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Artigo de método

Dissecção e cultura do rim embrionário do rato

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DOI:

10.3791/55715

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17 de maio de 2017

 , 
1Department of Neuroscience, Uppsala University, 2Department of Organismal Biology, Evolutionary Biology Center, Uppsala University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método para isolar e cultivar rudimentos metanefricos de embriões de ratinho.

Resumo

O objetivo deste protocolo é descrever um método para a dissecção, isolamento e cultura de rastreios metanefric do rato.

Durante o desenvolvimento do rim mamífero, os dois tecidos progenitorais, o broto ureterico e o mesênquima metanéfrico, comunicam-se e induzem reciprocamente mecanismos celulares para formar eventualmente o sistema colector e os nefrões do rim. À medida que os embriões de mamíferos crescem intra-uterinos e, portanto, são inacessíveis ao observador, desenvolveu-se uma cultura de órgãos. Com este método, é possível estudar interações epitélio-mesenquimais e comportamento celular durante a organogênese do rim. Além disso, a origem das malformações congênitas do rim e do trato urogenital pode ser investigada. Após dissecção cuidadosa, os rudimentos metanéfricos são transferidos para um filtro que flutua no meio de cultura e podem ser mantidos numa incubadora de cultura de células durante vários dias. Contudo, deve ter-se em conta que as condiçõesArtificial e poderia influenciar o metabolismo no tecido. Além disso, a penetração das substâncias de teste poderia ser limitada devido à matriz extracelular e à membrana basal presentes no explante.

Uma vantagem principal da cultura do órgão é que o experimentador pode ganhar o acesso direto ao órgão. Esta tecnologia é barata, simples e permite um grande número de modificações, como a adição de substâncias biologicamente ativas, o estudo de variantes genéticas e a aplicação de técnicas de imagem avançadas.

Introdução

O rim de mamíferos é derivado de duas estruturas primordiais de origem mesodérmica: o broto ureteral epitelial tubular e o mesênquima metanéfrico. Durante a nefrogênese, o broto ureteral invade o mesênquima metanéfrico e se ramifica para formar o sistema coletor. O mesênquima metanéfrico dá origem aos elementos epiteliais dos néfrons. Esses processos ocorrem de maneira precisamente cronometrada e espacialmente coordenada e são iniciados por mecanismos indutivos recíprocos. Ambos os componentes do tecido se comunicam e afetam a morfogênese celular do outro.

Na década de 1920, foi Boyden quem realizou a obstrução in vivo do ducto mesonéfrico em galinhas, fornecendo a primeira indicação de interações indutivas, pois o blastema néfrico separado não consegue diferenciar1. Mais ou menos na mesma época, foram publicadas as primeiras tentativas bem-sucedidas de cultivar rudimentos neférricos de frango em uma gota pendurada. Posteriormente, a cultura de órgãos foi desenvolvida para estudar as interações teciduais na organogênese de mamíferos. Na década de 1950, Grobstein desenvolveu uma técnica na qual rudimentos metanéfricos podiam ser cultivados em um filtro. Essa técnica foi modificada por Saxén, que colocou o filtro em uma tela do tipo Trowell em uma cultura dish1. Ao longo dos anos, muitas modificações e aplicações para a cultura de órgãos surgiram. O método aqui descrito baseia-se na técnica de Saxén, mas é simplificado, uma vez que os filtros flutuam livremente no meio e o diâmetro do poço de cultura excede apenas ligeiramente o diâmetro do filtro, limitando o movimento indesejado do filtro.

A cultura de órgãos inteiros é uma ferramenta clássica, barata e simples, mas poderosa, para investigar processos celulares e comunicação intercelular durante a organogênese. A cultura de órgãos permite o tratamento com agentes biológicos, como fatores de crescimento, anticorpos, oligonucleotídeos antisense, vírus e peptídeos, bem como com compostos farmacêuticos e outros produtos químicos. Além disso, a função gênica pode ser estudada usando explantes derivados de camundongos geneticamente modificados ou usando tecnologia de inativação gênica induzível, como o sistema Cre-loxP. Isso permite o estudo de mutações genéticas que causam letalidade embrionária antes do desenvolvimento do rim. A cultura de órgãos também pode ser combinada com marcação fluorescente para função gênica ou rastreamento de linhagem e técnicas modernas de imagem, que permitem o monitoramento em tempo real do comportamento celular2.

