Determinação de alta-afinidade de anticorpo-antigénio Cinética de ligação utilizando quatro plataformas Biosensor

Summary

Nós descrevemos aqui os protocolos para a medio de anticorpo-antigénio de afinidade e cinética utilizando quatro plataformas de biossensores de ligação geralmente usados.

Abstract

biossensores ópticos, livre de marcador são ferramentas poderosas para a descoberta de drogas para a caracterização de interacções biomoleculares. Neste estudo, descrevemos o uso de quatro plataformas de biossensor utilizados rotineiramente no nosso laboratório para avaliar a afinidade de ligação e da cinética de dez anticorpos de elevada afinidade monoclonais (mAbs) contra pró-proteína humana convertase subtilisina Kexin tipo 9 (PCSK9). Embora ambos Biacore T100 e Proteon XPR36 são derivados a partir da tecnologia (SPR) bem estabelecida ressonância plasmónica de superfície, o primeiro tem quatro células de fluxo ligados por configuração de fluxo em série, enquanto que o último presentes 36 pontos de reacção em paralelo, através de um improvisado 6 x 6 cruzado configuração do canal microfluídico. O MX96 IBIS também opera com base na tecnologia de sensor de RPS, com uma característica adicional de imagem que proporciona detecção de orientação espacial. Esta técnica de detecção, juntamente com o fluxo contínuo Microspotter (CFM) expande-se o rendimento de forma significativa por enabling impressão matriz multiplex e de detecção de 96 desportos de reacção simultaneamente. Em contraste, o octeto RED384 baseia-se no princípio BioLayer interferometria (BLI) óptico, com sondas de fibra óptica agindo como o biossensor para detectar o padrão de interferência muda em cima de interacções de ligação na superfície da ponta. Ao contrário das plataformas baseadas em SPR, o sistema BLI não dependem de fluidos de fluxo contínuo; em vez disso, as pontas de sensor recolher leituras enquanto eles estão imersos em soluções de analito de uma microplaca de 384 cavidades durante a agitação orbital.

Cada uma dessas plataformas biossensor tem suas próprias vantagens e desvantagens. Para proporcionar uma comparação directa da capacidade desses instrumentos para fornecer dados cinéticos de qualidade, os protocolos descritos ilustram experiências que utilizam o mesmo formato de ensaio e os mesmos reagentes de alta qualidade para a caracterização cinética de anticorpo-antigénio que se encaixam a simples 1: modelo de interacção molecular 1 .

Introduction

A aquisição de parâmetros cinéticos confiáveis para caracterizar as interações anticorpo-antígeno é um componente essencial do processo de descoberta e desenvolvimento de medicamentos¹. Os biossensores de Ressonância Plasmônica de Superfície Óptica (SPR), o "padrão ouro" para detecção em tempo real dessas interações, têm sido usados por aproximadamente duas décadas para permitir a seleção precoce de candidatos a anticorpos terapêuticos que atendem aos critérios^2,3. Além de fornecer uma classificação de afinidade de candidatos a anticorpos pela triagem de ligação rápida de sobrenadantes brutos⁴, e determinações cinéticas rigorosas de preparações purificadas⁵, os biossensores podem diferenciar ainda mais a atividade funcional dos candidatos líderes por meio de estudos de binning de epítopos^6,7.

Para atender à crescente demanda de produtos à base de anticorpos para várias indicações terapêuticas⁸, uma ampla variedade de instrumentos biossensores inovadores foi desenvolvida nos últimos anos que aumentam a eficiência da identificação e caracterização de candidatos^9,10. Esses instrumentos diferem no projeto de configuração de canais microfluídicos e/ou nos princípios ópticos envolvidos na detecção de interações biomoleculares. Especificamente, o Octeto RED384¹¹, ProteOn XPR36¹² e IBIS MX96⁷ expandiram o número de interações medidas em um único ciclo de ligação para 16, 36 e 96, respectivamente, representando melhorias significativas na taxa de transferência em relação à plataforma Biacore tradicional. Embora essas várias plataformas de biossensores forneçam dados cinéticos essenciais para caracterizar as interações anticorpo-antígeno, elas diferem na configuração experimental e nos procedimentos operacionais devido a variações nas configurações instrumentais. Por exemplo, na plataforma de matriz de imagem SPR do IBIS MX96, a etapa de imobilização do ligante multiplex é realizada em modo off-line em um dispositivo de impressão externo separado do detector^7,13; Em contraste, as outras três plataformas de biossensores utilizam uma configuração "tudo-em-um", onde a adição de componente na superfície do sensor, seja o reagente de ativação, ligante ou analito, é registrada em tempo real e por meio de comandos pré-programados em ordem sequencial. No Octeto RED384, uma característica única desta plataforma baseada em Interferometria BioLayer (BLI) é a disponibilidade de biossensores de fibra óptica pré-revestidos para uso imediato de "dip-and-read¹⁴, eliminando a necessidade de preparação da superfície do ligante e etapas de iniciação/condicionamento, que geralmente são necessárias para os chips sensores em plataformas baseadas em SPR. O design livre de fluidos deste instrumento também simplifica a mecânica e evita preocupações com entupimento e contaminação ao lidar com amostras brutas. Com o novo design fluídico cruzado 6 x 6 no ProteOn XPR36, uma abordagem cinética "one-shot" pode ser implementada alternando os canais de fluxo entre as direções horizontal e vertical para criar 36 pontos de interação¹⁵. Em vez de avaliar a cinética de ligação uma concentração de ligante ou analito por vez, como é feito na plataforma tradicional de fluxo serial Biacore T100, essa abordagem oferece a capacidade de monitorar até 36 interações diferentes simultaneamente em um único ciclo de ligação.

