Transporte de iões celular muitas vezes pode ser avaliado pelo monitoramento pH intracelular (pHeu). Geneticamente codificado-indicadores de pH (GEpHIs) fornecem óptica quantificação do pH intracelular em células intactas. Este protocolo detalha a quantificação do pH intracelular através de celular ex vivo ao vivo-imagens de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster com pHerry, um pseudo-ratiometric geneticamente codificado indicador de pH.
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Artigo de método
PH intracelular de quantificação de óptica em Drosophila melanogaster túbulo de Malpighi epitélios com um indicador de pH fluorescente geneticamente codificado
Neste artigo
Resumo
Resumo
Transporte de íons epitelial é vital para a homeostase do íon sistêmica, bem como a manutenção dos gradientes eletroquímicos celulares essenciais. PH intracelular (pHeu) é influenciado por muitos transportadores de íons e assim monitoramento de pH, é uma ferramenta útil para avaliar a atividade de transporte. Moderna geneticamente codificado-indicadores de pH (GEpHIs) fornecem óptica quantificação de pH em células intactas na escala celular e subcellular. Este protocolo descreve em tempo real quantificação do pH celulareu regulamento em túbulos de Malpighi (MTs) de Drosophila melanogaster através de ex vivo ao vivo-imagem latente de pHerry, um pseudo-ratiometric GEpHI com pKum adequado para controlar as alterações do pH no citosol. Extraído de mosca adulta MTs são compostos de seções morfologicamente e funcionalmente distintas de epitélios de célula única camada e podem servir como um modelo acessível e geneticamente tractable para investigação de transporte epitelial. GEpHIs oferecem diversas vantagens sobre os convencionais sensíveis ao pH de corantes fluorescentes e eletrodos íon-seletivos. GEpHIs pode rotular populações de células distintas, desde elementos promotor apropriados estão disponíveis. Esse rótulo é particularmente útil em ex vivo, in vivoe em situ preparações, que são inerentemente heterogêneas. GEpHIs também permitem quantificação de pHi em tecidos intactos ao longo do tempo, sem necessidade de exteriorização de tratamento ou tecido de tintura repetidas. A principal desvantagem de GEpHIs atual é a tendência de agregar no citosol inclusões em resposta ao dano tecidual e sobre-expressão de construir. Estas deficiências, suas soluções e as vantagens inerentes de GEpHIs são demonstradas neste protocolo através de avaliação do transporte de protões (H+) basolateral nas células principais e estreladas funcionalmente distintas de mosca extraída MTs. As técnicas e a análise descrita são facilmente adaptáveis a uma grande variedade de preparações de vertebrados e invertebradas, e a sofisticação do ensaio pode ser dimensionada de ensino labs para intrincados determinação do fluxo de iões através de transportadores específicos.
Introdução
O objetivo do presente protocolo é descrever a quantificação do pH intracelular (pHi) usando um geneticamente codificado-indicador de pH (GEpHI) e demonstrar como esse método pode ser usado para avaliar o transporte de H+ basolateral em um inseto modelo d (. melanogaster) estrutura renal, túbulos de Malpighi (MT). MTs servem como órgãos excretores da mosca da fruta e são funcionalmente semelhantes aos mamíferos néfron em vários aspectos chave1. MTs são arranjados como 2 pares de túbulos (anteriores e posteriores) no tórax e abdômen de uma mosca. O tubo de única célula epitelial de cada MT é composto por metabolica....
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Protocolo
Todas as etapas neste protocolo estar em conformidade com as diretrizes de uso de animais da clínica Mayo (Rochester, MN).
1. criação de voar
- Aumento voa e conjunto cruza de acordo com o padrão de criação29.
Nota: A expressão fluorescente repórter pelo sistema GAL4/UAS é proporcional à temperatura e, portanto, a criação da temperatura pode ser ajustada para alterar o nível de expressão. Enquanto os níveis de alta expressão muitas vezes levam a uma melhor relação sinal-ruído esta condição também é associada com aumento citosólico e organellar agregados quando usando as boas práticas agrícolas para fusão d....
