Artigo de método

Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina

DOI:

10.3791/55689

⸱

27 de junho de 2017

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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As interações DNA-proteína são essenciais para múltiplos processos biológicos. Durante a avaliação das funções celulares, a análise das interações DNA-proteína é indispensável para a compreensão da regulação gênica. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é uma poderosa ferramenta para analisar essas interações in vivo.

Resumo

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Múltiplos processos celulares, incluindo replicação e reparo de DNA, recombinação de DNA e expressão gênica, requerem interações entre proteínas e DNA. Portanto, as interações DNA-proteína regulam diversas funções fisiológicas, fisiopatológicas e biológicas, como a diferenciação celular, proliferação celular, controle do ciclo celular, estabilidade cromossômica, regulação de genes epigenéticos e transformação celular. Em células eucarióticas, o DNA interage com proteínas de histonas e não-histonas e é condensado em cromatina. Várias ferramentas técnicas podem ser usadas para analisar as interações DNA-proteína, como o Ensaio de Mudança de Mobilidade de Eletroforese (gel) (EMSA) e a pegada DNase I. No entanto, essas técnicas analisam a interação proteína-DNA in vitro , não dentro do contexto celular. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é uma técnica que captura proteínas em seus locais específicos de ligação ao DNA, permitindo assim a identificação da interação DNA-proteínaS dentro do contexto da cromatina. É feito por fixação da interação DNA-proteína, seguida de imunoprecipitação da proteína de interesse. Posteriormente, o sítio genômico com o qual a proteína estava ligada caracteriza-se. Aqui, descrevemos e discutimos ChIP e demonstram seu valor analítico para a identificação da ligação induzida pelo Fator de Crescimento Transformante-β (TGF-p) do fator de transcrição SMAD2 para elementos de ligação SMAD (SBE) dentro da região promotora da proteína tirosina- Fator de células-tronco do ligando do receptor de proteína quinase Kit (c-KIT) (SCF).

Introdução

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No núcleo de eucariotas, o DNA interage com proteínas histonas e proteínas não-histônicas e é condensado em cromatina. No contexto fisiológico, fisiopatológico e biológico, as funções celulares são controladas espacialmente e temporariamente pela expressão de genes coordenados com cromatina. As interações DNA-proteína têm um papel essencial na regulação dos processos celulares, como a replicação, recombinação e reparo do DNA, bem como a expressão protéica. Portanto, a análise das interações DNA-proteína é uma ferramenta indispensável na avaliação da expressão gênica e da função celular.

Existem várias técnicas para avaliar as interações DNA-proteína in vitro , como o Ensaio de Mudança de Mobilidade de Eletroforese (gel) (EMSA) e a pegada DNase I 1 , 2 . No entanto, essas técnicas não analisam a interação proteína-DNA dentro da cromatina e do contexto celular. ChIP iUma técnica que captura proteínas ligadas aos seus locais de ligação de ADN específicos e, assim, facilita a identificação de interações DNA-proteína dentro do contexto da cromatina. A técnica foi originalmente desenvolvida por Gimour e Lis para avaliação da ligação da ARN polimerase II a genes específicos em Escherichia coli e Drosophila melanogaster 3 , 4 . É feito por fixação dos complexos DNA-proteína, seguido de extração de cromatina e corte do DNA em ~ 200 fragmentos de pares de bases (pb). Posteriormente, a proteína de interesse do DNA de interesse é isolada por imunoprecipitação. Após a reversão da reticulação de proteína de DNA, o DNA é purificado e analisado. Podem ser utilizados vários métodos para a análise dos sítios de ligação à proteína e dependem da sequência de ácido nucleico do sítio de ligação à proteína dentro do gene alvo 5 . Nos casos em que a sequência de DNA é conhecida, Pol padrãoReações de cadeia de imerase (PCR) podem ser aplicadas, utilizando pares de iniciadores específicos que flanqueiam o site de ligação conhecido. A PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) também pode ser usada 6 . Nos casos em que a seqüência é desconhecida, o ChIP pode ser combinado com microarrays de DNA (ChIP-on-chip), sequenciação de DNA (ChIP-seq) ou técnicas de clonagem 7 , 8 , 9 .

