Condrócitos diferenciadores de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos derivadas de sangue periférico

Resumo

Apresentamos um protocolo para gerar uma linhagem condrogênica de sangue periférico humano (PB) através de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando um método livre de integração, que inclui a formação de corpo embrionóide (EB), expansão de células fibroblásticas e indução condrogênica.

Resumo

Neste estudo, utilizamos células de sangue periférico (PBCs) como células de sementes para produzir condrócitos através de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) em um método livre de integração. Após a formação do corpo embrionóide (EB) e a expansão das células fibroblásticas, os iPSCs são induzidos para a diferenciação condrogênica durante 21 dias sob condições isentas de soro e sem xeno. Após a indução de condrócitos, os fenótipos das células são avaliados por análises morfológicas, imuno-histoquímicas e bioquímicas, bem como pelo exame quantitativo em PCR em tempo real de marcadores de diferenciação condrogênica. Os grânulos condrogénicos mostram coloração azul alcian e azul de toluidina positiva. A imuno-histoquímica da coloração com colágeno II e X também é positiva. O teor de glicosaminoglicano sulfatado (sGAG) e os marcadores de diferenciação condrogénica COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 e AGGRECAN são significativamente regulados positivamenteGrânulos rogênicos em comparação com HiPSCs e células fibroblásticas. Esses resultados sugerem que os PBCs podem ser usados ​​como células de sementes para gerar iPSCs para o reparo da cartilagem, que é específico do paciente e econômico.

Introdução

O tecido da cartilagem tem uma capacidade muito fraca de auto-reparação e regeneração. Várias intervenções cirúrgicas e tratamentos biológicos são usados ​​para restaurar a função da cartilagem e articulação, com resultados insatisfatórios. O desenvolvimento recente da tecnologia de células-tronco pode mudar todo o campo de reparo de cartilagem ¹ . Várias células-tronco foram estudadas como células de sementes, mas as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) parecem ser a escolha mais promissora, pois podem fornecer muitos tipos de células específicas do paciente sem causar reações de rejeição ² . Além disso, eles podem superar a natureza proliferativa limitada das células adultas e manter suas habilidades auto-renováveis ​​e pluripotentes. Além disso, a segmentação por genes pode ser usada para mudar o genótipo para obter tipos específicos de condrócitos.

Os fibroblastos têm sido amplamente utilizados para gerar iPSCs porque seus potenciais de reprogramação também foram bem estudados.No entanto, ainda existem algumas limitações que devem ser superadas, como a biópsia dolorosa dos pacientes e a necessidade de expansão in vitro dos fibroblastos, o que pode resultar em mutações genéticas ³ . Recentemente, os PBCs foram considerados vantajosos para a reprogramação ⁴ ; Além disso, eles eram comumente utilizados e armazenados abundantemente. É possível que eles possam redirecionar o foco do estudo da pele. No entanto, para o melhor de nosso conhecimento, há poucos relatórios sobre a reprogramação PBC, seguido de diferenciação em condrócitos.

No presente estudo, utilizamos PBCs como uma fonte alternativa, reprogramando-os para iPSCs e depois diferenciando os iPSCs na linhagem condrogênica através de um sistema de cultura de pelota para imitar a formação de condrócitos.

Protocolo

O protocolo para a geração de hiPSCs de PBCs pode ser encontrado em nosso estudo anterior ⁵ . O estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da nossa instituição.