No exemplo específico fornecido aqui, foi investigado o efeito da sinalização do receptor de Eph ativado por EphrinB2 na morfologia ramificada do broto ureteral. A morfologia dos camundongos duplos knockout EphA4/EphB2 sugeriu vários defeitos graves no desenvolvimento renal, que foram detectáveis já no dia embrionário 11 (E11) e envolveram o broto ureteral, o ureter e o ducto neférrico comum3. A sinalização via receptores Eph requer o agrupamento do dímero ligante-receptor < classe sup = 'xref'>4. Para ativar a sinalização de Eph, os rudimentos renais de embriões de camundongos E11.5 foram cultivados na presença de EphrinB2-Fc recombinante agrupado. EphrinB2 é um ligante conhecido para o receptor EphA4, que é expresso nas pontas dos brotos ureterais3.

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Protocolo

Os ratinhos foram mantidos de acordo com a regulamentação sueca ea legislação da União Europeia (2010/63 / UE). Todos os procedimentos foram realizados seguindo as diretrizes do Comitê de Ética Sueco (autorizações C79 / 9, C248 / 11 e C135 / 14). Procedimentos na Universidade de Heidelberg envolvendo animais sujeitos foram aprovados pelo Regierungspräsidium Karlsruhe e os agentes de bem-estar animal na Universidade de Heidelberg.

1. Preparação de Reagentes e Materiais para a Cultura

NOTA: Use uma capa de fluxo laminar para minimizar a contaminação.

  1. No dia da dissecção, Fc humano pré-agrupamento ou proteína de efrina quimérica recombinante fundida a Fc humano por mistura com anticorpos de cabra Fc anti-humanos numa razão molar de 1: 5 em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Incubar durante 1 h a 37 ° C 5 .
  2. Preparar o meio de cultura suplementando Dulbecco Modified Eagle Medium: NutrientMistura F-12 (DMEM / F12) com penicilina / estreptomicina a 1% (v / v), glutamina a 1% (v / v), insulina transferrina selénio (v / v) a 50 μg / Transferrina e 1,5 μg / mL de anfotericina.
    NOTA: 10 mL de meio é suficiente para 16 embriões.
  3. Adicionar solução de efrínina recombinante agrupada a uma concentração final de 20 μg / mL ao meio de cultura. Use o Fc humano agrupado como controle.
  4. Preparar placas de cultura por adição de 500 μL de meio de cultura a cada poço de uma placa de 4 poços de poliestireno estéril, não revestido, de fundo plano.
  5. Usando pinças esterilizadas, coloque cuidadosamente um filtro de membrana de policarbonato com um tamanho de poro de 5 μm por poço em cima do meio. Transferir a placa preparada para a incubadora (37 ° C / 5% CO 2 ). Certifique-se de que o filtro permanece seco na superfície superior e flutua.
    NOTA: Um filtro é suficiente para dois anlagen de rim.
  6. Usando uma lâmina de barbear, corte aproximadamente 30 pontas de pipeta (volume: 100 μL) approximatelY 1 mm da ponta para resultar numa abertura mais larga. Coloque as pontas de volta em um rack de ponta de pipeta.

