Method Article

Um método para testar o efeito de sugestões ambientais no comportamento de acoplamento em Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55690

⸱

July 17th, 2017

 , 
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstramos um ensaio para analisar as pistas ambientais e genéticas que influenciam o comportamento de acasalamento na mosca da fruta Drosophila melanogaster .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A movimentação sexual de um indivíduo é influenciada pelo genótipo, experiência e condições ambientais. A forma como esses fatores interagem para modular os comportamentos sexuais permanece mal compreendida. Em Drosophila melanogaster , as pistas ambientais, como a disponibilidade de alimentos, afetam a atividade de acasalamento oferecendo um sistema atraente para investigar os mecanismos que modulam o comportamento sexual. Em D. melanogaster , as sugestões ambientais são muitas vezes detectadas através dos sistemas gustativos e olfativos quimiossensíveis. Aqui, apresentamos um método para testar o efeito de pistas químicas ambientais sobre o comportamento de acasalamento. O ensaio consiste em uma pequena arena de acasalamento contendo meio alimentar e um casal de acasalamento. A frequência de acasalamento para cada casal é monitorada continuamente por 24 h. Aqui apresentamos a aplicabilidade deste ensaio para testar compostos ambientais de uma fonte externa através de um sistema de ar pressurizado, bem como a manipulação dos componentes ambientais diretamente na arena de acasalamento. VocêUm sistema de ar pressurizado é especialmente útil para testar o efeito de compostos muito voláteis, enquanto a manipulação de componentes diretamente na arena de acasalamento pode ser útil para determinar a presença de um composto. Este ensaio pode ser adaptado para responder a perguntas sobre a influência de pistas genéticas e ambientais sobre comportamento e fecundidade de acasalamento, bem como outros comportamentos reprodutivos masculinos e femininos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os comportamentos reprodutivos tipicamente têm altos custos de energia, especialmente para as mulheres, que produzem gametas maiores do que os machos e devem escolher cuidadosamente as condições para elevar sua prole em desenvolvimento. Devido ao custo da energia, não é surpreendente que a reprodução esteja ligada a condições nutricionais. Isso é verdade na maioria, se não em todos, animais, incluindo mamíferos, cuja puberdade pode ser adiada pela desnutrição e cuja excitação sexual pode ser afetada negativamente pela restrição alimentar 1 .

A reprodução do organismo modelo genético Drosophila melanogaster também é afetada por condições nutricionais. Tribunal dos machos em nível superior na presença de voláteis alimentares 2 , e as mulheres são mais receptivas sexualmente na presença de fermento, um importante nutriente para a produção de ovos e a sobrevivência da prole 3 , 4 , 5 . esteA resposta reprodutiva reproduzida evolutiva aos alimentos oferece a oportunidade de estudar mecanismos que conectem a disponibilidade de alimentos ambientais à reprodução sexual em um organismo genéticamente atraente e eficiente em termos de tempo. Na verdade, o trabalho em D. melanogaster implicou a via da insulina como um importante regulador da conexão entre alimentação e comportamento de acasalamento 6 . Também mostrou que o ato de se acasalar altera a preferência alimentar das fêmeas, bem como os neurônios quimiossensíveis associados 7 , 8 , 9 .

É claro que as indicações alimentares afetam os comportamentos reprodutivos em D. melanogaster . Esses efeitos parecem afetar principalmente as fêmeas, especificamente aqueles que já se acasalaram 5 . No entanto, para testar esses efeitos agudos das condições ambientais, o ensaio clássico usado para o comportamento de acasalamento feminino podeNão seja muito adequado devido às longas interrupções entre os episódios de acasalamento. No clássico ensaio de rematamento, uma fêmea virgem primeiro mata com um macho e é imediatamente isolada e apresentou um novo macho 24 a 48 h depois. Este ensaio clássico tem sido usado com grande sucesso para identificar componentes da ejaculação masculina que modificam o comportamento feminino e a resposta feminina 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . O ensaio de acoplamento contínuo demonstrado aqui é, portanto, uma adição aos ensaios clássicos de acoplamento que podem ser usados ​​para estudar o efeito agudo das condições ambientais nos comportamentos reprodutivos.

