Este trabalho descreve um método baseado em microscopia de fluorescência para o estudo da adesão, disseminação e secreção de plaquetas sob fluxo. Esta plataforma versátil permite a investigação da função plaquetária para pesquisas mecanicistas sobre trombose e hemostasia.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Imagens de células vivas de degradação e secreção de plaquetas sob fluxo
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As plaquetas são jogadores essenciais na hemostasia, a formação de trombos para selar as violações vasculares. Eles também estão envolvidos em trombose, a formação de trombos que obstruem a vasculatura e ferem órgãos, com conseqüências que ameaçam a vida. Isso motiva a pesquisa científica sobre a função plaquetária e o desenvolvimento de métodos para rastrear processos biológicos celulares, pois ocorrem em condições de fluxo.
Uma variedade de modelos de fluxo estão disponíveis para o estudo da adesão e agregação de plaquetas, dois fenômenos-chave na biologia das plaquetas. Este trabalho descreve um método para estudar a degranulação de plaquetas em tempo real sob fluxo durante a ativação. O método faz uso de uma câmara de fluxo acoplada a uma configuração de bomba de seringa que é colocada sob um microscópio de fluorescência à base de LED de campo largo e invertido. A configuração descrita aqui permite a excitação simultânea de múltiplos fluoróforos que são administrados por anticorpos marcados com fluorescência ou fluorescentesCorantes. Após experiências de imagem de células vivas, os óculos de cobertura podem ser processados e analisados usando microscopia estática (por exemplo , microscopia confocal ou microscopia eletrônica de varredura).
Introdução
As plaquetas são células anucleadas que circulam na corrente sanguínea. Sua principal função é selar as rupturas vasculares em locais de lesão e prevenir a perda de sangue. Nesses locais de lesão, as fibras subendoteliais de colágeno tornam-se expostas e são posteriormente cobertas pela proteína multimérica, o fator von Willebrand (VWF). O VWF interage com as plaquetas em circulação em um mecanismo que depende do complexo de glicoproteína Ibα-IX-V na superfície celular 1 , diminuindo a velocidade das plaquetas. Isto é particularmente importante a altas taxas de cisalhamento. As plaquetas subseqüentemente sofrem alterações morfológicas enquanto....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
O Comitê de Ética Médica local do Centro Médico Universitário de Utrecht aprovou o desenho de sangue para fins de pesquisa ex vivo , incluindo aqueles deste estudo.
1. Preparação da solução
- Prepare um tampão de Tyrode do ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico (HEPES) por dissolução de HEPES 10 mM, Na2HPO4 0,5 mM, NaCl 145 mM, KCl 5 mM, MgSO4 1 mM e D- Glicose em água destilada.
- Faça duas variantes do buffer: ajuste os níveis de pH em 6,5 e em 7,4, respectivamente. Faça um novo buffer para cada dia de experimentos. Suplementar com prostaciclina a 10 ng / mL quando indicado. <....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A Figura 1 mostra imagens da câmara de fluxo e configuração experimental; A posição e as dimensões da folha de silício; E conexões de tubulação. A Figura 2 fornece detalhes sobre as dimensões da câmara de fluxo. A Figura 3 eo Filme 1 mostram uma série de imagens de adesão plaquetária e propagação em VWF imobilizado. CD63 é uma proteína transmembranar que é inserida na membrana de gr.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Em todo o mundo, a trombose é uma das principais causas de morte e morbidade, e as plaquetas desempenham um papel central no seu desenvolvimento. Este trabalho descreve um método para a imagem de células vivas de degranulação de plaquetas sob fluxo. Em geral, assume-se que, quando as plaquetas se ativam, todos os conteúdos granulares são liberados diretamente na solução. Os resultados que acompanham sugerem que este não é necessariamente o caso. Durante a adesão e degranulação, as plaquetas retêm uma quantidade signific.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O CM reconhece o apoio financeiro da Organização Internacional de Pacientes para Deficiências de Inibidores de C1 (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht e a Fundação Landsteiner para Pesquisa de Transfusão de Sangue (LSBR).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glicose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostaciclina | Cayman Chemical | 18220 | |
| Citrato Tri-ssódico | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Ácido cítrico | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Óculos de Cobertura | Menzel-Glä ser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, nº 1 = 0,13 - 0,16 mm de espessura. |
| Ácido cromossulfúrico (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Fator de Von Willebrand (VWF) | purificado | ||
| Fibrinogênio | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| de 4 poços, não tratado | Thermo Scientific | 267061 | |
| Fração de Albumina de Soro Humano V | Haem Technologies Inc. | ||
| Tubos de coleta de sangue, 9 mL, 9NC Coagulação Citrato de Sódio 3.2% | de células 455322 | Greiner Bio-One | |
| Abbott Diagnostics | CELL-DYN analisador | ||
| Paraformaldeído | Sigma | 30525-89-4 | |
| Bomba de seringa | Aparelho Harvard, Holliston, MA | Aparelho Harvard 22 | |
| Seringa de 10 mL com 14,5 mm de diâmetro | BD biosciences | 305959 | Seringa Luer-Lok |
| Anti-CD63-biotina | Abcam | ||
| Anti-CD62P-biotina | R& D Systems | Dy137 | |
| 4',6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugado | Thermo Scientific | S11223 | |
| Óleo de imersão | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Solução de detergente | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Álcool polivinílico | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Cloridrato de Tris | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Ovino Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Filme Parafinn | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Rolo. |
| Folha de silicone não reforçada | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0,125 mm. |
| Folha de silicone cortada personalizada com canais de perfusão e vácuo | feita | Feita de folha de silicone não reforçada (Nagor, NA 500-1) | |
| Tubos de 1,5 mL | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Zeiss Observer Z1 | Equipado com luzes de excitação LED. | ||
| Software de microscópio | Zeiss ZEN 2 | edição | |
| 18 G (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Pipeta de pasteur de plástico | VWR | 612-1681 | 7 mL não estéreis, graduados até 3 mL. |
| Tubo de silicone | VWR | 228-0656 | Diâmetro interno. x Diâmetro externo x Espessura da parede = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm. |
| Lâminas de microscópio | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, bordas retificadas 45 °, extremidade fosca. |
Referências
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013). <....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