Apesar de suas diferenças, essas quatro plataformas de biossensores são amplamente utilizadas por muitos laboratórios em todo o mundo. Para novos usuários com pouca experiência prática em biossensores, decidir qual instrumento usar pode ser uma tarefa desafiadora, dadas as diferenças no design instrumental. Para determinar o instrumento mais apropriado para seus propósitos de pesquisa, fatores como qualidade dos dados, consistência de desempenho, rendimento, facilidade de operação e consumo de material precisam ser considerados coletivamente. Embora vários estudos de referência tenham explorado a variabilidade das constantes de taxa cinética obtidas de vários laboratórios e biossensores^5,16, um estudo comparativo comparativo publicado recentemente aborda ainda mais os fatores sistemáticos que influenciam a confiabilidade dos dados do ponto de vista do desempenho instrumental^17,18. Os protocolos fornecidos neste vídeo enfocam a configuração e os procedimentos experimentais em detalhes e são acompanhados pelo artigo de pesquisa intitulado "Comparação de plataformas de biossensores na avaliação da cinética de ligação anticorpo-antígeno de alta afinidade" ¹⁷. Esses protocolos destinam-se não apenas a ajudar novos usuários de biossensores a implementar esses instrumentos para fins de pesquisa, mas também a fornecer informações adicionais para os usuários atuais de biossensores em relação aos desafios técnicos e considerações em projetos experimentais para avaliar interações anticorpo-antígeno de alta afinidade.

Protocol

1. Proteínas e Anticorpos

1. Produzir e purificar a subtilisina proproteína convertase humana Kexin tipo 9 (PCSK9) e dez mAbs anti-PCSK9 derivadas de rato tal como foi previamente descrito ^17.
2. Avaliar a pureza dos produtos purificados por injecção sequencial de 10? G de cada amostra em uma coluna de exclusão por tamanhos analítica (SEC) usando um sistema UPLC ^19.

2. Medidas cinética no T100 Biacore

1. Instrumento e Preparação Reagente
   1. Equilibra-se o chip do sensor CM5 à temperatura ambiente durante 15 min.
   2. Descongelar duas alíquotas de 200 ul de 200 mM de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e duas alíquotas de 200 ul de N-hidroxissuccinimida de 50 mM (NHS) à temperatura ambiente.
   3. Prepara-se uma garrafa de 1 L de 1x HBS-EP (HEPES 10 mM [pH 7,4], NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, e 0,005% v / v de polissorbato P20) correndo tampão de dicimentação uma solução 10x HBS-EP + estoque em água.
   4. Prepare 1 ml de proteína A / G a 30 ug / mL em acetato de sódio 10 mM (pH 4,5) e 500 uL de cada amostra de mAb a 0,063 ug / ml em tampão de corrida HBS-EP. Descongelar uma ampola congelada de PCSK9 humano em gelo.
   5. No software de controle, clique em "Ferramentas | Eject Chip", coloque o chip sensor na bainha e fechar. Clique "Ferramentas | Temperatura Ajuste", introduzir a "25" ° C como a temperatura e análise "10" ° C como a temperatura do compartimento.
2. Imobilização superfície
   1. No software de controle, clique em "Arquivo | Assistente de modelo New Abrir /" e selecione "imobilização" na lista no painel do lado esquerdo.
   2. Clique em "Novo" para entrar na janela de configuração de imobilização. Escolha "CM5" como o tipo chip e seleccionar "uma" célula de fluxo por ciclo.
   3. Marque a caixa ao lado de cada "célula de fluxo Immobilize 1/2/3/4" para activate as opções. Selecione "Apontar para nível imobilizado" e "Amina" como o método para todas as células de fluxo.
   4. Enter "30 ug / mL ProA / L", como ligando, assegurar que o nível alvo é definido como "10000" unidades de resposta (RU) para todas as células de fluxo.
   5. Verifique "Prime antes de correr", e clique em "Next". Seleccionar "Reagente cremalheira 2", definem o local para os reagentes e pipeta em frascos de amostras individuais em conformidade. Insira o rack de volta para o instrumento, em seguida, clique em "Iniciar" e digite um nome da experiência para ser salvo para iniciar a execução.
3. Analito Encadernação e ciclos de regeneração
   1. Clique em "Arquivo | Abrir / New Method", selecione "vinculativo 20140812 hu anti-PCSK9 IgG para hu PCSK9" e abra o método. Revisão dos parâmetros do método.
   2. Em "Ensaio" Passos, garantir que não há 10 ciclos em que "hu PCSK9" é o nome com "Amostra" seleccionado em "Purpose". O número de repetição é definido para '1'.
   3. Em "Tipos de ciclo", definem o tempo de contacto para "220" s para a captura de uma mais de trajecto do fluxo de "2", "110" s para a captura de dois ao longo trajecto de escoamento "3", e "55" s para a captura de 3 mais de trajecto de escoamento "4". O caudal é de "10" L / min durante todos os ciclos de captura.
   4. Selecione "Sample 1", marque "solução de exemplo" como variável. Definir o tempo de contacto para "600" s e o tempo de dissociação para "2700" s mais de caminho de fluxo "1, 2, 3, 4". A taxa de fluxo é definido como "30"? L / min.
   5. Seleccionar "Regeneração 1", introduzir "Glicina-HCl, pH 1,5" no campo solução e ajustar o tempo de contacto para "20" s mais de caminho de fluxo "1, 2, 3, 4".
   6. Em "Configurações de variáveis", introduzir duas vezes titulando concentrações de "100 nM - 6,25 nM" para o Ciclo 1-3, "50 nM - 3,12 nM" para o Ciclo 4-8, e "5 nM - 0,323 nM" fou Ciclo 9-10.
   7. Em "Executar a instalação", escolha o caminho do fluxo de detecção "por 2-1, 3-1, 4-1", clique em "Next", marque "Prime antes de correr", e clique em "Next".
   8. Seleccionar "amostra e o reagente da cremalheira 1", definem o local para os reagentes e pipeta em frascos de amostras individuais em conformidade. Insira o rack no instrumento, em seguida, clique em "Iniciar" e digite um nome da experiência para ser salvo para iniciar a execução.
4. Análise de Dados Usando Bioevaluation
   1. Clique em "Kinetics / Affinity | ligado à superfície", escolha Fc "2-1", "3-1", ou "4-1" separadamente e verificar todas as curvas exibidas a partir das várias concentrações de analitos, bem como a "zero" em branco concentração.
   2. Clique em "Next" para obter o espaço em branco tampão curvas subtraídos. Em seguida, clique em "Cinética", escolher o: Modelo "1 1 Encadernação" e clique em "Fit" para obter a Parame cinética equipadaters.
   3. Para o encaixe global das várias superfícies mAb, clique em "Multiple R _max" na parte inferior e adicionar as curvas de ligação dos outros FCS, durante o mesmo mAb para a lista.
   4. Clique em "Next" para obter todas as curvas de ligação subtraídos tampão em branco. Em seguida, clique em "Cinética", escolha "1: 1 Encadernação" modelo, e escolher "encaixar local" para cada R _max nos parâmetros para a obtenção dos parâmetros cinéticos globalmente equipados.