Usando o ensaio contínuo para comportamento de acasalamento que é explicado aqui, anteriormente mostramos que um par de moscas expostas à fermento irá remeter sSempre em um período de observação de 24 h 5 , 19 , 20 , 21 , enquanto as moscas não expostas aos alimentos só serão rematadas uma vez 5 . Esta descoberta pode ser intrigante à luz de uma grande parte da literatura de D. melanogaster , indicando que as fêmeas não remontam por vários dias após um acasalamento inicial (revisado nas referências 10 , 11 ). No entanto, esta discrepância pode ser facilmente explicada por condições de ensaio, onde uma fêmea é isolada por um a vários dias antes de uma nova oportunidade de acasalamento ser fornecida. Se o par não se acasalar nesse período de observação de uma hora, a fêmea é caracterizada como não receptiva. Além disso, a alta freqüência de acasalamento não deve ser surpreendente, dado que os dados de moscas selvagens mostram que as fêmeas contêm esperma de 4 a 6 machos em seus órgãos de armazenamento; Assim, emDicionando que as fêmeas naturalmente remontam várias vezes 22 , 23 .

Aqui, demonstramos o uso deste ensaio de acoplamento contínuo para desvendar como as moscas se reúnem e combinam informações sobre condições ambientais para modular a freqüência de acasalamento. Este ensaio permite testar um número relativamente grande de casais de acasalamento para estudos genéticos e testar a influência de pistas ambientais voláteis e não voláteis. O ensaio normalmente é executado por 24 h, mas pode ser prolongado para 48 h, permitindo o teste de pistas ambientais de ciclagem, como o ciclo luz-escuro (LD). Demonstramos este ensaio testando a influência das pistas voláteis de uma cultura de fermento dentro de um sistema de ar pressurizado em combinação com a disponibilidade de nutrientes de fermento não volátil no substrato alimentar.

O sistema de ar pressurizado bombeia continuamente sinais voláteis para uma arena de acasalamento que contémUm substrato alimentar e um casal teste (cujo comportamento de acasalamento é monitorado). Para determinar ainda mais as especificidades através das quais a levedura influencia o acasalamento, testamos um grande composto volátil de fermento, a saber, ácido acético 24 , em combinação com um teor de aminoácidos que corresponde ao de fermento no substrato alimentar, na forma de peptona (amino Ácidos derivados da digestão enzimática de proteínas animais). Juntos, essas experiências demonstram como o efeito de pistas ambientais sobre o comportamento de acoplamento de D. melanogaster pode ser testado com este ensaio.

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Protocol

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1. Caixa de acoplamento ambientalmente controlada

