Este protocolo descreve um método para isolar e cultivar rudimentos metanefricos de embriões de ratinho.
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Artigo de método
Dissecção e cultura do rim embrionário do rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
O objetivo deste protocolo é descrever um método para a dissecção, isolamento e cultura de rastreios metanefric do rato.
Durante o desenvolvimento do rim mamífero, os dois tecidos progenitorais, o broto ureterico e o mesênquima metanéfrico, comunicam-se e induzem reciprocamente mecanismos celulares para formar eventualmente o sistema colector e os nefrões do rim. À medida que os embriões de mamíferos crescem intra-uterinos e, portanto, são inacessíveis ao observador, desenvolveu-se uma cultura de órgãos. Com este método, é possível estudar interações epitélio-mesenquimais e comportamento celular durante a organogênese do rim. Além disso, a origem das malformações congênitas do rim e do trato urogenital pode ser investigada. Após dissecção cuidadosa, os rudimentos metanéfricos são transferidos para um filtro que flutua no meio de cultura e podem ser mantidos numa incubadora de cultura de células durante vários dias. Contudo, deve ter-se em conta que as condiçõesArtificial e poderia influenciar o metabolismo no tecido. Além disso, a penetração das substâncias de teste poderia ser limitada devido à matriz extracelular e à membrana basal presentes no explante.
Uma vantagem principal da cultura do órgão é que o experimentador pode ganhar o acesso direto ao órgão. Esta tecnologia é barata, simples e permite um grande número de modificações, como a adição de substâncias biologicamente ativas, o estudo de variantes genéticas e a aplicação de técnicas de imagem avançadas.
Introdução
O rim de mamíferos é derivado de duas estruturas primordiais de origem mesodérmica: o broto ureteral epitelial tubular e o mesênquima metanéfrico. Durante a nefrogênese, o broto ureteral invade o mesênquima metanéfrico e se ramifica para formar o sistema coletor. O mesênquima metanéfrico dá origem aos elementos epiteliais dos néfrons. Esses processos ocorrem de maneira precisamente cronometrada e espacialmente coordenada e são iniciados por mecanismos indutivos recíprocos. Ambos os componentes do tecido se comunicam e afetam a morfogênese celular do outro.
Na década de 1920, foi Boyden quem realizou a obstrução in vivo do ducto me....
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Protocolo
Os ratinhos foram mantidos de acordo com a regulamentação sueca ea legislação da União Europeia (2010/63 / UE). Todos os procedimentos foram realizados seguindo as diretrizes do Comitê de Ética Sueco (autorizações C79 / 9, C248 / 11 e C135 / 14). Procedimentos na Universidade de Heidelberg envolvendo animais sujeitos foram aprovados pelo Regierungspräsidium Karlsruhe e os agentes de bem-estar animal na Universidade de Heidelberg.
1. Preparação de Reagentes e Materiais para a Cultura
NOTA: Use uma capa de fluxo laminar para minimizar a contaminação.
- No dia da dissecção, Fc humano pré-agrupamento ou p....
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Resultados
O anlagenio metan�rico de rim foi derivado de murganhos consangu�eos Black-6 gr�idos a E11,5 e foram cultivados. Após 3 dias, o botão ureteriano ramificou-se até 5 vezes, resultando em uma ramificação do botão ureter inicialmente em forma de T. Cada explante foi fotografado e os números de segmentos e pontos finais foram quantificados para determinar as gerações de ramificação e calcular o número de pontos finais por ramo ( Figura 1 ). ( Figura 1b .......
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Discussão
Este manuscrito descreve um método para isolar o desenvolvimento de metanéfric anlagen do embrião de rato e para cultivar os rudimentos de órgãos. Este método é uma técnica padrão, como desenvolvido por Grobstein 8 e Saxen 9 , 10 , e foi adaptado e modificado por muitos outros 11 , 12 . O sucesso do método depende principalmente da duração da dissecção, como sobrevivência do expla.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Leif Oxburgh e Derek Adams por compartilhar generosamente seus conhecimentos, Leif Oxburgh pelos comentários úteis sobre o manuscrito, e Stefan Wölfl e Ulrike Müller pelo seu apoio técnico e Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer e Viola Mayer pela ajuda na Laboratório Este trabalho foi apoiado por Desenvolvimento, A Empresa de Biólogos (a CP).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM / F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U / mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX Suplemento | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, cálcio, magnésio | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | uso para dissecação |
| holo-Transferrina humana | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulina-Transferrina-Selênio (ITS-G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | 158127 Solução de | |
| Anfotericina B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Azida de sódio | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Timerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Galato de propila | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinilated Dolichorus Biflorus Aglutinina | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 Estreptavidin Jackson Immuno | Research | 016-540-084 | |
| Recombinante Camundongo Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF | R & D Systems | 496-EB | |
| IgG1 Humano Recombinante Fc, CF | R& D Systems | 110-HG-100 | |
| Anticorpo Anti-IgG Fc Humano | de Cabra R& D Systems | G-102-C | |
| Comprimidos salinos tamponados com fosfato | Sigma-Aldrich | P4417 | uso para fixação e imunocoloração |
| Dumont #5, pontas biologie , INOX, 11 cm | agnthos.se | 0208-5-PS | São necessários 2 pares de pinças |
| Tesoura de íris, reta, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Pinça de curativo, reta, delicada, 13 cm | agnthos.se | 08-032-130 | |
| Placas de Petri tratadas com Nunclo Delta | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopore Membrane Filter, policarbonato, Hidrofílico, 5.0 µ m, 13 mm, branco, liso | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 poços, fundo plano | Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Vidro de cobertura do microscópio com 24 x 50 mm de espessura. No.1.5H 0,17+/-0,005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Óculos de cobertura No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. planície moída | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Lâminas de barbear | VWR VWR | 55411-055 | |
| Tubos de centrífuga de 50 mL Tubos de centrífuga | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman, grau 113V, crepado | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Mircoscópio de pesquisa em estágio fixo | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 camundongos endogâmicos, machos, C57BL / 6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 camundongos endogâmicos, fêmeas, C57BL / 6NTac | Taconic | B6-F | |
| Microscópio estéreo Greenough | Leica Leica | S6 E |
Referências
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000(2015).
- Peuckert, C., ....
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Reimpressões e permissões