3. Medições cinéticas no XPR36 Proteon

1. Instrumento e Preparação Reagente
   1. Equilibra-se um chip sensor de MLG e um frasco de 2-L de PBS-T-EDTA (PBS [pH 7,4], 0,005% de Tween-20, e EDTA 3 mM) de tampão à temperatura ambiente durante 15 min em execução.
   2. No software de controle, clique em "Eject" e insira o chip GLM. Ajustar a temperatura chip para "25" ° C e a temperatura de auto-amostrador a "10" ° C.Clique em "O glicerol Inicialização" e siga as instruções solicitado a inicializar o chip.
   3. Clique em "Arquivo | Abrir" um protocolo de pré-condicionamento da lista, preparar soluções em uma placa de 96 poços. Em seguida, clique em "Executar", selecione o protocolo e clique em "Iniciar".
   4. Descongelar uma aliquota de 1 mL de EDC a 400 mM e uma alíquota de 1 mL de N-hidroxissulfossuccinimida 100 mM (sulfo-NHS), à temperatura ambiente.
   5. Preparar 2 mL de proteína A / G a 60 ug / mL em acetato de sódio 10 mM (pH 4,5) e 500 uL de cada amostra de mAb a 0,25 ug / mL, 0,125 ug / mL e 0,063 ug / ml em PBS-T -EDTA tampão de corrida. Descongelar uma ampola congelada de PCSK9 humano em gelo.
2. Imobilização, Analito Encadernação e Regeneração
   1. Clique em "Arquivo | New | Novo protocolo". Em "Configuração", digite o nome do experimento, selecione Chip "GLM", selecione "microplacas", e digite "2.2" mL de volume.
   2. selecionar"Protocols | As amostras", definir "EDC / sulfo-NHS", como "Activator" em poços H1-H6, "Protea A / G" como "Ligando" em G1-G6, "Etanolamina" como "Desativador" em F1-F6 , "Glycine" como "regenerador" em E1-E6, PBS-T-EDTA "como "em branco" no D1-D6, "amostra X mAb" como "ligando" em C1-C6, e "PCSK9 humano" como" analito em pos H1-H6 em uma segunda placa de 96 poços.
   3. Seleccionar "Passos", duplo clique "imobilização" no "Editor de protocolo", os passos incluem três injecções subsequentes horizontais de EDC / sulfo-NHS, protea A / G, e etanolamina 1 M cada uma a uma velocidade de fluxo de "30" uL / min e um tempo de contacto de 300 "" s.
   4. Clique "Regenerar", injectar três "18" -s pulsos de glicina (pH 1,5) em "100" uL / ​​min em ambas as direcções horizontal e vertical, seguido por duas "60" -s pulsos de PBS-T-EDTA a "25" / minTambém em ambos os sentidos.
   5. Clique "Ligando", injectar um mAb mAb 2 na direcção vertical, utilizando uma taxa de fluxo de "25" L / min e um tempo de contacto de 160 "" s.
   6. Clique "Analito", injectar cinco concentrações de PCSK9 humano (100 nM a 6,25 nM em duas diluições em série) e um tampão em branco ao longo de 6 canais horizontais simultaneamente, em "40" L / min para "600" s de tempo de associação seguido por "2700" s de tempo de dissociação.
   7. Clique "Regenerar", injectar dois "18" -s pulsos de glicina (pH 1,5) em "100" uL / ​​min em ambas as direcções horizontal e vertical.
   8. Repetir os passos acima depois de cada ciclo de ligação para os mAbs restantes.
      NOTA: Para além dos 100 nM - 6,25 nM concentração série PCSK9 humano, 25 nM - 1,56 nM e 5 nM - 0,313 série de concentração nM são utilizados.
   9. Preparar as amostras e reagentes em duas placas de 96 pos de acordo com as posições de reagentesdefinido no passo 3.2.2, em seguida, clique na guia "Run", selecione o protocolo / experiência e clique em "Iniciar".
3. Análise de Dados Usando Proteon Gestor
   1. Clique em "Tipo de Painel" e selecione "Analito". Em seguida, clique em "Protocolo Step" e selecione todas as curvas de ligação na lista.
   2. Clique em "Processo de Auto" e clique em "Processo | Canal de Referência | Interspot". Em seguida, clique em "Processo | Referência Duplo | Row | A6".
   3. Clique em "Criar Dataset" para salvar conjuntos de dados individuais para cada mAb em todas as três superfícies para análise cinética.
   4. Clique em "Análise Dataset", realce cada conjunto de dados mAb e clique em "Análise | Kinetic". Escolha o modelo "Langmuir" e "simultânea ka / kd" e clique em "Next".
   5. Destacar tanto a associação e dissociação ajuste gama, escolha a opção "Local" R _max, e clique em "Next" para executar o ajuste para obteros embutidos parâmetros cinéticos.
   6. Repetir o passo anterior, mas escolher "agrupados" _Rmax para o encaixe para obter os valores de R _max experimentais para calcular a actividade de superfície do ligando.