1. Formação do corpo embrionóide (EB)

1. Faça 50 mL de meio HiPSC: Meio de Eagle Modificado por Dulbecco Knockout (DMEM) suplementado com 15% de substituição sérica knockout (KSR), 5% de soro fetal bovino (FBS), 1 × aminoácidos não essenciais, 55 μM de 2-mercaptoetanol, 2 mM L -glutamina e 8 ng / mL de fator de crescimento básico de fibroblasto (bFGF).
2. Faça 50 mL de meio de formação de EB: DMEM suplementado com 15% de KSR, 5% de FBS, 1x aminoácidos não essenciais, 55 μM de 2-mercaptoetanol e 2 mM de L-glutamina.
3. Faça 50 mL de meio de cultura basal: DMEM suplementado com FBS a 20%, 1 aminoácidos não essenciais essenciais, 2-mercaptoetanol a 55 μM e L-glutamina 2 mM.
4. Prepare 10 mL de solução dispase, 1 mg / mL em DMEM knockout.
5. CultuRe HiPSCs em pratos de cultura de tecidos de 60 mm com células de alimentação ( isto é, uma monocamada de células de fibroblastos embrionárias de ratos irradiados). Quando as células são 80-90% confluentes, desassociar as células com dispase e passar os hiPSCs 1: 3 a cada 4-5 dias. Coloque as células em uma incubadora a 37 ° C e 5% CO ₂ .
6. Disseca as colônias indiferenciadas do hiPSC em pedaços menores (cerca de 50-100 μm de diâmetro) usando uma agulha de vidro desenhada por fogo quando os iPSCs são 80-90% confluentes. Geralmente, use colônias hiPSC em um prato de 60 mm para gerar EBs em uma placa de Petri de 100 mm.
   1. Cultive menos de 100 pequenos pedaços de colônias em uma placa de Petri de 100 mm, não aderente contendo 10 mL de meio de formação de EB. Coloque o prato na incubadora a 37 ° C e 5% CO ₂ .
7. Substitua aproximadamente 25% do meio inicial por uma quantidade igual do meio de cultura basal a cada 2 dias. Incline o prato para permitir que os EBs se assentem. Remova cuidadosamente 3 mLDo meio superior e adicione 4 mL de meio de cultura basal fresco. Não perturbe os EBs.
   NOTA: Os EBs são caracterizados morfologicamente pelos pedaços de colônias, assumindo uma aparência redonda com bordas suaves sob o microscópio.
8. Após 10 dias de cultura na placa de Petri não aderente, revestir uma nova placa de cultura de tecidos de 100 mm com 4 mL de gelatina a 0,1% durante 30 minutos a 37 ° C antes da utilização.
9. Transfira o meio mais EBs de uma placa de Petri 100 mm, não aderente, para um tubo cônico de 15 mL. Deixe os EBs sedimentar durante 4-5 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e deixar menos de 0,5 mL de EBs médio mais
10. Semente menos de 100 EBs em um prato de cultura de tecidos revestidos com gelatina de 100 mm com 10 mL de meio de cultura basal. Coloque o prato na incubadora a 37 ° C e 5% CO ₂ .

2. Formação de pellets de células e diferenciação de condrócitos