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Resultados
Tecidos saudáveis e identificação adequada de MTs anteriores são vitais para o sucesso do presente protocolo. Durante a dissecção, deve ter cuidado para não diretamente toque os MTs e identificador único-los pelo ureter como segurando os MTs diretamente conduzirá à quebra (Figura 4A– B). Quando MTs são varridos plana para o slide, túbulos devem ser tocados o mínimo possível e movimento em excesso evitado como isto irá danifi.......
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Discussão
O sucesso da quantificação de pH em Drosophila MTs depende inteiramente da saúde de MTs extraídos e a qualidade da montagem e dissecação (Figura A – C). Assim, o tratamento cuidadoso do tecido como descrito é imperativo. Slides recém revestidos em PLL substancialmente ajuda MT montagem como eles tendem a ser muito mais adesivo do que os slides que anteriormente foram expostos a solução. Cuidado montagem também ajudarão na identificação de segmentos .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH DK092408 e DK100227 de Mfr. AJR foi apoiado por T32-DK007013. Os autores desejam agradecer Dr. Julian A.T. Dow de CapaR-GAL4 e c724-GAL4 estoques de Drosophila . Agradecemos também o Jacob B. Anderson para obter assistência manutenção cruzamentos experimentais de voar.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de Poli-L-Lisina (PLL) | Sigma-Aldrich | P4832 | Loja em 4 ° C, pode ser reutilizado. |
| Nigericina Sal de Sódio | Sigma-Aldrich | N7143 | CUIDADO: Manuseie com luvas. Conservar em alíquotas da solução-mãe a 20 mM em DMSO a 4 °C. |
| Tampas adesivas da câmara de perfusão, tamanho do adesivo 1 mm, diâmetro da câmara e espessura 9 mm e vezes; 0,9 mm, diâmetro das portas 1,5 mm | Sigma-Aldrich | GBL622105 | Pode ser substituído conforme necessário para combinar com o sistema de perfusão. |
| Kit de Elastômero de Silicone Sylgard 184 | Adesivos Ellsworth | 184 KIT SIL ELAST 0.5KG | Disponível em vários fornecedores. |
| Suportes de Solda Helping Hands | Harbor Freight Tools | 60501 | Disponível de vários fornecedores. |
| Sistema de Perfusão Alimentado por Gravidade Aberto com Controlador de Válvula, Coletor 8 para 1 e Ferramentas | de Biociência | Reserviors PS-8S | Qualquer sistema de perfusão comparável pode ser usado. |
| Regulador de Fluxo | Warner Instruments | 64-0221 | Pode ser substituído conforme necessário para combinar com o sistema de perfusão. |
| de 21720024 | Científica Fisher Média | Schneider | em 4 & C em alíquotas estéreis. |
| #5 Pinça de Aço Inox | Ferramentas de Ciência Fina | 11252-20 | Pode ser substituído com base no conforto do experimentador. |
| Placa de Petri de poliestireno 35 x 10 mm | Corning Life Sciences | Fisher Scientific 08-757-100A | A marca e o tamanho exatos não são importantes. |
| 75 x 25 milímetros Corning | Life Sciences | 2949-75X25 | Marcas e tamanhos exatos podem variar desde que os poços de perfusão sejam compatíveis. |
| Vidro capilar de borosilicato filimentado, ID 1,5 mm, OD 0,86 mm, espessura 0,32 mm | Warner Instruments | 64-0796 | Não é necessário, o vidro pode ser substituído para combinar com tubos de perfusão e poços de perfusão. |
| Tubulação Tygon, ID 1/16", OD 1/8", espessura 1/32" | Fisher Scientific | 14-171-129 | Disponível em vários fornecedores, pode ser substituído para combinar com o sistema de perfusão. |
| Graxa de silicone a vácuo | Sigma-Aldrich | Z273554 | Disponível em vários fornecedores. |
| Grampo de controle de fluxo de plástico | Fisher Scientific | 05-869 | Disponível em vários fornecedores, esterilidade não necessária |
| Hastes de vidro, 5 mm de diâmetro | delphiglass.com | 9198 | O tamanho exato é a preferência pessoal, vários fornecedores disponíveis |
