Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina

Resumo

As interações DNA-proteína são essenciais para múltiplos processos biológicos. Durante a avaliação das funções celulares, a análise das interações DNA-proteína é indispensável para a compreensão da regulação gênica. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é uma poderosa ferramenta para analisar essas interações in vivo.

Resumo

Múltiplos processos celulares, incluindo replicação e reparo de DNA, recombinação de DNA e expressão gênica, requerem interações entre proteínas e DNA. Portanto, as interações DNA-proteína regulam diversas funções fisiológicas, fisiopatológicas e biológicas, como a diferenciação celular, proliferação celular, controle do ciclo celular, estabilidade cromossômica, regulação de genes epigenéticos e transformação celular. Em células eucarióticas, o DNA interage com proteínas de histonas e não-histonas e é condensado em cromatina. Várias ferramentas técnicas podem ser usadas para analisar as interações DNA-proteína, como o Ensaio de Mudança de Mobilidade de Eletroforese (gel) (EMSA) e a pegada DNase I. No entanto, essas técnicas analisam a interação proteína-DNA in vitro , não dentro do contexto celular. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é uma técnica que captura proteínas em seus locais específicos de ligação ao DNA, permitindo assim a identificação da interação DNA-proteínaS dentro do contexto da cromatina. É feito por fixação da interação DNA-proteína, seguida de imunoprecipitação da proteína de interesse. Posteriormente, o sítio genômico com o qual a proteína estava ligada caracteriza-se. Aqui, descrevemos e discutimos ChIP e demonstram seu valor analítico para a identificação da ligação induzida pelo Fator de Crescimento Transformante-β (TGF-p) do fator de transcrição SMAD2 para elementos de ligação SMAD (SBE) dentro da região promotora da proteína tirosina- Fator de células-tronco do ligando do receptor de proteína quinase Kit (c-KIT) (SCF).

Introdução

No núcleo de eucariotas, o DNA interage com proteínas histonas e proteínas não-histônicas e é condensado em cromatina. No contexto fisiológico, fisiopatológico e biológico, as funções celulares são controladas espacialmente e temporariamente pela expressão de genes coordenados com cromatina. As interações DNA-proteína têm um papel essencial na regulação dos processos celulares, como a replicação, recombinação e reparo do DNA, bem como a expressão protéica. Portanto, a análise das interações DNA-proteína é uma ferramenta indispensável na avaliação da expressão gênica e da função celular.

Existem várias técnicas para avaliar as interações D....

Protocolo

1. Preparação de soluções

1. Prepare as seguintes soluções frescas para cada experiência.
   1. Para a solução de fixação , prepare 37% de formaldeído e guarde-o à RT. Dilúcle-o em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) até uma concentração final de 1,42%.
      CUIDADO: O formaldeído é classificado como irritante, corrosivo, mutagênico, teratogênico e cancerígeno. Não ingerir. Não respire gases / fumaça / vapor / spray. Em caso de ventilação insuficiente, use equipamento respiratório adequado. Evitar o contato com a pele e os olhos. Mantenha longe de incompatibilidades, como agentes oxidantes, agentes redutores, á....

Resultados

A ligação do ligando de TGF-p1 ao seu complexo de receptor cognato resulta na fosforilação de serina de fatores de transcrição de SMAD2 / 3, seguidos de sua associação com o mediador comum, SMAD4. O complexo SMAD se transloca para o núcleo. O TGF-p pode regular a transcrição do gene, quer directamente através da ligação do SMAD aos SBEs dentro das regiões reguladoras dos genes alvo, quer indirectamente através da expressão regulada por SMAD de activadores transcricionais ou repressores q.......

Discussão

Neste relatório, demonstramos a ligação induzida por TGF-β1 de SMAD2 a um SBE dentro do promotor do ligando c-KIT e à ligação induzida por TGF-p1 de STAT3 à sua sequência de reconhecimento dentro do gene do ligando TGF-β1. Demonstamos ligação induzida por citocinas de ambos os fatores de transcrição usando imunoprecipitação com cromatina.

A imunoprecipitação da cromatina é uma ferramenta poderosa para demonstrar a ligação direta de uma proteína de interesse para o DNA, para caracterizar os e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células HepG2	ATCC	HB-8065
Células Hep3B	ATCC	HB-8064
TGF-β 1	R& D Systems	101-B1	Usado a uma concentração de 10 ng/mL
Anti-SMAD2 anticorpo	Tecnologia de Sinalização Celular	5339	Quantidade usada/IP: 3 µ g
Anti-STAT3	anticorpo Tecnologia de Sinalização Celular	4904	Quantidade usada/IP: 3 µ g
ChIP-IT Proteína G Grânulos Magnéticos	Motivo Ativo	53033
Coquetel de Inibidor de Protease	Motivo Ativo	37490
Tecnologia de Sinalização	Células de Nuclease Microcócica	10011
PCR Primer direto: PAI-1			Sequência: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'
Primer reverso de PCR: Sequência PAI-1			: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'
Primer direto de PCR: Sequência SCF			: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'
Primer reverso de PCR: Sequência SCF			: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'
Primer direto de PCR: TGF-β 1 (STB-1)			Sequência: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3'
Primer reverso de PCR: TGF-β 1 (STB-1)			Sequência: 5'-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3'
Primer direto de PCR: TGF-β 1 (STB-2)			Sequência: 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3'
Primer reverso de PCR: TGF-β 1 (STB-2)			Sequência: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3'

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