Entrega sistêmica de MicroRNA utilizando vírus Adeno-associado recombinante sorotipo 9 para tratar doenças neuromusculares em roedores

Resumo

Aqui descrevemos a entrega de microRNA utilizando um vírus adeno-associado recombinante sorotipo 9 em um modelo do rato de uma doença neuromuscular. Uma única administração periférica em camundongos resultou em superexpressão de miRNA sustentada no músculo e neurônios motores, oferecendo uma oportunidade de estudo miRNA função e potencial terapêutico em vivo.

Resumo

Interferência do RNA através da via endógena miRNA regula a expressão gênica controlando a síntese de proteínas através de silenciamento pós-transcricional. Nos últimos anos, regulação gênica mediada por miRNA demonstrou potencial para tratamento de doenças neurológicas causadas por um ganho tóxico do mecanismo da função. No entanto, entrega eficiente para os tecidos-alvo tem limitado a sua aplicação. Aqui usamos um modelo do rato transgénico para atrofia muscular espinhal e bulbar (SBMA), uma doença neuromuscular causado pela expansão do polyglutamine no receptor de andrógeno (AR), para testar o silenciamento de genes por um recém identificados AR-direcionamento miRNA, miR-298. Nós overexpressed miR-298, usando um vetor de sorotipo 9 vírus adeno-associado recombinante (rAAV) para facilitar a transdução de células não-divisão. Uma única injeção de cauda-veia em camundongos SBMA induzido superexpressão sustentado e generalizado da miR-298 no músculo esquelético e neurônios motores e resultou em melhora do fenótipo neuromuscular nos ratos.

Introdução

Os MiRNAs são não-codificantes RNAs, 21 a 23 nucleotídeos de comprimento, que desempenham um papel importante na regulação da expressão do gene e o controle de diversas vias metabólicas e celulares. ¹ expressão de Gene é regulada principalmente através da indução de degradação de silenciar ou mRNA gene pós-transcricional. ² os MiRNAs são geralmente complementares 3' untranslated região (UTR) da codificação de genes, embora vinculativos para os 5' UTR e codificação de regiões de destino que mRNA também tem sido descrita. ³

Como a compreensão atual dos papéis de miRNA na patogênese de doenças humanas se expande, modulação farmacológica de miRNAs individuais ou famílias de miRNA é cada vez mais uma opção terapêutica viável. Em comparação com outras estratégias de inibição de RNA, os miRNAs têm muitas vantagens: miRNAs são menos tóxicas e menos imunogênica e pode ser facilmente entregue nas células por causa de seu tamanho pequeno. ^{4 , 5 , 6} MiRNAs normalmente têm muitos alvos dentro de redes celulares, portanto, potenciais efeitos fora do alvo e preocupações de segurança precisam ser tomadas em conta, juntamente com entrega eficiente para os tecidos-alvo.

Doenças neuromusculares são adquiridas ou herdados de condições que afetam o músculo e neurônios motores. O direcionamento das drogas para o músculo esquelético é uma área emergente de investigação, onde o principal desafio é conseguir a distribuição generalizada dentro da janela terapêutica. ⁷ os neurônios motores são mais difíceis para o alvo, principalmente porque o acesso de drogas é impedido pela barreira hemato-encefálica.

Modelos de mouse e cultura celular de atrofia muscular espinhal e bulbar (SBMA) foram utilizados neste estudo. SBMA é uma doença neuromuscular, causada por um ganho tóxico do mecanismo da função, em que ambos os músculos e neurônios motores são afetados. ^{8 , 9} SBMA (doença de Kennedy; OMIM #313200) é uma doença ligada ao X, caracterizada por fraqueza muscular e atrofia, causada pela expansão de repetição CAG no gene da AR, que codifica um trato polyglutamine prolongada da proteína de AR . ¹⁰ nenhum tratamento doença-modificando está atualmente disponível para esta doença. O modelo de rato transgénico utilizado neste estudo recapitula as características da doença, incluindo a especificidade de gênero, patologia do neurônio motor e atrofia muscular progressiva. ¹¹

Neste estudo, nossos esforços focados na identificação de um miRNA que diretamente downregulates expressão do transgene mutante do AR e no design de um modo seguro e eficiente de entrega do miRNA da medula espinhal e músculo esquelético de nosso modelo de mouse de doença.

Aqui, nós identificamos uma miRNA relativamente descaracterizada, miRNA-298 (número de adesão MIMAT0004901),¹² para reduzir diretamente a expressão mutante de AR nos modelos SBMA. Para realizar a entrega de miR-298 para tecidos-alvo, usamos uma estratégia viral, com vírus adeno-associado recombinante sorotipo 9 (rAAV9). rAAV9 é capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica e mediando a longo prazo expressão gênica em células não-divisão, incluindo os neurônios. ¹³ uma única administração sistémica de AAV9-miR-298 resultou na expressão sustentado da miRNA, transdução eficiente de músculo e neurônios motores, para baixo-regulamento da expressão do AR e melhoria do fenótipo da doença em camundongos SBMA. ¹⁴ esta metodologia pode ser usada para fornecer miRNA ou antagomirs superexpressão na vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (8ª Ed., imprensa nacional de academias, revisado 2011) e foram aprovados pela Comissão Cuidado Animal NINDS.