  1. Para garantir uma área de teste controlada e fácil de limpar, configure um armário de cozinha de aço inoxidável de 120 cm x 64 cm x 85 cm como ilustrado na Figura 1A.
    1. Faça um furo na parte de trás do armário logo abaixo do teto e quatro conjuntos de quatro furos nos lados, cada um com um diâmetro de 2 cm. Perfure os dois primeiros conjuntos de quatro furos, em cada lado da caixa a uma altura de 7 cm do fundo da caixa e com 12,5 cm entre os orifícios. Perfure os outros dois conjuntos de cada lado da caixa a uma altura de 35 cm da parte inferior.
      NOTA: Os quatro conjuntos de quatro furos são usados ​​para cabos de alimentação da câmera e tubulação da bomba de ar para entrar e sair do armário. O furo na parte de trás é usado para os cabos de alimentação de uma placa de luz.
    2. Construa uma placa de luz com 18 linhas de 40 diodos emissores de luz brancos e vermelhos alternativos (LED) com espaço de 2,5 cm entre cada luz. Montar os LEDs brancos e vermelhos em um circuiT com fonte de alimentação. Conecte cada LED em série com um resistor de 560 Ω, 0,25 W e 5% de tolerância.
      NOTA: Os comprimentos de onda de emissão da luz vermelha foram de 590-661 nm com um pico afiado a 627 nm. A intensidade da luz resultante na área experimental é de aproximadamente 900 lux com luzes e 90 lux com apenas as luzes vermelhas acesas; Isso foi medido usando um aplicativo de medidor de luz do smartphone.
    3. Coloque a placa de luz na parte superior do armário de aço inoxidável e passe os cabos de alimentação através do orifício na parte traseira.
    4. Conecte o adaptador dos LEDs brancos a um temporizador de controle de energia para permitir desligar o LED branco durante a fase escura do experimento. Conecte o adaptador da luz vermelha, que voa é cego para 25 , para uma fonte de alimentação regular para mantê-los ativados durante toda a duração do experimento.
    5. Fixar um suporte de metal de 110 cm e dois 54 cm de comprimento, cada um com uma largura de 0,5 cm, nos lados internos da caixa a uma altura de 50Cm da parte inferior da caixa. Coloque uma placa de difusão de vidro fosco (dimensões de 119,0 cm x 54,5 cm x 0,5 cm) nestes suportes.
    6. Adicione três camadas de papel de filtro (120 cm x 50 cm) entre a placa de luz e a placa de vidro para difundir a luz e limitar o brilho na superfície das arenas de acoplamento (descrito na seção 4). Empurre duas folhas de papel de filtro juntas em sua borda longa com varas de madeira de 120 cm de comprimento usando ímãs (no lado), para enfiá-las no interior do armário metálico; Execute esta ação 3 vezes.
    7. Anexe quatro ventiladores nos lados da caixa para criar um fluxo de ar que apresente continuamente a caixa de acasalamento. Anexe o primeiro conjunto de ventiladores de 8 cm entre a placa de luz e a placa de vidro, com a entrada de ar no lado esquerdo e o escape no lado direito da caixa, para minimizar a acumulação de calor gerada pela placa de luz.
    8. Conecte o segundo conjunto de ventiladores de 12 cm a 25 cm acima da parte inferior do armário para criar um fluxo de ar externo que apresente o iNo lado do armário e esfria até um estável de 26 ° C. Conecte os ventiladores do lado de escape a uma mangueira de sucção e guie o fluxo de ar para fora da sala para evitar o reciclado do ar no gabinete.
  2. Configure dois suportes (aproximadamente 48 cm de altura) montados com duas braçadeiras, um a 28 cm e um a 30 cm da base do suporte. Corrija uma webcam em cada uma das braçadeiras. Conecte as 4 câmeras a um computador que executa o software de monitoramento.
  3. Coloque folhas A4 debaixo de cada webcam. Use folhas ou folhas brancas não impressas com grade pré-numerada de 7 por 5 quadrados com eixos de 4 cm para acomodar arenas de acasalamento (descrito na seção 4).
    NOTA: Uma câmera de webcam HD com visão de grande angular de 78 ° e resolução de 5 milhões de pixels pode cobrir uma área de 21 cm x 30 cm correspondente a uma folha A4 e monitorar entre 20 e 35 arenas de acasalamento.

2. Criação e coleta de moscas

  1. Coloque 20 machos e 20 fêmeas de tipo selvagem Canton-SVoa em garrafas de criação de moscas contendo 45 mL de meio rico de mosca média (ver seção 3) por três a quatro dias. Transfira os mesmos adultos três vezes, primeiro tocando-os e depois em garrafas frescas.
    1. Coloque as garrafas em uma incubadora a 25 ° C e 12 h: 12 h luz-escuro ciclo com luzes acesas às 09:00 (horário Zeitgeber (ZT) 0). Uma nova geração aparecerá cerca de 10 dias depois.
  2. Anestesiar as moscas recém-eclosed resultantes nas almofadas de dióxido de carbono por não mais de 5 minutos e recolhê-las em frascos de mosca usando um pincel.
    1. Recolher fêmeas virgens (recém-fechadas) e machos virgens das garrafas de estoque de tipo selvagem de Cantão-S em frascos de criação de mosca de 2,5 cm x 9,5 cm com 6,5 mL de meio rico de mosca.
  3. Idade, as moscas nos grupos do mesmo sexo de 20 moscas cada vez em frascos de criação de mosca por 5 a 8 dias a 25 ° C e 12 h: 12 h ciclo luz-escuro e luzes acesas às 09:00 (ZT 0).
  4. TransfAs moscas para os frascos de criação de moscas frescas no dia anterior ao experimento.