4. Medidas cinética no Octeto RED384

1. Reagente e placa preparação Amostra
   1. Preparar 50 ml de 1x KB (Buffer cinética contendo PBS pH [7,4], 0,02% de Tween-20, 0,1% de albumina, e 0,05% de azida de sódio) por diluição de uma solução de estoque de 10x em PBS.
   2. Dispensar a 1x KB numa placa de 96 poços em 200 uL por poço. Hidrato 48 de captura anti-humano (AHC) dicas biossensor nestes poços individuais durante pelo menos 10 min.
   3. Preparar cada amostra de mAb a 20 ug / ml, 10 ug / mL, e 5 ug / mL em 1X KB, bem como PCSK9 humano em 7 concentrações tituladas a partir de 100 nM a 1,56 nM em duas diluições em série.
   4. Carregar as amostras de mAb para uma microplaca de 384 cavidades com fundo inclinado (referred como a placa de reagente) e as soluções PCSK9 humanos para outra microplaca de 384 cavidades (referido como a placa de amostra) a 90 uL por poço.
   5. série de carga de 1x KB e glicina (pH 1,5) em soluções de poços na placa de amostra.
      NOTA: Estes poços KB 1x são usados ​​para pré-condicionamento de chip, de estabilização da linha de base, e dissociação do analito. A solução de glicina é usada para a regeneração.
2. Configuração Método Experimental
   1. No software de aquisição de dados, clique em "Experiment | Assistente New Experiment | New Kinetics Experiment | Kinetics básicas".
   2. Em "Placa Definição", siga os passos abaixo para definir os tipos de amostras e posições.
      1. Selecione canais "16" e formato de "384 poços".
      2. Definir os locais amostra e de reagente no visor placa, mantendo pressionada a tecla Shift enquanto clica esquerda no poço para destacar 16 poços de cada vez.
      3. Botão direito do mouse sobre opoços que contêm as amostras de mAb e seleccionar "carga" para significar o passo em que os mAbs são carregados (ou capturado) sobre os sensores de AHC. Digite os nomes e as concentrações de mAb na tabela no lado direito.
      4. Clique direito sobre os poços contendo o PCSK9 humano e seleccionar "Amostra" para indicar a etapa na qual os sensores de mAb-capturados são mergulhadas e as interacções de ligação são medidos. Introduzir as correspondentes concentrações molares na tabela no lado direito.
      5. Definir os poços contendo 1x KB como "tampão" ou "Neutralização", e os poços que contêm glicina como "regeneração".
   3. Em "Definição de Ensaio", siga os passos abaixo para definir a configuração experimental:
      1. Clique em "Adicionar" e selecione "linha de base", "Regeneração", "Equilíbrio", "Carregando", "Associação", e passos "dissociação" para a lista com tempos de "30" s, "30" s "18" s, "200", "500 s" s e "1800" s, respectivamente. A velocidade de oscilação é "1000" rpm.
      2. Para adicionar os passos para "Lista de ensaio Passos", clique primeiro em uma etapa, em seguida, clique sobre os poços localizados em qualquer amostra ou a placa reagente. As etapas são as seguintes:
         1. Equilibração-Regeneração: pré-condição dos sensores AHC por três ciclos de "15" -s mergulhos em glicina (pH 1,5), que alternam com "15" -s mergulhos em 1X KB.
         2. Loading: capturar as amostras de mAb sobre os sensores do AHC para "200" s.
         3. Linha de base: estabelecer o sinal de BLI para "60" s antes da etapa de associação.
         4. Associação: mergulhar os sensores em poços contendo concentrações variáveis ​​de PCSK9 humana para um período de associação "500" -s.
         5. Dissociação: mergulhe os sensores ligados a PCSK9 em novos poços de 1x KB por um período dissociação -s "1.800".
         6. Regeneração: mergulhar o mAb-PCSK9 bound sensores em poços de glicina (pH 1,5) com dois "18" -s impulsos entre cada ciclo de ligao.
   4. Em "Experimentos Review", deslize através dos passos e fazer as alterações necessárias, indo de volta para as guias anteriores.
   5. Em "Experimentos Executar", digite um tempo de "60" s de atraso e agitar a placa de amostra enquanto espera. Definir a temperatura da placa de "25" ° C e prima "GO".
3. Análise de Dados Usando o software de análise de dados de ForteBio
   1. Clique em "Seleção de dados | dados carregados | Kinetics | anticorpos PCSK9 ligação a PCSK9 7.23.14"
   2. Em "Processamento", processar os dados da seguinte forma:
      1. No Passo 1: Clique em "Seleção do sensor" para destacar sensores em H1-H6, clique direito sobre elas e clique em "Alterar tipo de sensor | sensor de referência."
      2. Na Etapa 2, verifique "subtração" e selecione "Sensores médio de referência"; para subtrair cada sensor amostra activo a partir da média dos 6 sensores de tampão em branco.
      3. No Passo 3, o clique "Alinhar eixo Y" e selecionar "linha de base" para alinhar todas as curvas de ligação para o passo da linha de base antes da associação.
      4. Na etapa 5, verifique "Savitsky-Golay Filtering" para suavizar as curvas de ligação, aumentando a relação sinal-ruído, e clique em "Process Data!".
      5. No Passo 6, "clique resultados processados" para visualizar as curvas de ligação processados.
      6. Na etapa 7, reveja os quatro painéis à direita exibindo as curvas de ligação após cada etapa de processamento, e clique em "Salvar dados processados".
   3. Em "Análise", marque "Associação e dissociação" e escolha: Modelo "1 1".
   4. Destacar as curvas de ligação para "global (completo)" ajuste e agrupá-los por "cor". Use _"Rmax ligada" para executar o grupo de montagem em sensores revestidos com o mesmo mAb concentração para obter os valores de R _max experimentais para calcular a actividade de superfície do ligando, e _"Rmax desassociação pelo sensor" para realizar ajuste global em sensores revestidos com várias concentrações de mAb.
   5. Clique em "Curvas Fit" para a obtenção dos parâmetros cinéticos equipados. Salvar os resultados no final de cada análise montagem.