1. Faça 10 mL de tripsina a 0,25% / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Faça 80 mL de basMeio de cultura Al: DMEM suplementado com FBS a 20%, 1x aminoácidos não essenciais, 55 mM de 2-mercaptoetanol e 2 mM de L-glutamina.
2. Faça 10 mL de meio de diferenciação condrogênica: DMEM (alta glicose) suplementado com 10% de solução de insulina-transferrina-selênio (ITS), 0,1xM de dexametasona, 1 mM de ácido ascórbico, 1% de piruvato de sódio e 10 ng / mL de transformação do fator de crescimento - Beta 1 (TGF-β1).
3. Atualize o meio com 10 mL de meio de cultura basal após 48 h. Posteriormente, atualize a média a cada três dias com 10 mL de meio basal de cultura.
   NOTA: Após 10 dias em cultura, os crescimentos celulares fibroblásticos deveriam se expandir dos EBs.
   1. Revestir os pratos de 100 mm com 4 mL de gelatina a 0,1% durante 30 min a 37 ° C antes da utilização. Descarte o sobrenadante celular e lave as células com a solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) uma vez.
   2. Digite as células com 3 mL de tripsina a 0,25% / EDTA a 37 ° C durante 5 minutos e neutralize com 4 mL de meio de cultura basal.
4. Dissocie as células em células individuais por pipetagem para cima e para baixo 5-10 vezes e passando-as através de uma malha de nylon de 70 μm. Centrifugue a suspensão celular a 200 xg durante 5 min. Re-semeie as células em um novo prato de cultura de tecido revestido com gelatina de 100 mm com 10 mL de meio de cultura basal.
5. Atualize o meio com 10 mL de meio de cultura basal após 48 h. Posteriormente, atualize a média a cada três dias com 10 mL de meio basal de cultura.
   NOTA: As células adquirem uma morfologia homogênea, semelhante a fibroblastos.
6. Quando ~ 90-100% de confluência é atingida ( ou seja, cerca de 5-7 dias), colher as células com 3 mL de tripsina a 0,25% / EDTA a 37 ° C durante 5 min. Neutralize com 4 mL de meio de cultura basal. Dissocie as células em células individuais por pipetagem para cima e para baixo 5 vezes. Use um hemocitômetro para contar o número da célula.
   1. Coloque 3 x 10 ⁵ células em um tubo de polipropileno de 15 mL. Centrífuga a 200 xgDurante 5 minutos à temperatura ambiente (RT). Re-suspender as células em 1 mL de meio de diferenciação condrogênica.
7. Re-centrifugar as células a 300 xg durante 3 min e manter as células em forma de pelotização pequena. Coloque o tubo na incubadora de 37 ° C e 5% de CO ₂ por 21 dias. Não aperte bem a tampa e deixe a troca de gás.
8. Substitua 3/4 do meio de cultura a cada três dias com novo meio de diferenciação condrogênica.
   NOTA: Após 21 dias em cultura, os grânulos de hiPSC-condrogênicos (hiPSC-Chon) deveriam se formar. As células estaminais mesenquimais humanas (MSCs), como controle positivo, também são coletadas e cultivadas no meio de diferenciação condrogênica por 21 dias para formar pellets condrogênicos (hMSC-Chon).