2. Dissecção de Rudimentos Metanefricos em E11.5

  1. Sacrifique um rato com gestação cronometrada em E11.5 por deslocamento cervical (ou usando um método aprovado pelo comitê de ética local).
  2. Remova o útero e os embriões, como descrito por Brown et al 6 . Deste ponto em diante, trabalhar sob um microscópio de dissecção.
  3. Usando pinças de relojoeiro No. 5, corte o embrião diretamente sob as patas dianteiras. Use um prato de Petri fresco para cada embrião. Remova as pernas ea cauda do embrião. Para fazer isso, pegue o tecido a ser removido com um par de fórceps de relojoeiro No. 5 e use as pontas de um segundo par para cortar.
  4. Para remover a massa do órgão ventral, use as pontas de um par de fórceps para abrir lateralmente a parede do corpo do embrião em uma direção rostral para caudal.
    1. Corte superficialmente, paralelo a tAorta dorsal. Use a aorta dorsal cheia de sangue e portanto visível para orientação. Cuidadosamente separar a parte ventral da parede do corpo da parte dorsal usando as pontas da pinça fechada e virar o embrião sobre. Corte a parede do corpo lateralmente em uma direção rostral-para-caudal e usando a aorta dorsal para a orientação, como para o lado anterior.
  5. Uma vez que a parede do corpo ventral foi separada do corpo dorsal, agarrá-lo com um par de fórceps e puxe cuidadosamente para removê-lo, juntamente com a massa do órgão.
    NOTA: O anlagen metanefric permanece geralmente unido à parede do corpo dorsal. São estruturas ovais, ~ 200 μm de comprimento, localizadas ao nível dos membros posteriores.
  6. Segure a parede do corpo dorsal com um par de fórceps, com o lado ventral voltado para cima. Usando o outro par de fórceps, pegue a aorta dorsal em sua extremidade rostral e cuidadosamente descascar a aorta dorsal da parede do corpo dorsal.
    NOTA: Ambos os rins metanefric geralmente permanecem anexarÀ aorta dorsal.
  7. Usando um par de fórceps, corte rostralmente para o rim anlagen para remover a aorta. Em seguida, cuidadosamente separar o anlagen dois rins usando as pontas do fórceps.
  8. Cuidadosamente descascar tecido não desejado do rim anlagen usando as pontas do fórceps. Tome cuidado para não danificar o mesênquima, uma vez que os danos podem resultar em crescimento fraco e exclusão do explante de uma análise posterior.
  9. Transferir o anlagen renal separadamente usando uma pipeta de microlitro e uma ponta de pipeta aberta em 10 μL de PBS para o filtro de membrana de policarbonato em uma placa de 4 poços.
    NOTA: Devido à tensão superficial, o explante será coberto com uma fina camada de meio. Um filtro é suficiente para dois rim anlagen.
    1. Coloque cada um dos dois anlagen renal no centro de cada respectiva metade do filtro. Transferir a placa de volta para a incubadora a 37 ° C / 5% de CO2. Deixar a placa na incubadora até que o metanephric rudImensos do próximo embrião estão prontos para serem colocados no filtro.
  10. Repita os passos 2.3-2.9.1 para cada embrião.
    NOTA: Com alguma prática, o procedimento de dissecção levará cerca de 5 min por embrião.
  11. Incubar o anlagenio renal durante 3 dias a 37 ° C / 5% CO 2 .

3. Preparação de Reagentes para Fixação e Coloração

  1. Para preparar paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS sem cálcio e magnésio (p / v), dissolver a PFA a 60 ° C em PBS, agitando continuamente. Arrefecer até à temperatura ambiente e utilizar um filtro de papel para remover as restantes partículas. Alíquota e manter a 4 ° C para uso imediato ou congelar para armazenamento de longo prazo.
    CUIDADO: PFA é tóxico. Usar o equipamento de proteção individual especificado nas normas de segurança locais e trabalhar em um exaustor. Descarte resíduos de acordo com as diretrizes institucionais e usando recipientes de resíduos designados.
  2. Para preparar a solução de permeabilização, diluir Triton X-100Em PBS sem cálcio e magnésio até 0,3% (v / v).
  3. Para preparar a solução de bloqueio, adicionar 5% (v / v) de soro de cabra e 0,1% de Triton X-100 a PBS sem cálcio e magnésio. Adicionar azida de sódio a uma concentração final de 0,02% (p / v). Armazenar a 4 ° C.
    CUIDADO: A azida sódica é tóxica. Manipular azida de sódio de acordo com os regulamentos locais de segurança e protecção ambiental.
    NOTA: Quando se utilizam anticorpos para coloração, utilizar soro a 5% da espécie a partir da qual se derivou o anticorpo secundário para se obter uma solução de bloqueio.
  4. Diluir a aglutinina de Dolichorus biflorus biotinilada 1: 200 em solução de bloqueio. Diluir estreptavidina conjugada com Alexa488 1: 200 em solução de bloqueio.
  5. Para fazer um meio de incorporação pronto a usar (ver a tabela de materiais), adicione 0,1 g de mucoadesivo / ml a base de álcool polivinílico solúvel em água a 25% (p / v) de glicerol em Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5) . Aquecer a 50 ° C sob agitação contínua durante 1 h, arrefecer e ajustar o pH para 8,0-8,5 usando 1M NaOH. Evitar concentrações mais elevadas de NaOH. Adicionar 100 μg / mL de N-propilgalato e timerosal até uma concentração final de 0,02% (p / v). Agitar durante 30 min à temperatura ambiente.
    CUIDADO: O timerosal é tóxico. Manuseie-o de acordo com os regulamentos locais de segurança e protecção ambiental.
    1. Encher o meio de incorporação em tubos de 50 mL, equilibrar o rotor e centrifugar a 3.200 xg e à temperatura ambiente durante 10 min. Decantar a solução límpida em tubos de 15 mL e descartar a pastilha. Alicuotar e armazenar a -20 ° C durante várias semanas. Uma vez descongelado, mantenha a solução a 4 ° C. Aquecer a ~ 30 ° C imediatamente antes da utilização.
  6. Preparar como muitos slides de vidro como filtros com explantes devem ser montados. Para isso, cola dois pequenos lamínulas, 18 x 18 mm, em ambos os lados da lâmina de vidro usando adesivo instantâneo, deixe um espaço de ~ 15 mm para o filtro entre.