5. Medidas cinética no IBIS MX96

1. Instrumento e Preparação Reagente
   1. Equilibra-se um chip COOH-L à temperatura ambiente durante 15 min.
   2. Prepara-se uma garrafa de 1 L de tampão de corrida do sistema (PBS [pH 7,4], 0,01% de Tween-20) e o tampão de imobilização (acetato de sódio 10 mM [pH 5,0], 0,01% de Tween-20).
   3. Preparar cada mAb a partir de 20 ug / ml a 0,16? G / mL por diluições em série de 2 vezes em tampão de ambos o sistema de execução e o acetato de sódio (pH 5,0) tampão de imobilização.
   4. Dispensar as amostras de mAb em duas setembroarate placas de 96 poços, em que cada mAb ocupa 8 poços verticais nas concentrações de titulação em 200 uL por poço.
   5. alíquotas de descongelamento de EDC a 400 mM e 100 mM de sulfo-NHS, à temperatura ambiente.
   6. Preparar 300 ul de proteína A / G a 50 ug / mL em acetato de sódio (pH 5,0) tampão de imobilização e pipeta-lo em um frasco.
   7. Preparar 200 mL de PCSK9 humano a partir de 100 nM a 0,39 nM por diluições em série de 2 vezes no sistema de tampão de corrida. Pipeta-los em frascos separados.
2. Cinética do ciclo multi com matrizes de anticorpo acoplado a aminas
   1. Misture a alíquotas de EDC / sulfo-NHS (400 mM / 100 mM) e distribuir a mistura para os melhores 48 pos de uma nova placa de 96 poços em 200 uL por poço.
   2. Colocar a placa de mAb fonte (diluída em acetato de sódio [pH 5,0]) na posição 2 e a placa de reagente EDC / sulfo-NHS, na posição 1 no interior da impressora.
   3. Instalar o chip sensor no CFM. Abra o "CFM 2.0" software, em seguida, clique em "Configurações de carga | 96 Amine Casal". A matriz de 10 x 8 de anticorpos é criada como se segue:
      1. Entregar a EDC / sulfo-NHS na metade superior da placa reagente ao sensor 48 utilizando microcanais, e ciclo-los sobre a superfície do sensor de "5" min.
      2. Entregar as amostras de mAb na metade superior da placa de fonte para o sensor e ciclo-los através das superfícies activadas para "10" min.
      3. Entregar o tampão de imobilização de um tubo cónico de 50 ml sobre a superfície do anticorpo para "5" min.
      4. Repetir os procedimentos anteriores para os restantes amostras de mAb na metade inferior da placa de fonte.
   4. Acoplar o chip sensor de impresso no instrumento. No software de controle, clique em "Arquivo | Ligação | Abrir medição | Medição existente" e selecione "2014/08/15".
   5. Em "Geral", selecione "G - Sistema Prime" em "script do sistema Full". Em seguida, selecione "G - QuEnch" para desactivar as superfícies de mAb por injecção de 150 mL 1 M de etanolamina.
   6. Clique em "Camera" para visualizar as matrizes mAb e ajustar o contraste se necessário. Posicionar as caixas quadradas vermelhas para cercar os pontos mAb, e mover as caixas quadradas verdes para os interspots localizados entre os pontos mAb ativos para referência.
   7. Em "Cycle Analysis", selecione "A - AP Padrão Run" em "Scripts IBIS". Definir 1,0 min para linha de base, 10,0 min para a associação, e 90 passos para a dissociação em 8 mL / s de velocidade.
   8. Dentro os "ciclos", injectar PCSK9 humano uma concentração de cada vez após cinco injecções de tampão. Regenerar as superfícies de mAb com glicina pH 2,0 entre cada ciclo de ligao.
3. Cinética de ciclo único com matrizes de anticorpo capturado-Fc
   1. Instalar um novo chip sensor no CFM. Repita os passos 5.2.3 a 5.2.5 acima, substituindo as amostras de mAb com protea A / G.
   2. Remova ochip sensor do MX96 e inseri-lo para trás para dentro da impressora CFM.
   3. Entregar os mAbs na metade superior da placa para a superfície do sensor a protea A / G utilizando microcanais 48, e ciclo-los através da superfície usando fluxo bidireccional, durante 10 min.
   4. Repetir o passo anterior para as restantes amostras de mAb na metade inferior da placa.
   5. Acoplar o chip sensor de impresso no instrumento MX96. Na Aquisição de Software de Dados, clique em "Arquivo | Ligação | Abrir medição | Medição existente | Next" e selecione "Proteína A + G kinetic7.30.14 ligação".
   6. Clique em "câmera" para visualizar as matrizes mAb e ajustar o contraste se necessário. Posicionar as caixas quadradas vermelhas para cercar os pontos mAb, e mover as caixas quadradas verdes para os interspots localizados entre os pontos mAb ativos para referência.
   7. Em "Cycle Analysis", selecione "A - AP Padrão Run" em "Scripts IBIS". Ajuste "1,0 min", para linha de base, "10,0min" por associação, e '10' passos para a dissociação em '8 ul / seg' velocidade.
   8. Dentro os "ciclos", injectar PCSK9 humano uma concentração de cada vez após cinco injecções de tampão. Sem a regeneração é efectuada entre cada injecção analito.
4. Análise de Dados Usando Sprint e purificador
   1. No sofware SprintX, clique em "Arquivo | Abrir Triângulo File", selecione todas as injeções de exemplo na lista e marque "Salvar arquivo SprintX", "Calibração" e "determinação RLL" antes de clicar em "Analisar".
      NOTA: Os valores referem-se às RLL imobilizadas / níveis de mAb capturados na superfície do sensor.
   2. Verifique "Referenciar" e selecione "Local" para usar os pontos de referência adjacentes. Além disso, verifique "Alinhar" na primeira injeção e, em seguida, clique em "Iniciar Automation."
   3. Na guia Serial, selecione "Mostrar governantes na barra de ferramentas", ajustá-lospara seleccionar uma pequena região da linha de base imediatamente antes da primeira injecção de amostra, e seleccionar "Zero".
   4. Gerar um arquivo .IBMX para análise no purificador, selecionando "Exportar para iBMX arquivo" e clique em "Start Automation."
   5. Lançar purificador e carregar o arquivo .IBMX. Enter "100n" como "da conc" e "2" como o "fator de diluição".
   6. A colheita de dados, remover todos linha de base antes do início da injecção, e alinhar as curvas de ligação no início da associação.
      NOTA: Para o ensaio de cinética de ciclo único, não se alinham as curvas.
   7. Vá para a aba "Cinética", ajustar o governante para o tempo final de injeção, selecione "k _d" e ajuste, em seguida, "correção k _d". Selecione "k _a k _d" e ajustá-lo novamente.
   8. Flutuador da coluna k _d e ajustar novamente para refinar ainda mais o ajuste.
      NOTA: Para o ajuste de curvas de ligação único ciclo, Clique em "Opts" e desmarque "Subtrair", selecione "separado" e flutuar a coluna "Comece Inj" para ajustar os perfis de associação de volta para uma origem teórica da linha de base.
   9. Rever os parâmetros da cinética instalado na guia Resultados.