3. Análise da diferenciação condrogênica

1. Prepare 10 mL de 10% de formalina tampão neutro.
2. Prepare 50 mL de reagente azul alciano a 0,1% e 50 mL de reagente azul de toluidina a 1%.
3. PrEpare 1 mL dos anticorpos primários: anticorpos policlonais de coelho contra anticorpos monoclonais de colagénio II (1:50) ou de murganho contra colágeno X (1:50). Além disso, prepare anticorpos secundários anti-coelho ou rato.
4. Faça 1 mL de solução de papaína: 10 U / mL em PBS com acetato de sódio 0,1 M, EDTA 2,4 mM e L-cisteína 5 mM.
5. Faça 100 mL de solução de corante de azul de dimetilmetileno (DMMB): 100 μL de 16 mg / L de azul de 1,9-dimetilmetileno, glicina 40 mM, NaCl 40 mM e HC1 9,5 mM; PH 3.0.
6. Avalie a diferenciação condrogênica por manchas azuis alcianas e azul de toluidina das seções de pelotização.
   1. Corrija um grânulo HiPSC-Chon ou pellet de hMSC-Chon em 1 mL de 10% de formalina tampão neutro durante 24 h.
   2. Transfira o grânulo para 1 mL de etanol a 70% em H ₂ O. Desidralize o sedimento com 1 mL de uma série de etanol graduada ( isto é, 25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 min cada).
   3. Esclarecer o grânulo em 1 mL de 100% de xileno três vezes. InfiltratE o grânulo com parafina durante 1 h num forno a 65 ° C. Incorporar o grânulo em blocos de parafina com um molde de base de 7 x 7 x 5 mm ³ , seguindo procedimentos histológicos de rotina ⁶ .
   4. Faça seções adjacentes por microtome com uma espessura de aproximadamente 4 μm ⁷ . Aderir às seções em lâminas de vidro.
   5. Secar as lâminas por 2 h a 60 ° C num forno. Desparafine as secções em três ciclos (3 min cada) usando 100% de xileno.
   6. Use uma série de álcool decrescente para reidratação ( ou seja, 100, 100, 95, 95, 70, 50 e 25% em H ₂ O, 3 min cada) e, em seguida, execute um enxágüe final com água desionizada durante 5 min.
   7. Manchar as secções com 0,1% de reagente azul alciano ou 1% de coloração com azul de toluidina durante 4-5 h e depois enxaguá-las com água destilada.
   8. Desidratar com uma série de etanol graduada ( isto é, 25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 min cada) seguido de três períodos consecutivosEps de esclarecimento em 100% de xileno. Monte os slides e visualize-os ao microscópio.
7. Realizar imuno-histoquímica.
   NOTA: Seções adicionais de pelota são ainda avaliadas por imuno-histoquímica.
   1. Após a desparafinação e a reidratação, coloque as lâminas a ferver em EDTA 1 mM, pH 8,0 (impermeável em água cozida por autoclave). Deixe-os sentar durante 8 min a uma temperatura de sub-ebulição e, em seguida, deixe as lâminas arrefecer à temperatura ambiente.
   2. Enxaguar as lâminas com água desionizada 3 vezes. Incubar as secções em solução a 3% de H ₂ O ₂ em metanol à TA durante 15 min para bloquear a actividade de peroxidase endógena.
   3. Enxaguar as lâminas com água desionizada e mergulhá-las em DPBS durante 5 min. Aplique 50-100 μL de anticorpo primário adequadamente diluído (1:50) às secções das lâminas e depois incubri-las em uma câmara humidificada à TA durante 1 h.
   4. Lave os slides 3 vezes (5 min cada) com DPBS. Incube a saMills com os anticorpos secundários correspondentes ( isto é, anti-coelho ou rato) durante 15 minutos à TA.
   5. Lave os slides 3 vezes (durante 5 minutos cada) com DPBS. Execute a detecção DAB ao microscópio.
   6. Lave os slides com DPBS 3 vezes (2 min cada). Contrapona os núcleos celulares imergindo as lâminas em hematoxilina por 1-2 minutos. Desidratar com uma série de etanol graduada (25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 minutos cada) seguido de três etapas consecutivas de clarificação com xileno. Finalmente, monte as lâminas e visualize-as no microscópio.
8. Detectar o conteúdo do sGAG.
   1. Digeste os grânulos condrogénicos na solução de papaína a 60 ° C durante 2 h.
   2. Determine o conteúdo de DNA usando o kit de análise de dsDNA e o sistema de fluorômetro. Medir o conteúdo de sGAG misturando-o com solução de corante DMMB sob a absorção de medição a 525 nm ⁸ .
   3. Calcule a concentração de sGAG contra uma curva padrão deSulfato de condroitina de tubarão.
9. Execute a análise de PCR em tempo real dos marcadores de diferenciação condrogênica em grânulos de hiPSC-Chon.
   1. Colhe 3-4 dos mesmos grânulos condrogénicos adicionando 500 μL de reagente de extração gelada a um tubo. Vortex completamente. Incubar a amostra durante 5 minutos à TA.
   2. Adicione 0,1 mL de clorofórmio. Vortex a amostra por 15 s e incuba-a à TA por 3 min. Centrifugue a amostra por 15 minutos a 12.000 xg e 4 ° C. Transfira a fase aquosa superior (cerca de 250 μL) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Adicionar 25 μL de acetato de sódio e 1 μL de glicogênio à amostra. Precipite o ARN misturando-o com 250 μL de álcool isopropílico. Homogeneizar. Incubar a amostra à TA por 10 min.
   4. Centrifugar durante 10 min a 12,000 xg e 4 ° C. Remova o sobrenadante completamente. Lavar a pastilha de ARN duas vezes com 500 μL de 75% de etanol.
   5. Centrifugar por 5 min.A 7.500 xg e 4 ° C. Remova todo o etanol sobrante e deixe secar a pastilha de ARN por 5-10 min. Dissolver o ARN em 10 μL de água livre de nuclease.
   6. Converta o RNA em cDNA usando um sistema de transcriptase reversa. Sujeite as amostras de cDNA para PCR em tempo real usando qPCR kit master mix (2x) e um sistema de PCR em tempo real ⁹ .
      NOTA: As sequências do iniciador são:
      H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
      H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      H β-ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      H β-ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
      H COL2- R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      H SOX9 -F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
      H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.