1. AAV9-miRNA projeto estratégia e miRNA seleção

1. Use miRWalk preditivo de banco de dados para selecionar candidatos miRNAs que interagem com a mRNA 3' UTR região do gene do alvo. ¹⁵
   Nota: Restringir semente mínima comprimento da sequência de miRNA para pelo menos 7 nucleotídeos. Selecione outros programas de previsão de miRNA estabelecida (miRanda, miRDB, Targetscan) para análise comparativa. Com base nestes critérios de seleção, aqui, 185-miR, miR-298, miR-873 e miR-877 foram selecionados para futura avaliação.
2. Recupere a sequência de miRNA o selecionado de miRBase (http://www.mirbase.org/).
3. Clonar a pri-mir (60-70 nts) e suas nts de 250-300 flanqueando a sequência genômica em ambos os lados, ou uma sequência de simulação, para o apropriado AAV cis vetoriais.
   Nota: A sequência de acompanhamento é necessária para expressão correta pri-mir e processamento de microRNA madura. Selecione um vetor de cis rAAV dual-promotor com uma gaveta de expressão composta por exemplo um promotor de alfa do fator-1 (EIF1α) de alongamento humano seguido do miRNA selecionado ou sequência de simulação e o promotor humana citomegalovírus (CMV), seguido de cDNA codificação a tag fluorescente GFP. O promotor EIFα foi escolhido porque garante a expressão estável e homogênea, com riscos mínimos de silenciamento. Promotores específicos ou condicionais de tecido podem ser usados, dependendo de aplicações específicas.
4. Prepare-se, purificar e titula-se a AAV, seguintes protocolos publicados. ¹⁶
   Nota: Aqui, clonagem de pri-mir para a AAV vector e produção viral foram realizados por um fabricante externo.

2. cauda veia injeção do plasmídeo de AAV-miRNA

Nota: Este passo precisa ser ajustada de acordo com o gene do alvo e a idade e peso dos ratos. Use as diretrizes institucionais e cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) para determinar o intervalo de dose, volume e melhor via de administração, com base na idade e ao peso dos ratos. GFP fluorescência sinal e miRNA expressão níveis em tecidos-alvo são esperados para o pico a partir de 2 semanas após a injeção. O seguinte protocolo refere-se aos ratos machos no início da idade adulta. AAV deve ser tratado como um risco biológico sob orientações de biossegurança nível 1.

1. Divida o estoque de plasmídeo AAV-miRNA em alíquotas de 100-200 µ l contendo uma carga viral de 10¹⁰-10¹¹ genomas virais / mL (vg/mL), utilizando soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS). Equipamento protetor pessoal de laboratório risco biológico deve ser usado para lidar com a solução AAV.
   Nota: Uma vez que a alíquota é descongelada pode ser armazenado a 4 ° C por até duas semanas. Ações virais podem ser armazenadas no freezer-80 ° C.
2. Contenha o mouse em aparelhos comercialmente disponíveis, tais como tubo de plástico ou cônico película plástica do tamanho apropriado.
3. Limpe a superfície da cauda com toalhetes com álcool 70%.
4. Segurar uma almofada quente (28-30 ° C) sob a cauda para aumentar a vasodilatação por 30 s. Alternativamente, aquecer os animais usando uma lâmpada de calor vermelho (a uma distância de 2-3 pés) ou mergulhando a cauda em água morna.
5. A partir da porção distal da cauda, introduza a agulha (27-30 G) carregado com alíquota viral, bisel, 15° da cauda, no interior da veia. Antes da injeção, assegure que a agulha é inserida corretamente.
   1. Se sentir resistência durante a injeção, ou inchaço aparece sob a pele, pare o procedimento. Retire a agulha e re-inserir a agulha acima do local da injeção anterior.
      Nota: Como alternativa, isto pode ser conseguido suavemente a agulha de aspiração e observando o sangue. Aspiração difícil pode entrar em colapso da veia da cauda. Se a veia blanches durante a injeção, a agulha é inserida corretamente.
6. Depois que a injeção tenha sido concluída, aguarde alguns segundos antes de disparar a agulha.
7. Observe o local da injeção para o sangramento. Aplique uma pressão moderada usando dois dedos para o site até parar de sangrar.
8. Retorno do animal para sua gaiola.