A via TGF-β possui potentes funções de supressão de tumores e é uma via chave na diferenciação celular. É ativado através da ligação do ligando de TGF-p1 ao seu complexo de receptores cognatos, resultando na fosforilação de serina de fatores de transcrição SMAD2 / 3. Após a sua associação com o mediador comum, SMAD4, o complexo SMAD se transloca para o núcleo e se liga ao SBE dentro da região promotora dos genes alvo, onde regula os genes que controlam o ciclo celular, a apoptose e a diferenciação celular.em. A resposta transcricional à estimulação de TGF-β é de tipo celular e específica do contexto 10 . Recentemente, descrevemos um loop de feedback positivo entre TGF-β e a via C-KIT 11 . Neste modelo, o SMAD2 activado por TGF-β1 liga-se ao promotor do ligando c-KIT e induz a sua expressão e secreção. Posteriormente, o ligando c-KIT activa o receptor c-KIT de forma auto-para-crinica. A ativação do receptor c-KIT resulta em STAT3 Tyr 705 -fosforilação via JAK1 / 2. Após a ativação STAT3 e a translocação nuclear, STAT3 se liga ao gene do ligando TGF-β1 e regula sua expressão.

Aqui, demonstramos o papel essencial da análise de ChIP para a identificação da ligação de SMAD2 ao promotor do ligando do receptor c-KIT e para a identificação do Transdutor de sinal (e) Activador (da) Transcrição 3 (ligação de STAT3 ao TGF-β1- gene).

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Protocolo

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1. Preparação de soluções

  1. Prepare as seguintes soluções frescas para cada experiência.
    1. Para a solução de fixação , prepare 37% de formaldeído e guarde-o à RT. Dilúcle-o em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) até uma concentração final de 1,42%.
      CUIDADO: O formaldeído é classificado como irritante, corrosivo, mutagênico, teratogênico e cancerígeno. Não ingerir. Não respire gases / fumaça / vapor / spray. Em caso de ventilação insuficiente, use equipamento respiratório adequado. Evitar o contato com a pele e os olhos. Mantenha longe de incompatibilidades, como agentes oxidantes, agentes redutores, ácidos, álcalis e umidade.
    2. Para a solução de fixação de glicina, prepare glicina 0,125 M em 1x solução de PBS e guarde-a à TA.
    3. Para a solução de raspagem celular, prepare uma solução 1x PBS em dH 2 O e guarde-a em gelo. Diretamente antes do uso, adicione inibidor de proteinase fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) tUma concentração final de 0,5 mM.
      CUIDADO: PMSF é classificado como corrosivo e tóxico; Use roupas de proteção e use-a em uma área ventilada.
    4. Diretamente antes de usar o tampão de lise celular (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, KCl 85 mM e NP40 a 0,5%), adicione 1X Protease Inhibitor Cocktail (PIC; Solução de estoque 100X em dimetilsulfóxido (DMSO): 104 mM 4- ( Cloridrato de fluoreto de 2-aminoetil) benzenossulfonilo (AEBSF), aprotinina 80 uM, bestatina 4 mM, E-64 1,4 mM, leupeptina 2 mM e pepstatina A 1,5 mM e PMSF 0,5 mM.
    5. Diretamente antes de usar o tampão de lise de núcleos (Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, ácido etilenodiaminotetracético 10 mM (EDTA) e 1% de SDS), adicione PIC 1X e PMSF 0,5 mM.