Resultados

Diferenciação condrogênica dos hiPSCs:

O meio de formação de EB e o meio de cultura basal foram utilizados para diferenciar os hiPSCs na linhagem mesenquimatosa. Foi utilizado um método de cultura de vários passos ( Figura 1 ). Primeiro, os hiPSCs foram diferenciados espontaneamente através da formação de EB por 10 dias (D10, Figura 2A ). Em segundo lugar, as células sup...

Discussão

Aqui, fornecemos um protocolo para gerar condrócitos de PBCs via iPSCs. Como os PBCs são mais comuns e amplamente utilizados no campo clínico, eles são apresentados como uma alternativa potencial para a reprogramação. Neste estudo, foram utilizados vetores episásicos (EV) para reprogramar PBCs em iPSCs, seguindo o método estabelecido por Zhang et al. ¹¹ . Esta abordagem sem integração não envolve a integração da genotoxicidade associada ao vírus, que se acredita ter um efeito amplo no ca...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Knockout DMEM	Invitrogen 10829018		Meio basal usado para cultura hiPSC e meio de formação de EB
Knockout Serum Replacement (KSR)	Invitrogen	10828028	Um suplemento de meio mais definido, livre de FBS, usado para cultura hiPSC e meio de formação de EB
Soro bovino fetal (FBS)	Hyclone	sh30070.03	Usado para cultura hiPSC e meio de formação de EB, oferece excelente valor para a célula cultura
Aminoácidos não essenciais	Chemicon	TMS-001-C	Usado como suplemento de crescimento em todos os meios de cultura celular, para aumentar o crescimento e a viabilidade celular
L-glutamina	Invitrogen	TMS-002-C	Um aminoácido necessário para a cultura celular
Fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF)	Peprotech	100-18B	Uma citocina usada para sustentar a pluripotência e a auto-renovação de hiPSCs
Dispase	Invitrogen	17105041	Usado para dissociação hiPSC para subcultura
DMEM	Gibco	C11960	Meio basal usado para meio de cultura MSC
0,1% gelatina	Millipore	ES-006-B	Usado para fixação celular nos pratos
0,25% tripsina / EDTA	Gibco	25200072	Usado para dissociação celular
DPBS	Gibco	14190250	Uma solução salina balanceada usada para lavagem celular ou preparação de reagente
2-mercaptoetanol	invitrogen	21985023	Usado como suplemento de crescimento em todo o meio de cultura celular.
SEU	invitrogen	41400045	insulina, transferrina, solução de selênio.
Ácido ascórbico	Sigma	4403	Conhecido como vitamina C. Ajuda no crescimento ativo e tem propriedade antioxidante.
Piruvato de sódio	Gibco	11360070	Adicionado ao meio de cultura celular como fonte de energia, além da glicose.
Fator de crescimento transformador-beta 1	Peprotech	AF-100-21C	Uma citocina que regula a proliferação celular, o crescimento e a diferenciação condrogênica.
Anticorpos policlonais de coelho contra o colágeno II	Abcam	ab34712	Este anticorpo reage com colágenos tipo II, que é específico para tecidos cartilaginosos.
Anticorpos monoclonais de camundongo para colágeno X	Abcam	ab49945	Este anticorpo reage com o colágeno tipo X, que é um produto de condrrotócitos hipertróficos.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Para montagem e armazenamento a longo prazo de lâminas
Azul de toluidina	Sigma	89640	Usado para detecção de proteoglicanos.
Alcian blue	Amresco	#0298	Usado para detecção de glicosaminoglicanos.
Papaína	Sigma	P4762-25MG	Usado para digerir pellets condrogênicos.
Azul de dimetilmetileno	Sigma	341088-1G	Usado para quantificar glicosaminoglianas
Sal de sódio de sulfato de condroitina da cartilagem de tubarão	Sigma	C4384-250MG	Usado para desenhar a curva padrão para medição do conteúdo de sGAG.
Kit de ensaio Qubit dsDNA HS	Invitrogen	Q32851 (100)	Usado para determinar o conteúdo de DNA
TRIzol	Invitrogen	15596018	Usado para isolamento de RNA de células
Sistema de Transcriptase Reversa	Promega	A3500	Usado para converter RNA em cDNA
SYBR FAST kit qPCR Master Mix	Kapa	KK4601	Usado para PCR em tempo real