3. Preparação do Meio Ambiente

  1. Prepare 1 L de meio de mosca rico da seguinte maneira.
    1. Despeje 1 L de água da torneira em um copo de vidro de 2 L com uma barra de agitação magnética e coloque o copo em uma placa magnética quente. Mantenha a agitação e gire o aquecimento até 300 ° C até atingir a temperatura de ebulição.
      NOTA: Durante o tempo de ebulição longo nas etapas a seguir, uma proporção de água irá evaporar, mas, juntamente com os ingredientes adicionados, este protocolo resulta em 1 L de meio de mosca rico quando preparado a temperatura ambiente de aproximadamente 22 ° C.
    2. Ligue a agitação para 500 rodadas por minuto (rpm) e adicione os seguintes ingredientes à água a ferver: 10 g de ágar, 30 g de glicose, 15 g de sacarose, 15 g de farinha de milho, 10 g de germe de trigo, 10 g de farinha de soja, 30 g Melaço, 35 g de fermento seco ativo. Aguarde até que o fermento espuma vigorosamente e depois baixe a temperatura da placa quenteAté 120 ° C.
    3. Após 10 minutos, aplaca a placa quente até 30 ° C e deixa a mistura mexer até arrefecer até 48 ° C. Monitore a temperatura inserindo um termômetro diretamente no alimento.
    4. Dissolver 2 g de éster metílico do ácido p-hidroxi-benzóico (tegosept, 100%) em 10 mL de etanol a 96%. Adicione isso e 5 mL de ácido propiónico 1 M à mistura. Agitar durante 3 min.
    5. Despeje o meio de alimento para moscas nas arenas (descrito na seção 4) para criar uma camada de 0,3 cm de espessura na parte inferior da arena.
      1. Use um copo de vidro de 200 mL para verter. Quando as quantidades exatas são importantes, use uma pipeta sorológica de 10 mL.
  2. Prepare o meio da mosca menos levedura exatamente como descrito no passo 3.1.1 até 3.1.5, mas deixe de lado a levedura no passo 3.1.2.
  3. Prepare o meio com ágar com ou sem peptona misturando 10 g de agar e 35 g de peptona em 1 L de água fervente e execute as etapas 3.1.4 a 3.1.5.

4. MatinG Preparação da arena

  1. Pierce um orifício de aproximadamente 0,3 cm de diâmetro no lado superior de uma placa de Petri de 3,5 cm x 1,0 cm com uma agulha de preparação aquecida (aquecida a vermelhidão em um queimador de Bunsen). Alternativamente, use um ferro de solda.
  2. Ao preparar o meio alimentar com compostos odorosos, primeiro pipeta 30 μL (1% do meio alimentar final, por exemplo, ácido acético glacial 100%) do composto desejado no prato para metade dos pratos experimentais. Deixe a outra metade dos pratos vazios para comparação.
    NOTA: Com a configuração descrita aqui, um máximo de 140 arenas pode ser testado de uma só vez.
  3. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, despeje 3 mL de meio alimentar no fundo do prato sobre o composto desejado. Cubra-o com um pano de queijo para evitar a contaminação e deixe o meio para solidificar por aproximadamente 1 h à temperatura ambiente.
  4. Coloque uma tampa no prato e fita cada um em ambos os lados. Prepare pequenos tampões de parafina para cobrir os orifícios deOs pratos puxando pedaços de película de parafina em rolos de 0,2 cm de espessura e depois cortá-los em segmentos de 0,5 cm.