2. Fixação e cisalhamento celular

  1. Cresça as células para uma confluência de 70-80% em placas de cultura de tecidos de 10 cm. Estimule as células pelos objetivos experimentais.
  2. Remova o meio de cultura de tecido, adicione 5 mL de solução de fixação e incubaAs células por 10 min na RT em uma plataforma de agitação.
  3. Remova a solução de fixação e lave as células duas vezes com 10 mL de 1x PBS gelado.
  4. Remova o 1x PBS, adicione 5 mL de solução de solução de retenção de glicina e incube as células por 5 minutos à TA em uma plataforma de agitação.
  5. Remova a solução de retenção de glicina e lave as células duas vezes com 10 mL de 1x PBS gelado.
  6. Remova o 1x PBS, adicione 2 mL de solução de raspagem celular e colhe as células usando um raspador de células. Transfira as células colhidas para um tubo cônico no gelo.
  7. Centrifugue as amostras por 10 min a 600 xg e 4 ° C.
  8. Remova o sobrenadante, ressuspenda o sedimento em 1 mL de tampão de lise celular 1X e incube em gelo durante 30 min. Alternativamente, congele o sedimento em nitrogênio líquido e guarde-o a -80 ° C.
  9. Uma vez que o sedimento é ressuspenso no tampão de lise celular, transfira a suspensão celular para um homogeneizador de densa gelado e dente por 10 golpes usando um pestl de tipo BE para a interrupção celular.
  10. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga e centrifugue as amostras por 10 min a 2.400 xg e 4 ° C.
  11. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o sedimento em 350 μL de tampão de digestão de núcleos e incube as amostras durante 5 min a 37 ° C.
  12. Adicione nuclease microcócica (1 U / μL) e misture por vortex. Incubar as amostras a 37 ° C durante 5-20 min; Misture as amostras a cada 2 min por inversão.
    NOTA: O tempo e a concentração da enzima diferem entre as linhas celulares e podem exigir otimização em casos de cárie enzimática sub-ótima.
  13. Alternativamente, obtenha o cisalhamento de cromatina por sonicação usando sondas sonoras comercialmente disponíveis.
    NOTA: As condições de sonicação exigirão otimização. Um protocolo de exemplo de otimização é fornecido abaixo usando um volume de amostra de 300 μL e uma potência de processamento de amostra de 25%.
    1. Seguindo o passo 2.10, descarte o sobrenadante e ressuspenda o nPílula de uclear em 1,0 mL de tampão de cisalhamento comercial.
    2. Alíquota 300 μL do sedimento nuclear ressuspenso em três tubos de microcentrífuga de 1,7 mL. Coloque-os no gelo.
    3. Corte as 3 alíquotas de cromatina fixa com 25% de potência usando 3 condições diferentes para determinar as condições ideais de sonicação:
      5 pulsos de 20 s cada, com um descanso de 30 s no gelo entre cada pulso.
      10 pulsos de 20 s cada, com um descanso de 30 s no gelo entre cada pulso.
      20 pulsos de 20 s cada, com um descanso de 30 segundos no gelo entre cada pulso.
    4. Continue com a Etapa 2.15, conforme descrito abaixo.
  14. Após a incubação com a nuclease microcócica, adicione 7 μL de EDTA 0,5 M gelado para parar a reação.
  15. Centrifugue as amostras com o DNA cortado por 10 min a 16.200 xg e 4 ° C.
  16. Transfira o sobrenadante que contém o DNA cortado para um tubo de microcentrífuga fresco. Alíquota 50 μL em um tubo separado de microcentrífuga para confirmar o suCessão excessiva do DNA (seção 3). Use o volume restante imediatamente para imunoprecipitação (seção 4) ou guarde-o a -80 ° C.