Results

A Figura 1 mostra a imagem matriz de anticorpo a partir do CFM e os níveis de mAbs manchado pelos dois métodos de imobilização, e a Figura 2 mostra os sensogramas de ligao correspondentes geradas na MX96 do multi-ciclo cinético e medidas cinéticas a-ciclo único nestas matrizes mAb . O curvas cineticamente embutidos de várias superfícies revestidas com anticorpos gerados nos quatro plataformas de biossensores de ligação e em tempo real são mostrados nas Figuras 3 - 6. A Figura 7 mostra a comparação das taxas cinéticas e de equilíbrio de ligação finais constantes obtidas a partir da análise global destas curvas de ligação. A associação indivíduo _(ka), a dissociação (K _d) e de equilíbrio (K _D) As constantes de ligação são apresentados na Tabela 1. Para demonstrar a variabilidade de conjuntos de dados gerados no mesmo instrumento, _k, k _d, e K _D a diferentes densidades de superfície de mAb, e A Figura 9 compara ainda as actividades de ligação das superfícies calculadas de mAb através das plataformas de biossensor.

Figura 1. Multiplex Ligando de matrizes de Amina-acoplado (A) e Fc-capturado (B) Anticorpo superfícies dos CFM impressão no IBIS MX96. Imagens das matrizes impressas estão apresentados nos painéis da esquerda, onde as áreas cinzentas fechados por quadrados vermelhos indicar a presença de anticorpo. Os interspots mais escuras localizadas entre os pontos de anticorpo activos são utilizados para a subtracção de referência. Cada coluna contém um anticorpo impresso nas concentrações de titulação identificadas abaixo e para o lado esquerdo da imagem. As quantidades dos anticorpos impressos quantificadas calculando o difference em turnos granel entre os locais activos e de referência são mostradas nos painéis da direita. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Comparação de Tempo Real Binding sensorgramas de multi-ciclo (A) e de ciclo único (B) Experiências cinéticas em IBIS MX96. As injecções sequenciais de PCSK9 humano em concentrações crescentes em toda as 10 x 8 matrizes de anticorpo são anotados acima de cada segmento sensorgrama correspondente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

superiores), médio (pains do meio), e baixa (painéis inferiores) superfícies de densidade. As linhas pretas sobrepostas lisas representam o ajuste cinética dos sinais de resposta de ligação com diferentes concentrações de PCSK9 humanas (linhas coloridas) a um modelo 1: 1 interacção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Ligação sensorgramas dos anticorpos capturados Interagem com PCSK9 Humana e 1: 1 cinéticos modelo de ajuste sobreposições na Proteon XPR36. As interacções são avaliadas sobre alto (painéis superiores), medium- (pains do meio), e baixa (painéis inferiores) superfícies de densidade. As linhas pretas sobrepostas lisas representam o ajuste cinética dos sinais de resposta de ligação com diferentes concentrações de PCSK9 humanas (linhas coloridas) a um modelo 1: 1 interacção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Ligação sensorgramas dos anticorpos capturados Interagem com PCSK9 Humana e 1: 1 cinéticos modelo de ajuste sobreposições na Octeto RED384. As interacções são avaliadas sobre alto (painéis superiores), médio (pains do meio), e baixa (painéis inferiores) superfícies de densidade. As linhas vermelhas sobrepostos representam o ajuste cinética dos sinais de resposta de ligação em diferentes concentrações PCSK9 humanas (linhas coloridas) para uma mistura 1: Um modelo de interacção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Ligação sensorgramas dos (B) Antibodies Amina-acopladas (A) e Fc-capturados Interagem com PCSK9 Humana e 1: 1 cinéticos modelo de ajuste sobreposições na IBIS MX96. Os perfis de ligação são organizadas como 10 x 8 painéis que se seguem o mapa da placa de matriz na Figura 1. As linhas pretas representam os sinais de resposta de ligação gravados em diferentes concentrações PCSK9 humanos, e as linhas vermelhas sobrepostos representam as curvas ajustadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