5. Cultura de fermento para odor

  1. Cultivar levedura ativa seca em soro de extração de levedura de dextrose (YPD) em uma placa de Petri de 14,0 cm x 2,06 cm. Use luvas para evitar a contaminação nesta etapa.
    1. Prepare placas de agar YPD adicionando 10 g de extracto de levedura, 20 g de peptona, 22 g de glicose (0 (+) - monohidrato de glicose) e 15 g de ágar (puro) a 1 L de água ultrapura a ferver. Coloque a parte inferior da placa de Petri uma vez que tudo esteja dissolvido e guarde a cabeça na geladeira a 4 ° C, por até 2 meses.
    2. Polvilhe alguns grãos de fermento seco em uma placa média YPD, deixe-os dissolver. Em seguida, trace a placa média usando um loop estéril. Armazene a placa em uma incubadora a 30 ° C durante a noite. Depois, armazene a cultura na geladeira por não mais de 1 semana.
  2. Prepare YPD líquido médio iN 1 L de garrafas adicionando 10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona, 22 g de glicose (monohidrato de 0 (+) - glicose) e uma barra de agitação a 1 L de água ultrapura.
    1. Autoclave durante 25 minutos a 120 ° C e 1 bar de pressão. Depois, armazene as garrafas a 4 ° C por até 2 meses até o uso.
  3. Coloque tampas de garrafas abertas (4,5 cm) com um septo de silicone de 0,32 cm de espessura.
    1. Corte dois pequenos orifícios no septo para encaixar perfeitamente os acessórios de anteparas com farfalheiras. Anexe a pequena tubulação de cloreto de polivinilo (PVC) (diâmetros: 0.8 cm externo e 0,5 cm interno) para ambas as saídas que saem da garrafa e apenas uma das entradas que entram na garrafa. Veja a Figura 1B para ilustração.
    2. Enrole as tampas e tubos adequados em papel alumínio e autoclave durante 25 minutos a 120 ° C e 1 bar de pressão.
  4. Use luvas para proteger contra a contaminação nesta etapa. Dip uma ponta de pipeta estéril de 100 μL em uma das colônias de levedura da placa de ágar YPD (dEscrito em 5.1) e solte-o no frasco de líquido líquido YPD autoclavado.
    1. Capte esta garrafa líquida YPD inoculada em fermento, bem como uma garrafa de controle médio YPD (fermento não adicionado) com tampas autoclavadas montadas com entrada e saída (descritas no passo 5.3). Coloque ambos os frascos em placas magnéticas separadas e agite a 100 rpm à temperatura ambiente durante 24 h antes do início da experiência para permitir que a cultura de fermento cresça.
    2. Conecte as entradas de ambos os frascos para separar bombas de aquário para fornecer ar à cultura de fermento. Certifique-se de conectar a saída do frasco de fermento experimental a um tubo que ventila o cheiro de fermento da sala experimental para evitar interferências com o experimento.