3. Confirmação da Eficiência de Cisalha

  1. Adicionar 150 μL de dH2O livre de nuclease e 10 μL de NaCl 5 M até a alíquota de 50 μL da cromatina cortada a partir do passo 2.16.
  2. Incubar as amostras a 65 ° C durante 4 h para reverter as reticências.
  3. Adicionar 2 μL de RNase A (10 μg / μL) e incubar as amostras a 37 ° C durante 15 min.
  4. Adicionar 10 μL de proteinase K (0,5 μg / μL) e incubar as amostras a 42 ° C durante 90 min.
  5. Para a purificação do DNA, realize uma extração de fenol / clorofórmio 12 .
    1. Adicione água livre de nuclease a um volume final de 200 μL. Adicione 200 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1) à amostra e vortex por 20 s.
    2. Centrífuga no quartoPor 5 min a 16 000 x g. Retire cuidadosamente a fase aquosa superior e transfira-a para um tubo fresco. Certifique-se de não transportar qualquer fenol durante a pipetagem.
    3. Adicione 0,1 volumes de acetato de sódio 3 M (NH 4 OAc), pH 5,2 e misture movendo várias vezes o tubo com um dedo. Adicione 2,5 volumes de etanol a 100% gelado e misture com vortex por 5 s. Incubar a amostra O / N a -20 ° C, ou durante pelo menos 1 h a -80 ° C.
    4. Centrifugar a amostra por 30 min a 4 ° C e 16.000 xg para sedimentar o cDNA.
    5. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem interromper a pelotização. Adicione 1 mL de RT, 70% de etanol e inverta o tubo várias vezes.
    6. Centrifugar a amostra por 2 minutos a 4 ° C e 16.000 x g. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
    7. Secar o grânulo por 5-10 minutos à TA. Ressuspender o grânulo em 30 μL de dH2O.
  6. Use uma alíquota de 5 e 10 μL do DNA purificado para eletroforese em gel com TAE a 1%Gel de agarose.
    NOTA: O sucesso do corte de cromatina resulta em um padrão de DNA de 200-1.500 pb. Se o corte não for bem sucedido, determine as condições de corte ideal para as células específicas, modificando o tempo de incubação do passo de corte (etapa 2.12) para 5, 10 e 15 min.
  7. Use a amostra restante para analisar a concentração de DNA da amostra. Calcular de forma inversa a concentração de DNA na amostra de cromatina cortada (etapa 2.16); Use as mesmas quantidades de DNA para cada grupo de tratamento para a imunoprecipitação (seção 4).

4. Imunoprecipitação

  1. Combine 10-25 μg da cromatina cortada e reticulada (passo 2.16) com 25 μL de pérolas magnéticas de proteína G de grau ChIP, 10 μL de tampão de diluição de imunoprecipitação (solução de reserva: 0,01% de SDS, 1,9% de Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1,2 mM e NaCl 167 mM) e 1 μL de PIC.
  2. Após 4 h de incubação, adicione 1-10 μg de anticorpo (o concentrador de anticorpoAção variará com base na afinidade do anticorpo; Deve ser inicialmente usado por recomendações do fabricante e otimizado experimentalmente se necessário) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicionar dH2O até um volume final de 100 μL.
    NOTA: Em vez do método de imunoprecipitação direta descrito acima, o método de imunoprecipação indireta pode ser usado pela primeira combinação da cromatina com os anticorpos e subsequentemente adicionando grânulos magnéticos de proteína G.
  3. Incubar as amostras em um rotador de ponta a ponta durante 4-12 h a 4 ° C.

5. Eluição

  1. Coloque os tubos em um suporte magnético. Uma vez que os grânulos magnéticos se agregam no lado do tubo, remova cuidadosamente e descarte o sobrenadante.
  2. Lavar as esferas três vezes com 800 μL de tampão de lavagem 1 (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, 2 mM de EDTA pH 8, 20 mM de Tris-HCl, pH 8 e 150 mM de NaCl); Misture invando o tubo várias vezes. Coloque o tubo no suporte magnético aE retire cuidadosamente e descarte o tampão de lavagem uma vez que as pérolas magnéticas se agregam no lado do tubo.
  3. Lavar as esferas uma vez com 800 μL de tampão de lavagem 2 (SDS a 0,1%, Triton X-100 a 1%, EDTA 2 mM, pH 8, Tris-HCl 20 mM pH 8 e NaCl 500 mM); Misture invando o tubo várias vezes. Coloque o tubo no suporte magnético e remova cuidadosamente e descarte o tampão de lavagem uma vez que as pérolas magnéticas se agregam no lado do tubo.
  4. Ressuspender as esferas em 50 μL de tampão de eluição (SDS a 1% e NaHCO3 100 mM) e incubar as amostras em um rotador de ponta a ponta durante 15 minutos à TA.
  5. Coloque os tubos em um suporte magnético, e uma vez que os grânulos magnéticos se acumulam no lado do tubo, transfira o sobrenadante para um tubo fresco.
  6. Adicione 6 μL de NaCl 5 M, para reverter a reticulação e 2 μL de proteinase K (0,5 μg / μL). Depois de misturar as amostras, incubar as amostras durante 2 h a 65 ° C.
  7. Para a purificação do DNA, execute um pheExtracção nol / clorofórmio 12 (passo 3.5) e subsequentemente ressuspender o grânulo em 30 μL de dH2O.
    NOTA: As amostras podem ser analisadas diretamente para locais de ligação de proteínas (seção 5) ou podem ser armazenadas a -20 ° C.