4. Fixação e coloração

  1. Após um período de cultura de 3Dias in vitro (div), remover as placas da incubadora e aspirar cuidadosamente o meio de cultura de cada poço utilizando uma micropipeta. Certifique-se de não tocar no filtro e manter a abertura da ponta para a parede do poço.
  2. Adicionar 500 μL de PFA a 4% / PBS a cada poço. Os filtros flutuam no fixador. Usando uma micropipeta, adicione cuidadosamente o fixador PFA gota a gota para submergir os filtros. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
    NOTA: Para todas as etapas seguintes, deve-se ter cuidado para não lavar os explantes do filtro. Mantenha a abertura da ponta da pipeta em direção à parede do poço.
  3. Remover o PFA e enxaguar duas vezes com 500 μL de PBS, submergindo o filtro. Adicionar 500 μL de solução de permeabilização a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
  4. Enxaguar duas vezes com 500 μL de PBS e adicionar 500 μL de solução de bloqueio a cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
  5. Substitua a solução de bloqueio por250 μL de aglutinina biotinilada de Dolichorus biflorus diluída a 1: 200 em solução de bloqueio e incubar a 4 ° C durante 24 h.
  6. Remover a solução de aglutinina de Dolichorus biflorus e enxaguar duas vezes com 500 μL de PBS por poço.
  7. Adicionar 250 μL de estreptavidina conjugada com Alexa488 diluída a 1: 200 em solução de bloqueio e incubar a 4 ° C durante 24 h. Alternativamente, incubar à temperatura ambiente durante 2 h.
    NOTA: Uma melhor relação sinal-ruído é alcançada quando incubada a 4 ° C.
  8. Enxágüe duas vezes com 500 μL de PBS por poço. Usando pinças, transfira os filtros para as lâminas de vidro preparadas, com os explantes voltados para cima. Monte com ~ 50-100 μL de meio de incorporação. Cubra com os lamínulas No. 1.5 de 60 mm de comprimento. Permitir que a solução de meio de incorporação solidifique durante 2 h à temperatura ambiente no escuro. Proceda à imagem ou guarde os slides, envoltos em papel alumínio, a 4 ° C até à imagem.
  9. Imagem com um microscópio de epifluorescência de campo largo 7 </ Sup> acoplado a uma lâmpada de Hg e utilizar uma unidade de espelho para excitação azul (onda de excitação, 460-495 nm, espelho dicromático, 505 nm, e passagem de emissão, 510-550 nm) e lentes 20X Plan-Apochromat, 0,75 numérico abertura.

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Resultados

O anlagenio metan�rico de rim foi derivado de murganhos consangu�eos Black-6 gr�idos a E11,5 e foram cultivados. Após 3 dias, o botão ureteriano ramificou-se até 5 vezes, resultando em uma ramificação do botão ureter inicialmente em forma de T. Cada explante foi fotografado e os números de segmentos e pontos finais foram quantificados para determinar as gerações de ramificação e calcular o número de pontos finais por ramo ( Figura 1 ). ( Figura 1b ...