gura 7" src = "/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg" />
Figura 7. Comparação da Associação de k _a (A), dissociação K _d (B), e Equilíbrio K _D (C) As constantes de ligação gerado pelo Plataformas Quatro biossensor. Os parâmetros cinéticos são obtidos a partir de análise global das curvas de ligação nas Figuras 3 - 6. Os instrumentos são representados como se segue: Biacore T100 (azul), Proteon XPR36 (verde), Octeto RED384 (vermelho), IBIS MX96, acoplado-amina (roxo), e IBIS MX96, Fc-capturado (laranja). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8. Comparação da Consistência cinético constantes ao longo de várias densidades de superfície anticorpo na Biac minério T100 (A), Proteon XPR36 (B), Octeto RED384 (C), a IBIS MX96, acoplado-amina (D), e IBIS MX96, Fc-capturado (E). Os parâmetros cinéticos K _a (sub-painéis de topo), k _d (média sub-painéis), e K _D (inferior subpainéis) são derivados a partir de análise de grupo a densidade de superfície do anticorpo individuais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9. Actividades de ligação do anticorpo Superfícies e suas (barras de erro) desvios-padrão nas plataformas Quatro biossensor. Os valores são calculados utilizando equações descritas nos artigos de pesquisa ^17.large.jpg" target = '_ blank'> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	k um	k d	K D
	(M-1s-1)	(s -1)	(nM)
mAb 1	11,7 (7,8) x 10 5	4,89 (4,18) x 10 -5	0,052 (0,05)
mAb 2	1,53 (0,28) x 10 5	1,30 (1,54) x 10 -5	0,092 (0,12)
mAb 3	11,4 (8,3) x 10 5	27,6 (11,0) x 10 -5	0,333 (0,20)
mAb 4	3,61 (1,6) x 10 5	20,1 (12,3) x 10 -5	0,659 (0,54)
mAb 5	0,59 (0,21) x 10 5	3,46 (2,50) x 10 -5	0,663 (0,46)
mAb 6	1,19 (0,78) x 10 5	7,21 (3,83) x 10 -5	0,894 (0,64)
mAb 7	1,29 (0,53) x 10 5	16,4 (5,63) x 10 -5	1,57 (1,02)
mAb 8	4,02 (2,23) x 10 5	22,8 (10,7) x 10 -5	0,768 (0,68)
mAb 9	4,20 (2,13) x 10 5	6,67 (4,3) x 10 -5	0,197 (0,16)
mAb 10	1,20 (0,49) x 10 5	12,5 (7,64) x 10 -5	1,27 (0,80)

Tabela 1: Modelo de Interação 1: Kinetic Tarifas e Equilibrium Constantes de 10 mAbs obtidas pelo ajuste global de curvas de ligação de quatro instrumentos Biosensor ao 1 Encadernação.

Discussion

Nosso estudo de comparação head-to-head mostra que cada plataforma biosensor tem suas próprias forças e fraquezas. Embora os perfis de ligação dos anticorpos são semelhantes por comparação visual (Figuras 3 - 6), e a ordem de classificação das constantes cinéticas adquiridos são altamente consistentes entre os instrumentos (Figura 7), os nossos resultados mostram que os instrumentos SPR-base com fluidos de fluxo contínuo) são melhores em resolver interacções de elevada afinidade com taxas de dissociação lentas. Deriva para cima durante a fase de dissociação é observado em conjuntos de dados (por exemplo, mAb 2, 5 mAb, e o mAb 9; Figura 5) gerado pelo BLI fluídica-livres instrumento. Esta descoberta pode ser atribuído, em grande parte para a evaporação da amostra ao longo do tempo na microplaca, que é uma limitação principal do sistema. Com esta limitação inerente, o tempo experimental é também restringido a menos de 12 h; os ensaios foram, por conseguinte, programado com shvezes Orter (associação 500 s e 30 min de dissociação) em comparação com os das outras plataformas (10 min de associação e de dissociação de 45 min). No entanto, o encurtamento do tempo experimental não pareceu atenuar o impacto da evaporação sobre a qualidade dos dados / consistência, como as constantes de velocidade gerado pelo instrumento baseado no BLI mostrar menos linearidade como um resultado de flutuações em alguns dos off-rates (Figura 8C ). Além disso a evaporação de exemplo, diferenças nos reagentes de captura utilizados podem ter também contribuiu para as diferenças entre os resultados obtidos. Enquanto protea A / G foi utilizada em todas as três plataformas SPR fluídicos baseada, sensores AHC foram usadas na plataforma BLI não-fluidos. Uma vez que a proteína A / G é provável que tenha uma afinidade mais fraca para os mAbs que se o AHC, uma superfície de biossensor baseado em anticorpos, os off-rates do complexo mAb-antigénio a partir das / superfícies proteína A G pode artificialmente aparece mais rapidamente do que aqueles obtida a partir da superfície de AHC. Esta possibilidade é suportado by os dados experimentais que mostram que os valores de taxa de dissociao gerados pela plataforma BLI foram consistentemente mais baixos do que os obtidos a partir de outros instrumentos (Figura 7, linha vermelha). No entanto, a plataforma BLI tem vantagens diferentes sobre as outras plataformas. Por exemplo, é altamente flexível no que diz respeito à escolha do sensor e a configuração do ensaio devido às diferentes sensores pré-revestido para uso imediato. Nas nossas experiências, a utilização dos sensores AHC eliminou a necessidade de etapas de imobilização de ligando, reduzindo o tempo de preparação. Além disso, a plataforma BLI requer muito menos manutenção em comparação com as outras plataformas fluidos SPR, que apresentam configurações de tubos e interruptor valor complicados. Esta característica é uma vantagem para as experiências envolvendo amostras em bruto, que podem causar problemas de entupimento e de contaminação.

Como a demanda para a identificação eficiente, rápida, e precisa de candidatos terapêuticos aumenta, a necessidade de biosensor rendimento está também a aumentar. Entre as quatro plataformas de biossensor, a taxa de transferência do biossensor capaz de 96-ligando de impressão de matriz é o mais elevado, seguido pelo biossensor acoplado a um formato de 36-ligando de entrecruzamento e o biossensor baseado no BLI com leitura simultânea de 16 canais, que em última análise aumentar o número de interacções medidos num único ciclo de atadura para 96, 36 e 16, respectivamente. Estas capacidades são rendimento significativamente mais elevado do que a da plataforma SPR tradicional, que é limitada por ter apenas quatro células de fluxo ligadas por um único fluxo de série. Uma vez que as nossas experiências envolveram um conjunto relativamente pequeno de amostra de 10 mAbs avaliados em várias densidades de superfície com tempos de dissociação longa, os débitos instrumentais desempenhou um papel moderado na determinação da eficiência das experiências. Não houve diferenças significativas nos tempos experimentais das três plataformas de alto rendimento, e em todos os casos, os ensaios foram concluídos em um dia. Por outro lado, os experimentos tradicionais SPR fluxo de série necessário 3 dias para ser concluído, apesar da automação pé-away de aquisição de dados após a instalação. Em outros estudos que envolvem um grande número de amostras (isto é, na ordem das centenas ou milhares), para fins de classificação off-rate / rastreio cinética ou binning epitopo, a taxa de transferência torna-se um factor crítico.