6. Análise do site de ligação

  1. Realizar uma análise para locais de ligação específicos dentro de uma sequência conhecida de ácido nucleico usando PCR ou qRT-PCR. Para o projeto do primer, siga os protocolos convencionais de PCR ou qRT-PCR. Desenhe os iniciadores para sintetizar um amplicon de 150-400 pb que faz uma ponte sobre o local de ligação da proteína de interesse ( Figura 1 ).
  2. Configure a PCR usando quatro modelos de DNA diferentes para assegurar a especificidade: i) DNA de ChIP imunoprecipitado com o anticorpo de interesse, ii) DNA de ChIP imunoprecipitado com um anticorpo IgG não específico, iii) DNA de entrada e iv) H2O como um Controle negativo para o PCR para excluir a contaminação. No caso da estimulação do caminho, Escolha um quinto modelo usando um conjunto diferente de primers específicos para um site de ligação conhecido da proteína imunoprecipitada.
    NOTA: No caso da análise do promotor do ligando c-KIT, use PCR convencional para demonstrar a ligação SMAD induzida por TGF-β no SBE dentro da região promotora do ligando c-KIT. Como um controlo positivo, realizar PCR no inibidor-1 do activador do plasminogénio (PAI-1) como um alvo conhecido da ligação de SMAD induzida por TGF-p.

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Resultados

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A ligação do ligando de TGF-p1 ao seu complexo de receptor cognato resulta na fosforilação de serina de fatores de transcrição de SMAD2 / 3, seguidos de sua associação com o mediador comum, SMAD4. O complexo SMAD se transloca para o núcleo. O TGF-p pode regular a transcrição do gene, quer directamente através da ligação do SMAD aos SBEs dentro das regiões reguladoras dos genes alvo, quer indirectamente através da expressão regulada por SMAD de activadores transcricionais ou repressores q...

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Discussão

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Neste relatório, demonstramos a ligação induzida por TGF-β1 de SMAD2 a um SBE dentro do promotor do ligando c-KIT e à ligação induzida por TGF-p1 de STAT3 à sua sequência de reconhecimento dentro do gene do ligando TGF-β1. Demonstamos ligação induzida por citocinas de ambos os fatores de transcrição usando imunoprecipitação com cromatina.

A imunoprecipitação da cromatina é uma ferramenta poderosa para demonstrar a ligação direta de uma proteína de interesse para o DNA, para caracterizar os e...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (Startup Funds, BB).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células HepG2ATCCHB-8065
Células Hep3BATCCHB-8064
TGF-β 1R& D Systems101-B1Usado a uma concentração de 10 ng/mL
Anti-SMAD2 anticorpoTecnologia de Sinalização Celular5339Quantidade usada/IP: 3 µ g
Anti-STAT3anticorpo Tecnologia de Sinalização Celular4904Quantidade usada/IP: 3 µ g
ChIP-IT Proteína G Grânulos MagnéticosMotivo Ativo53033
Coquetel de Inibidor de ProteaseMotivo Ativo37490
Tecnologia de SinalizaçãoCélulas de Nuclease Microcócica10011
PCR Primer direto: PAI-1Sequência: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'
Primer reverso de PCR: Sequência PAI-1: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'
Primer direto de PCR: Sequência SCF: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'  
Primer reverso de PCR: Sequência SCF: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'
Primer direto de PCR: TGF-β 1 (STB-1)Sequência: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3'  
Primer reverso de PCR: TGF-β 1 (STB-1)Sequência: 5'-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3'  
Primer direto de PCR: TGF-β 1 (STB-2)Sequência: 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3'        
Primer reverso de PCR: TGF-β 1 (STB-2)Sequência: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3'    
de

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Promotor do c KITIntera o Prote na DNALiga o de SMAD2Sinaliza o de TGF BetaFator de C lula TroncoLiga o de Fator de Transcri oEnsaio de PromotorLiga o de STAT3Diferencia o Celular

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