3. comportamentais ensaios

Nota: Todos os experimentos foram conduzidos cegamente por um terceiro com ocultação de tratamentos por frascos com exclusividade codificados. Ordem dos tratamentos foi escolhido aleatoriamente. Ao executar os testes descritos abaixo, condições experimentais (tipo de quarto) e o tempo do dia devem ser controladas para reduzir a variação. Este teste deve ser realizado em ratos mais de quatro semanas para alcançar resultados fiáveis. Rato foi submetido a avaliação comportamental, uma vez antes de injeção viral em 5 semanas de idade para obter a linha de base do desempenho normal. Após a injeção de viral, os ratos foram avaliados uma vez por semana, começando a 48 h após a injeção, até a 40 semanas de idade.

1. Traga o mouse injetado com vírus adeno-associados a um quarto quieto, escuro que está livre de ruído ou outro distúrbios no mínimo 30 min antes de iniciar os testes. Não perturbe os animais durante este período de aclimatação.
2. Aclimatar o mouse para a nova sala por 30 min e em seguida, iniciar os seguintes ensaios comportamentais (passos 3.3 e 3.4). Manter um intervalo de 10 minutos entre cada ensaio comportamental.
3. Teste do fio de suspensão
   Nota: Este teste monitora a força muscular e disfunção motora.
   1. Use uma folha de preenchimento para agir como um amortecedor. Pegar o rato por sua cauda e coloque-o sobre o centro da cremalheira da grade de arame. Levantar o rack de 15-20 polegadas acima da superfície e lentamente inverter a tela para permitir que o animal ajustar seu aperto na tela.
   2. Uma vez que o rack é completamente invertido, iniciar o temporizador e registrar o tempo a cair.
      Nota: Os ratos pendurará com quatro membros em uma grade. Se o fio estiver definido muito baixo os ratos podem não aguenta. Se os ratos caem fora da grade antes de 60 s, colocá-los de volta na grade, redefinir o timer e repita este procedimento até duas tentativas mais. Registre o melhor desempenho.
   3. Quando o tempo limite de 60 s for atingido, retorne a animal de volta para a gaiola.
4. Ensaio de impressão de pé
   Nota: A folha absorvente deve ser uma pista estreita, cerca de 70 cm longo e 5 cm de largura com muros altos de 5 cm.
   1. Mantenha o mouse suavemente, por um lado e aplicar a tinta vermelha para as patas dianteiras e as patas traseiras com um pincel de tinta azul.
   2. Coloque a folha absorvente no piso de uma pista estreita.
   3. Permitir que o mouse para caminhar ou correr sobre uma folha de absorvente em linha reta na pista de um lado para outro.
   4. Repita o processo duas vezes com o mouse usando uma folha fresca de absorvente.
   5. Medir a distância entre dois passos consecutivos no movimento para a frente. Não incluir primeiro e último poucas pegadas onde o animal é só iniciar e terminar a sua execução.

4. a eutanásia e a colheita de tecidos

1. Use uma câmara de eutanásia ou uma redoma de vidro. Se usando uma redoma de vidro, execute o procedimento sob uma coifa.
2. Embeber algodão com isoflurano e colocá-lo na redoma de vidro. Use um separador físico para manter o animal de contato físico com o material de anestesia. Coloque o animal no frasco imediatamente depois desta etapa.
   Nota: A redoma de vidro não deve ser pré-carregados com isoflurano para evitar a possibilidade de hipoxemia nos animais.
3. Continuar a exposição de isoflurano até 30 s após a respiração para.
4. Imediatamente depois de retirar o mouse do frasco, eutanásia por deslocamento cervical.
   Nota: Este passo deverá ocorrer tão rapidamente quanto possível para evitar a degradação do tecido.
5. Colheita do espinhal cabo primeiro e depois o músculo quadríceps.
   1. Para colher a medula espinhal, expor a parte traseira do mouse e corrigir os quatro membros do lado de um tabuleiro de dissecação.
   2. Lave o local da dissecação com etanol a 70%.
   3. Execute o deslocamento cervical, usando uma tesoura afiada.
   4. Fazer uma incisão na pele na linha mediana. Retire a pele por corte ou rasgo de cuidado da pele no plano transversal, seguido de puxar a pele por cima da cabeça. Remova a cabeça por corte com tesoura debaixo das omoplatas, na região de C1-2 da coluna (encontrada adjacente à base do crânio).
      1. Corte a musculatura da parede abdominal no lado ventral e lateralmente, continuar uma direção por vez, até a coluna vertebral é alcançada.
   5. Usando uma vértebra de tesoura afiada retire a partir da medula espinhal cervical. Remova as partes laterais das vértebras cortando através dos arcos vertebrais em ambos os lados.
   6. Depois de remover as vértebras toda versão da medula espinhal.
6. Snap congelar os tecidos colhidos no pre-chilled 2-methylbutane utilizando o seguinte método:
   1. Metade encha uma tigela de aço inoxidável com 2-methylbutane e mergulhe no trimestre inferior da bacia em um recipiente enchido com nitrogênio líquido.
   2. Pre-calma a 2-methylbutane em nitrogênio líquido para 1-2 min.
   3. Coloque o músculo esquelético com pinças na methylbutane-2, até que se torne branco. Transferir imediatamente o tecido secar gelo e armazená-lo em seguida a-80 ° C.
7. Para medula espinhal imunocoloração, incorpore o tecido em blocos de parafina à temperatura ambiente antes de snap congelamento conforme descrito. ¹⁷
8. Para análises bioquímicas e quantificação de miRNA,¹ Coloque o tecido colhido em um cryovial e congelamento em nitrogênio líquido. Armazenar as amostras a-80 ° C.