6. Instalação da bomba de ar

  1. Conecte o tubo de PVC grande (diâmetros: 1,2 cm exterior e 0,9 cm interno) a um fornecimento de ar pressurizado e leve-o através de dois frascos Erlenmeyer de vidro de 1 L cheios com carvão ativado aos 800 mLLinha para purificar o ar. Use ar pressurizado comumente fornecido em laboratórios como suprimento de ar, ou conecte os tubos a uma bomba de ar (o ar pressurizado foi usado aqui).
    NOTA: O material da tubulação deve ser selecionado com base nas propriedades químicas do volátil e testado para evitar que o volátil fique aderente ao revestimento da tubulação (por exemplo, politetrafluoroetileno, nylon ou aço inoxidável).
  2. Faça dois separadores de ar de tubos de 15 mL e três pontas de pipeta de 1.000 μL cada.
    1. Faça três furos de ~ 1 cm de diâmetro. Primeiro queime dois orifícios, usando uma agulha de preparação aquecida (aquecida vermelha em um queimador de Bunsen), adjacente entre si apenas abaixo da tampa do tubo de 15 mL. Em seguida, faça o terceiro furo removendo o fundo do tubo.
    2. Cola as pontas de pipeta de 1.000 μL nos orifícios com a extremidade estreita apontando para fora. Corte o final das pontas da pipeta para permitir um maior fluxo de ar.
  3. Conecte o tubo de PVC grande da saída do cFrasco Erlenmeyer checo-preenchido na ponta da pipeta na parte inferior do tubo de 15 mL. Adicione pequenas saídas de tubos de PVC às duas pontas de pipeta horizontais e guie-as para um controle e uma garrafa experimental.
  4. Para evitar a contaminação do meio YPD com microorganismos, coloque a tubulação pequena em um filtro de seringa estéril (tamanho de poro de 0,45 μm) com um empuxo de plástico no conector da tubulação da antepara indo para o filtro e um parafuso no conector de antepara de plástico deixando o filtro. Em seguida, prenda a tubulação na entrada do frasco de cultura YPD (veja a Figura 1B ).
  5. Para evitar que o fermento no ar passe do balão de cultura para a arena experimental, prenda um tubo de vidro (6,5 cm de comprimento, diâmetro externo = 0,5 cm e diâmetro interno = 0,3 cm) à saída de cada frasco de cultura de YPD usando pequenas tubulações. Conecte a tubulação de PVC ao outro lado do tubo de vidro e guie-a para os orifícios inferiores (perfurados a cada lado) da caixa da experiência.
    1. Encha o tubo com fibra de vidro e enrole-o antes de usar.
  6. Adicione outro divisor de tubos de 15 mL (descrito na seção 6.2) para a pequena tubulação de PVC, em cada lado da caixa experimental, para obter dois tubos correndo para a caixa no lado experimental (mais próximo da exaustão do fluxo de ar do ventilador, à direita) E o lado de controle (mais próximo da entrada do fluxo de ar do ventilador, à esquerda).
  7. Prepare 8 x 25 mL de pipetas sorológicas cada uma com 10 saídas para testar 80 casais acoplados ao mesmo tempo, ou seja , 40 para cada condição de ar.
    1. Queime 10 furos de 0,8 cm de diâmetro, separados 2 cm na pipeta.
    2. Corte a parte externa de uma seringa de 1 mL em uma pequena (2,5 cm) e uma grande (5 cm) de saída.
    3. Cola estas saídas nos orifícios com cola quente.
    4. Enrole uma pequena faixa de filme de parafina de plástico ao redor da extremidade das tomadas e prenda uma ponta de pipeta de 1.000 μL. O diâmetro da abertura da ponta é de 0,1 cm. Use dicas limpas para cada experiência.
  8. Anexe duas pipetas sorológicas, usando um divisor de T com diâmetro externo ≥0,5 cm e pequenos pedaços de pequena tubulação de PVC, para cada uma das duas saídas em ambos os lados. Tape as pipetas na folha de papel branco (sob as câmeras na caixa de aço).
  9. Usando um monitor de fluxo de ar, ajuste o fluxo de ar para que a velocidade do ar na saída da ponta da pipeta de 1000 μL seja de 0,5 m / s. Isso corresponde a um fluxo de ar de 0,0017 L / s por dica.

