extensão / retração e armazenadas como arquivos de imagem e dados em pastas separadas. Além das operações de ro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	31966-021
10% Soro bovino fetal	Biochrom AG	L11-044
Lipofectamina 2000	Life Technologies	11668-027
1% penicilina/estreptomicina	Biochrom AG	12212
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103-049
B27	Life Technologies	17504-044
HEPES (solução de estoque 1M)	Life Technologies	15630
Citrino-N1	Addgene	54593
Labtech	Thermo	155411
Glutamax-I	Thermo	35050-061
Hela	Leibniz Institute DSMZ	ACC-57
COS 7	Leibniz Instituto DSMZ	ACC-60
3T3 células	Leibniz Instituto DSMZ	ACC-59
Microscópio	Nicon Eclipse
Camera	Andor	DU888 Unidade Ultra
Confocal	Yokagawa	CSU-X1
Pyruvate	Gibco	31966-021