Aqui apresentamos um protocolo Golgi-Cox com detalhes detalhados. Este método de mancha de tecido confiável permite uma avaliação de alta qualidade da citoarquitetura no hipocampo e em todo o cérebro, com solução de problemas mínima.
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Artigo de método
Avaliação da complexidade dendrítica do hipocampo em ratos idosos usando o método de Golgi-Cox
Neste artigo
Resumo
Resumo
As espinhas dendríticas são as protuberâncias dos eixos dendríticos neuronais que contêm sinapses excitatórias. As variações morfológicas e ramificantes dos dendritos neuronais dentro do hipocampo estão implicadas na cognição e na formação da memória. Existem várias abordagens para a coloração de Golgi, todas as quais foram úteis para determinar as características morfológicas dos corredores dendríticos e produzir um fundo claro. O presente método de Golgi-Cox, (uma pequena variação do protocolo que é fornecido com um kit de coloração Golgi comercial) foi projetado para avaliar como uma dose relativamente baixa do medicamento quimioterápico 5-flurouracil (5-Fu) afetaria a morfologia dendrítica , O número de espinhas e a complexidade da arborização dentro do hipocampo. O 5-Fu modificou significativamente a complexidade dendrítica e diminuiu a densidade da coluna em todo o hipocampo de uma maneira específica da região. Os dados apresentados mostram que o método de coloração de Golgi efManchou os neurônios maduros no CA1, o CA3 e o giro dentado (DG) do hipocampo. Este protocolo relata os detalhes de cada passo para que outros pesquisadores possam manchar de forma confiável tecido em todo o cérebro com resultados de alta qualidade e solução de problemas mínima.
Introdução
Os dendritos são a maior parte dos neurônios que recebem e processam a entrada pré-sináptica 1 . Seus processos dendríticos têm uma geometria complexa, onde os ramos proximais têm um diâmetro maior do que os ramos distal. À medida que os dendritos se desenvolvem, eles formam várias conexões com outros neurônios em um processo conhecido como arborização dendrítica. A extensão eo padrão dessa ramificação determinam a quantidade de entradas sinápticas que um dendrite pode processar adequadamente 2 .
A arborização dendrítica é um processo necessário para a plasticidade dependente da ativid....
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Protocolo
As experiências foram realizadas de acordo com os padrões éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais na UAMS.
1. Paradigma de animais e 5-Fu Injection
- Compre ratinhos de tipo selvagem C57Bl6 / J de 6 meses de idade e abrigue-os sob um ciclo constante de 12 h luz / escuridão até atingir o 1 ano de idade.
- Diluir o 5-Fu em solução salina estéril a 0,9%. Use 60 mg / kg como a dose necessária por mouse.
- Dê as injeções intraperitoneais do 5-Fu (uma vez por semana durante três semanas).
- Dê as injeções intraperitoneais ao mesmo tempo em cada dia. Por exemplo, en....
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Resultados
Os efeitos do tratamento com 5-Fu sobre a arborização dendrítica e a complexidade no hipocampo das seções cerebrais manchadas de Golgi foram quantificados e rastreados usando um software de imagem comercialmente disponível. Após o rastreamento, a arborização dendrítica, a densidade da coluna vertebral e a morfologia da coluna vertebral foram analisadas através da análise de Sholl e do índice de complexidade dendrítica (DCI). A análise de Sholl é um método analítico quantitativo que pode .......
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Discussão
Comparado com técnicas mais modernas, o método de Golgi-Cox tem várias vantagens que o tornam o método preferido para examinar a morfologia da coluna: 1) A coloração pode ser usada para essencialmente qualquer tecido, 2) Uma configuração básica de microscópio de luz é tudo o que é necessário para Adquirir imagens baseadas em Golgi, 3) A imagem de Golgi-Cox é mais rápida do que a imagem confocal, e 4) As secções coradas de Golgi são viáveis por vários meses a anos mais do que as amostras que são marcadas de forma fluor.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma concessão piloto sob o NIH P20 GM109005 (ARA) e pelo prêmio do Centro de Tradução de Neurociências IDEA P30 GM110702.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit superGolgi | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contém materiais perigosos. |
| PBS 10x concentrado em pó | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Tampa deslizante | Fisher | 12-546-14 | |
| Pipeta de transferência de 7 mL | Globo Científico | 135030 | |
| Tubos Falcon de 10 mL | BD Biosciences | ||
| Metalizado | Fisher | 01-213-105 | |
| Placa de 12 poços | BD Biosciences | ||
| Etanol de 200 provas | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| xileno | Acros Organics | 1330-20-7 | Perigoso. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| Pipeta sorológica de 25 mL | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | Instrumentos de Precisão Mundiais | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Camundongos Machos | O Laboratório Jackson | ||
| Axio Imager 2 | ZEISS | Vários componentes, consulte o site para detalhes. | |
| Câmera AxioCam MRc | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Prato de Coloração, Verde | Tecido-Tek | 62541-12 | |
| Conjunto de Prato de Coloração | Ciências da Microscopia Eletrônica | 70312-20 | |
| Enchedor de Pipetas Motorizado | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Biociência | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Biociência | ||
| Prisma | GraphPad |
Referências
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L.
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Reimpressões e permissões