7. Monitoramento do comportamento de acoplamento

  1. Use uma pipeta de boca (como descrito na referência 26 ) para colocar uma fêmea experimental em uma pequena placa de Petri (descrita na seção 4) às 15:00 horas (ZT 6) e dar-lhe 1 h para aclimatação na arena de acasalamento.
  2. Configure a caixa experimental (descrita na seção 1) da seguinte maneira:
    1. Ligue as luzes, ou seja , LEDs de luz branca em um ciclo luz-escuro de 12h: 12 conectado a um temporizador que liga oLuz às 09:00 (ZT0) e LEDs de luz vermelha contínua para permitir o monitoramento das moscas durante a fase escura do experimento. Ligue os ventiladores para limitar o aquecimento do gabinete pela fonte de luz e para garantir que o excesso de odores seja ventilado fora da área de teste.
    2. Conecte câmeras de webcam a um computador e comece com o software de monitoramento para monitoramento de imagens.
    3. Para cada câmera, defina o foco, o brilho e o zoom no software de monitoramento.
      1. Clique com o botão direito do mouse na tela da câmera, abra "propriedades da câmera" e desmarque "foco automático". Ajuste o "foco" para esclarecer a grade ou qualquer palavra escrita na folha de papel. Se necessário, altere o "brilho" e "zoom".
    4. Defina o programa do software de monitoramento para capturar 1 imagem a cada 2 min. Clique com o botão direito do mouse em cada tela da câmera e escolha "editar câmera" e depois a opção "Ações". Clique para iniciar as ações "No int regularErvais "e altere o tempo para" 2 minutos ". Escolha" Tirar foto "para selecionar ações para executar e, finalmente, clicar em" ok ".
    5. Clique com o botão direito do mouse em cada tela da câmera e selecione "iniciar o monitoramento".
  3. Após 1 h (no ZT 7), transfira um macho de tipo selvagem para a placa de Petri usando a pipeta da boca, coloque o prato nas folhas de papel A4 nas câmeras da webcam e clique em "iniciar a monitoração" por 24 h. Para a experiência da bomba de ar, coloque o prato de forma que uma saída de pipeta seja conectada ao orifício de entrada da arena de acasalamento.
  4. Para analisar o comportamento de acasalamento do casal, faça o seguinte.
    1. Selecione e abra todas as imagens em um software de visualização de imagens e passe por elas em ordem cronológica.
    2. Anote a data, o número da experiência, o número do prato e o tempo de início em uma planilha na mesma linha. Pegue a hora de início de cada arena a partir do momento em que é colocado sob a webcaM câmera. Grave o carimbo de data / hora das imagens.
    3. Marque a hora de início de cada copulação na mesma linha na planilha. Contar um acasalamento como um incidente quando o macho montou a fêmea e o casal permanece moderadamente estacionário e na mesma postura por pelo menos cinco quadros consecutivos (10 min).
      NOTA: Este critério é baseado no comprimento de copulação relatado, variando de 12 a 27 minutos em D. melanogaster , e a observação de que as cópulas de 10 min e mais são férteis 27 , 28 .
    4. Contar o número de cópulas para cada linha na planilha para determinar a frequência de acasalamento. Alternativamente, subtrai a hora de início da experiência a partir do momento do primeiro acasalamento para cada linha como medida de latência de acasalamento ou subtrai o tempo do primeiro acasalamento a partir do momento do segundo acasalamento como medida de latência de remate.
      1. Para calcular a latência de remate, certifique-se deDefina as datas do primeiro e segundo acasalamento como dias consecutivos na planilha eletrônica.
    5. Analisar os dados com modelos de efeitos mistos, assumindo a distribuição normal dos dados e incluindo a data da experiência como um fator aleatório, usando um software estatístico (veja a tabela de materiais) para determinar a significância estatística das variáveis ​​independentes - meio alimentar, Tipo de ar e interação - como descrito anteriormente 5 .