| Caneta hidrofóbica PAP | Sigma-Aldrich | Z377821 | Disponível em vários fornecedores. |
| Filme de vedação | Sigma-Aldrich | P7668 | Disponível em vários fornecedores. |
| Tubo Falcon de 15 mL | BD Falcon | 352096 | Disponível em vários fornecedores. |
| Tubo Falcon de 50 mL | BD Falcon | 352070 | Disponível em vários fornecedores. |
| HEPES; Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico | Sigma-Aldrich | H3375 | Disponível em vários fornecedores. |
| MES; Ácido 4-morfolineetanossulfônico monohidratado | Sigma-Aldrich | 69892 | Disponível em vários fornecedores. |
| Torneiras; Ácido N-[Tris(hidroximetil)metil]-3-aminopropanossulfônico | Sigma-Aldrich | T5130 | Disponível em vários fornecedores. |
| Objetiva de ar 10X/0,45 | Zeiss | 000000-1063-139 | Objetivas comparáveis podem ser substituídas. As objetivas de 40X podem ser usadas para imagens de célula única. |
| Estereoscópio de dissecação | Zeiss | Discovery.V8 | Qualquer estereoscópio de dissecação pode ser usado. |
| UAS-pHerry transgênico Drosophila melagnogaster | Disponível no Romero Lab | Publicado pela primeira vez: Citation 10 | |
| capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster | Disponível no Romero Lab | Publicado pela primeira vez: Citation 32 | |
| c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster | Disponível no Romero Lab | Publicado pela primeira vez: Citation 2 | |
| Câmera Digital Monocromática de Alta Sensibilidade | Zeiss | Axiocam 506 mono | A marca e o modelo exatos podem variar, podem ser substituídos por qualquer câmera monocromática de alta sensibilidade adequada para imagens celulares ao vivo. |
| Conjunto de filtros GFP/FITC, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dicróico | Chroma | CZ909 | Qualquer conjunto de filtros GFP/FITC pode ser substituído. |
| Conjunto de filtros RFP/TRITC, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dicróico | Chroma | CZ915 | Qualquer conjunto de filtros GFP/FITC pode ser substituído. |
| Microscópio Epifluoescente Invertido | Zeiss | Axio Observer Z.1 | Qualquer microscópio comparável com comutação de filtro motorizado pode ser usado. Os microscópios verticais podem ser usados com banhos de perfusão abertos e objetivas de imersão em água. |
| Software de Análise Estatística | Microcal | Origin 6.0 | Qualquer software com funcionalidade comparável pode ser substituído por |
| Software de Análise de Imagem | National Institutes of Health | ImageJ 1.50i | Qualquer software com funcionalidade comparável pode ser substituído Software |
| Aquisição de Imagem | Zeiss | Zen 1.1.2.0 | Qualquer software com funcionalidade comparável pode ser substituído |
| Microscopia Eletrônica | 71960 | Disponível em vários fornecedores. | |
| Pasta de Lâminas de Microscopia | Fisher Scientific | 16-04 | Disponível em vários fornecedores. |
| Bico de Bunsen | Fisher Scientific | 50-110-1231 | Disponível de vários fornecedores. |
| Frascos de criação de Drosophila de poliestireno com Flugs | Genesee Scientific | 32-109BF | Itens comparáveis podem ser substituídos. |
| Balde de Gelo de Laboratório de 2,5 L | Fisher Scientific | 07-210-129 | Disponível em vários fornecedores. |
| NMDG; N-Metil-D-glucamina | Sigma-Aldrich | M2004 | Disponível em vários fornecedores. |
| Ponteiras de pipeta de barreira de 200 uL | MidSci | AV200 | Disponível em vários fornecedores. |
| 200 μ L pipeta de volume variável | Gilson Incorporated | PIPETMAN P200 | Disponível em vários fornecedores. |
Referências
- Dow, J. A. T., Romero, M. F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (6), F1237-F1244 (2010).
- Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A.
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Reimpressões e permissões