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Discussão

Este manuscrito descreve um método para isolar o desenvolvimento de metanéfric anlagen do embrião de rato e para cultivar os rudimentos de órgãos. Este método é uma técnica padrão, como desenvolvido por Grobstein 8 e Saxen 9 , 10 , e foi adaptado e modificado por muitos outros 11 , 12 . O sucesso do método depende principalmente da duração da dissecção, como sobrevivência do expla...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Leif Oxburgh e Derek Adams por compartilhar generosamente seus conhecimentos, Leif Oxburgh pelos comentários úteis sobre o manuscrito, e Stefan Wölfl e Ulrike Müller pelo seu apoio técnico e Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer e Viola Mayer pela ajuda na Laboratório Este trabalho foi apoiado por Desenvolvimento, A Empresa de Biólogos (a CP).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEM / F-12Thermo Fisher Scientific21331020
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U / mL)Thermo Fisher Scientific15140148
GlutaMAX SuplementoThermo Fisher Scientific35050061
DPBS, cálcio, magnésioThermo Fisher Scientific14040117uso para dissecação
holo-Transferrina humanaSigma-AldrichT0665
Insulina-Transferrina-Selênio (ITS-G) (100x)Thermo Fisher Scientific41400045
ParaformaldeídoSigma-Aldrich158127 Solução de
Anfotericina BSigma-AldrichA2942
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Azida de sódioSigma-AldrichS8032
TimerosalSigma-AldrichT5125
Galato de propilaSigma-Aldrich2370
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381
GlicerolSigma-AldrichG5516
Biotinilated Dolichorus Biflorus AglutininaVector LaboratoriesB-1035
Alexa488 Estreptavidin Jackson ImmunoResearch016-540-084
Recombinante Camundongo Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CFR & D Systems496-EB
IgG1 Humano Recombinante Fc, CFR& D Systems110-HG-100
Anticorpo Anti-IgG Fc Humanode Cabra R& D SystemsG-102-C
Comprimidos salinos tamponados com fosfatoSigma-AldrichP4417uso para fixação e imunocoloração
Dumont #5, pontas biologie
, INOX, 11 cm		agnthos.se0208-5-PSSão necessários 2 pares de pinças
Tesoura de íris, reta, 12 cmagnthos.se03-320-120
Pinça de curativo,
reta, delicada, 13 cm		agnthos.se08-032-130
Placas de Petri tratadas com Nunclo DeltaThermo Fisher Scientific150679
TMTP01300 Isopore Membrane Filter, policarbonato, Hidrofílico, 5.0 µ m, 13 mm, branco, lisoMerckMilliporeTMTP01300
Nunclon Multidishes
4 poços, fundo plano		Sigma-AldrichD6789-1CS
Vidro de cobertura do microscópio com 24 x 50 mm de espessura. No.1.5H 0,17+/-0,005 mmnordicbiolabs107222
Óculos de cobertura No.1.5, 18 mm x 18 mmnordicbiolabs102032
Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. planície moídanordicbiolabs1030418
VWR Lâminas de barbearVWR VWR55411-055
Tubos de centrífuga de 50 mL Tubos de centrífugaSigma-AldrichCLS430828
15 mLSigma-AldrichCLS430055
Whatman, grau 113V, crepadoSigma-AldrichWHA1213125
Mircoscópio de pesquisa em estágio fixoOlympusBX61WI
Black 6 camundongos endogâmicos, machos, C57BL / 6NTacTaconicB6-M
Black 6 camundongos endogâmicos, fêmeas, C57BL / 6NTacTaconicB6-F
Microscópio estéreo GreenoughLeica LeicaS6 E
Papel de filtro qualitativo preplissado

Referências

  1. Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
  2. Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000(2015).
  3. Peuckert, C., et al. Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development. Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).
  4. Pasquale, E. B. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).
  5. Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
  6. Brown, A. C., et al. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J Vis Exp. (50), e2555(2011).
  7. Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
  8. Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
  9. Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
  10. Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
  11. Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
  12. Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
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  14. Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
  15. Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550(2010).
  16. Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
  17. Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
  18. Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
  19. Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
  20. Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
  21. Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).

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Reimpressões e permissões

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