    6. Selecione o melhor modelo de explicação, realizando a eliminação de variáveis ​​independentes não significativas usando testes de razão log-verossimilhança e as informações Akaike associadas. Depois de executar o modelo, inspecione visualmente os resíduos de dados para confirmar a normalidade. Confirme a homogeneidade das variâncias usando o teste de Levene. Em caso de homogeneidade desigual, a raiz quadrada transforma os dados.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O uso desse ensaio contínuo, comportamento de acasalamento e freqüência de acoplamento em específico, pode ser determinado em condições ambientais experimentais. Para controlar as condições ambientais, transformamos um armário de cozinha de aço inoxidável em uma área de teste, com sua própria fonte de luz e difusão, o que garante uma alta abundância de luz e um mínimo de brilho do topo das arenas de acoplamento ( Figura 1A ) . A área de teste interna é completamente enca...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um ensaio para testar o comportamento de acasalamento ao longo de 24 h, enquanto controla continuamente as pistas ambientais que um casal de acasalamento tem a hipótese de usar para determinar a freqüência de acasalamento. É possível aumentar a frequência de acasalamento em resposta ao ar de fermento entregue através de um sistema de ar pressurizado quando o meio também contém levedura ( Figura 2B ). Além disso, uma resposta semelhante na freqüência de acoplamento pode ser observ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm interesses concorrentes a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Bloomington Drosophila Stock Center pelas ações da mosca; C. Gahr, JT Alkema e S. van Hasselt por sua tentativa inicial de desenvolver o ensaio de ar pressurizado; Jasper Bosman, pelo conselho sobre o cultivo de fermento; E Rezza Azanchi e Joel Levine por desenvolverem originalmente o monitoramento do lapso de tempo do comportamento de acoplamento de Drosophila . A JA Gorter foi apoiada por uma bolsa do Programa de Pós-Graduação da Escola de Pesquisa de Neurociências BCN / NWO. Este trabalho foi apoiado em parte pela organização holandesa de pesquisa científica (NWO) (referência: 821.02.020) a JC Billeter.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ArmárioArmário de
cozinha em aço inoxidávelHorecaworld7412.0105
LEDs brancosLucky Lightll-583wc2c-001Branco frio, 20 mAmp e 2 V
LEDs vermelhosLucky Ligtll-583vc2c-v1-4daComprimento de onda entre 625 nm, 20 mAmp e 6 V
ResistorRoyal OhmCFR0W4J0561A50560 ohm, 0,25 W, 250 V e 5% de tolerância
Aplicativo de medidor de luz para smartphonePatrick GiudicelliMedidor de luz/lux GRÁTIS, versão 1.1.1
Temporizador de energiaAlectoTS-121
SuportesÂngulo agudo 5 por 5 mm,  2 x 5450 e 1 x 1100 mm de comprimento
Placa1190 x 545 x 5 mm
Papel de filtro lençóisFiltros LEE220White frost
Ventilador pequenoNanoxia Silêncio profundo426028529282880 mm Ventilador de PC ultra-silencioso, 1200 RPM
Ventilador grandeNanoxia Silêncio profundo4260285292910Ventilador de PC ultra-silencioso de 120 mm, câmera de webcam de 650-1500 RPM
Logitech950270B910 HD WEBCAM OEM, Ângulo: 78 graus, resolução: 5 milhões de pixels   
Software da câmeraDeskShareMonitor de segurança pro
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Criação de moscas
Frascos de criação de moscasFlystuff32-1306oz Estoque de Drosophila garrafa
FlypadFlystuff59-114
MoscasCanton-S
Frascos de criação de moscasDominique Dutscher789008tubos de Drosophila estreitos 25x95 mm
IncubadoraSanyoMIR-154
Placa quente magnéticaHeidolph505-20000-00MR Hei-Standard
AgarCaldic Ingredientes B.V.010001.26.0
GlicoseGezond& wel1019155Dextrose/Druivensuiker
SacaroseVan GilseAçúcar granulado
FubáFlystuff62-100
Gérmen de trigoGezond& wel1017683
Farinha de sojaFlystuff62-115
MelaçoFlystuff62-117
Levedura seca ativaRed Star
TegoseptFlystuff20-258100%
Peptona (bacto)BD211677
Ácido AcéticoMerck1000631000Glacial, 100%
Greiner bio-one de petris pequeno62710235 x 10 mm com aberturas Filme de
parafinaBemis NAParafilm
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Configuração de levedura e ar pressurizado
Petridish grandeGosselinBP140-01140 x 20,6 mm
Água ultrapuraMillipore corporationMiliQ
Extrato de leveduraBD212750
Ágar (puro)BD214530bacto
Glicose (0(+)-glicose monohidratada) Merck18270000004
Open capsSchott29 240 28 GL45
Septo de siliconeVWR548-0662
Conexões de anteparo farpadoNalgene6149-0002
Grande diâmetro do tubo de: externo 1,2 cm e interno 0,9 cm
Diâmetros pequenos dos: externo 0,8 cm e interno 0,5 cm
tubo de 15 mlFalcon
Aquarium pumpSera precisionSera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W e pressão >100 mbar
Carvão ativadoSuperfishA8040400Norit Carvão ativado
de filtro descartávelWhatman10462100
Pipetas serológicasVWR612-1600
SeringaBD Plastipak300013
Cola quentePattex
Filtro de seringaWhatmanFP 30/tamanho dos poros 0,45 mm CA-S
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AnáliseSoftware estatístico
Rlme4
de metal de vidro fosco do tipo selvagem PVC tubos de PVCUnidade Pacote

References

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