Embora a taxa de transferência no IBIS MX96 é ordens de magnitude mais elevada do que a dos outros biossensores e é portanto uma escolha ideal para esses fins, ele tem alguns inconvenientes. Em particular, a impressão de matriz pelo CFM mostra grandes inconsistências na superfície (Figura 1) e reduzida reprodutibilidade dos dados (Figura 8D e 8E). Para as medições cinéticas exactas, a quantidade de ligando na superfície do biossensor é um parâmetro crítico que deve ser controlado para assegurar que as respostas de ligação não são perturbados por factores secundários tais comotransferência de massa ou impedimento. Para o Biacore T100 e Proteon XPR36, os níveis óptima R _L foram determinadas com base no cálculo de valores padrão _{no máximo} conjunto R, tal como descrito no artigo de investigação ^17. Por outro lado, para as plataformas Octeto RED384 e IBIS MX96, os níveis de captura de mAb foram obtidos empiricamente utilizando uma série de anticorpos 2 vezes diluídas em série em tempos constantes. A falta de conhecimentos ou de controlo do passo de captura resultou em uma superfície de alta densidade e os sinais de altos de ligação de resposta (Figura 2) que pode ter comprometido a precisão das constantes cinéticas. Além disso, a separação da impressora a partir do detector de SPR também apresenta um desafio ao realizar várias medições de ciclo de ligação envolvendo regenerações. A única maneira de fazer a configuração multi-cinética do ciclo foi através de acoplamento de amina directa dos mAbs, em oposição a capturar pelo mAb Fc pela proteína A imobilizada / Lsuperfície nas outras três plataformas de biossensor. Como resultado, uma experiência de regeneração de aferição adicional foi necessário para determinar as condições de regeneração óptimas. O resultado desta configuração foi associada a uma actividade de superfície observado 90% inferior ~ em comparação com o método de captura de Fc (Figura 9), para além de um tempo mais longo experimental. Para executar o método de captura de Fc, foi adoptada uma abordagem cinética de ciclo único alternativa. Esta abordagem envolve a injecção sequencial de analito em concentrações crescentes, sem regeneração entre cada injecção (Figura 2). Esta abordagem altamente conveniente, mas menos vulgarmente aplicados não só reduziu o tempo experimental e a redução do consumo de reagente, mas também produzido constantes cinéticas altamente semelhantes aos de outros biossensores (Figura 7). Portanto, a aplicação desta abordagem cinética de ciclo único ultrapassa a limitação inerente configuração do instrumento e apresenta umaoportunidade para a obtenção de alta resolução das constantes cinéticas de um modo de elevado rendimento.

Apesar do rendimento ser uma grande limitação no Biacore T100, nossos resultados mostram coletivamente que gerou os dados mais consistentes com a mais alta qualidade. Isto foi seguido pela Proteon XPR36, que tem ~ 10 vezes maior rendimento. A sua capacidade para gerar dados de alta qualidade torna-se uma vantagem ao caracterizar interacções anticorpo-antigénio de alta afinidade que podem ser tecnicamente difícil quando os limites de detecção dos instrumentos são atingidos. Enquanto as limitações sistemáticas na instrumentação do octeto RED384 dificultam a medição precisa das constantes de velocidade de dissociação (ou seja, ficar aquém da sensibilidade para resolver decaimento de sinal suficiente para lenta off-rates), tanto o Biacore T100 e Proteon XPR36 pode fornecer sensível e confiável detecção para a diferenciação.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema Biacore T100	GE Healthcare	28975001	O sistema T100 foi atualizado para o chip sensor T200
CM5	GE Healthcare	BR100012
BIAavaliação	Versão 4.1	da GE Healthcare
	GE Healthcare		O software de controle T100 foi atualizado para o Kit de Acoplamento de Amina T200
	GE Healthcare	BR100050	Contém: 750 mg de cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), 115 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS), 10,5 mL de 1,0 M de etanolamina-HCl pH 8,5
HBS-EP+ Buffer 10 &vezes;	GE Healthcare	BR100669	Solução de estoque concentrado
Frascos de plástico, diâmetro externo 7 mm	GE Healthcare	BR100212
Tampas de borracha, tipo 3	GE Healthcare	BR100502
Frascos e tampas de plástico, o.d. 11 mm	GE Healthcare	BR100214
Sistema de Interação de Proteínas ProteOn XPR36	Bio-Rad	1760100
Software Gerenciador ProteOn	Bio-Rad	1760200	Versão 3.1.0.6
GLM Sensor Chip	de Amina 1765012		Bio-Rad
		1762410	Inclui EDAC (EDC), sulfo-NHS, etanolamina HCl
Kit de Regeneração e Condicionamento e Tampões	Bio-Rad	1762210	Inclui 1 tampão glicina (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), e NaOH, SDS, HCl, ácido fosfórico, NaCl; 50 mL cada solução
2 L de tampão PBS/Tween/EDTA	Bio-Rad	1762730	Inclui solução salina tamponada com hosfato (PBS), pH 7,4, 0,005% Tween 20, 3 mM EDTA
Octeto RED384 Sistema	Forté
Software de análise de dados	Forté		Versão 9.0.0.4
Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors	Forté Bio	18-5060	Uma bandeja de 96 biossensores
Placa de Fundo Inclinado de 384 Poços	Forteé Bio	18-5080
Dispensador de Biossensor	Forté Bio	18-5016
Kinetics Buffer 10x	Forteé Bio	18-1092	concentração de 10x. Contém ProClin 300.
Sistema IBIS MX96 SPRi	Wasatch Microfluídica
Microfluídica Microfluídica Fluxo Contínuo Microspotter (CFM) Impressora	Wasatch Microfluídica		Versão 2.0
Chip SensEye COOH-G	Wasatch Microfluídica		1-09-04-004
Software de Análise de Dados	Wasatch Microfluídica		Versão 6.19.3.17
Software	de Análise de Dados SPRintWasatch Microfluídica		Versão 6.15.2.1
Purificador 2	Software		Versão 2
Pierce Proteína Recombinante A/G	ThermoFisher Scientific	21186