Resultados

Uma carga viral de 10¹¹ vg de AAV9-miR-298 foi injetada através de uma única injeção de cauda-veia em ratos SBMA 5 semanas de idade. Estes ratos o transgene humano de AR com trato polyglutamine anormalmente expandidas no AR (AR97Q) e desenvolvem sinais de doença neuromuscular por 10 semanas de idade (perda de peso, costas curvada e atrofia muscular). ¹¹ lombar da medula espinhal e músculo quadríceps foram colhidas com 2, 4, 8 e 12 semanas após a administração para quantificação de miRNA, ensaio bioquímico e imuno-histoquímica (Figura 1). Administração do tratamento e as análises subsequentes foram realizados por investigadores cegos.

análise de qRT-PCR mostrou miR-298 expressão no músculo esquelético e a medula espinhal, duas semanas e quatro semanas após o tratamento, respectivamente, com os níveis de expressão de pico em 8 semanas no músculo esquelético e 12 semanas na medula espinhal após a injeção (Figura 2 ). Usando um microscópio (Axiovert 100 M), sinal de fluorescência verde foi detectado no tecido muscular e em neurônios da coluna vertebral pela localização co de GFP e o neurônio motor marcador colina acetiltransferase (ChAT) 10 semanas após o tratamento, quando os ratos começam a mostrar manifestações da doença (Figura 2).

Usando o mesmo regime de dose, uma coorte de ratos SBMA foi randomizada para receber ou miR-298 ou zombar de 7 semanas de idade através da injeção de veia de cauda para análises bioquímicas e caracterização funcional. Injeção foi seguida pelo peso semanal e avaliação comportamental de 40 semanas de idade. análise de qRT-PCR mostrou que miR-298 tratamento reduz os níveis de mutante AR nos tecidos afetados (Figura 3) e aumentou o peso do corpo e melhorou o desempenho motor (Figura 4) iniciando em 10 semanas após a injeção.

Figura 1: esquemático do estudo design. Para aumentar os níveis de expressão de miR-298 em vivo, injetamos ratos SBMA (A), o vetor de vírus adeno-associados promotor dual plasmídeo expressando GFP e miR-298 ou simulação. (B) os ratos foram injetados através de uma única injeção de cauda-vaidoso em 7 semanas de idade (fase pré-sintomática). Medula espinhal e músculo quadríceps foram coletados de uma coorte de ratos SBMA em pontos de tempo diferentes para análise da distribuição do tecido (verde). Uma coorte de ratos SBMA foi tratada e sacrificada em 16 semanas de idade para as análises bioquímicas (vermelhas). Peso e ensaios comportamentais foram realizados semanalmente acima de 40 semanas de idade para a caracterização funcional (azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: AAV9-miR-298 entrega em camundongos. Usando o método descrito aqui, ratos receberam AAV9-miR-298-GFP ou AAV9-simulação-GFP através de injeção intravenosa. MiRNA total foi coletado de lombar da medula espinhal e do músculo quadríceps em 2,4,8 e 12 semanas após a injeção. qRT-PCR foi realizada para estimar o nível de expressão do músculo quadríceps de miR-298 em (A) (n = 5) (B) da medula espinhal lombar (n = 5, P < 0,01). Todos os dados são relatados como média ± erro-padrão médio. A transdução generalizada do vetor AAV em tecidos colhidos em 10 semanas após tratamento foi confirmado pela localização de coloração para as boas práticas agrícolas no músculo quadríceps (C) (ampliação original, 10 X. Barra de escala = 100 µm) e (D) neurônios motores na medula espinhal lombar (magnificação original, 40 X. Barra de escala = 10 µm. GFP (verde), ChAT (vermelho) e DAPI (azul). A figura foi modificada de doi: 10.1038/mt.2016.13. ¹⁴ Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: MiRNA-298 sobre-expressão downregulates mutante AR na medula espinhal e do músculo quadríceps em camundongos. qRT-PCR foi realizada para estimar os níveis de expressão de RNAm de AR no (A) lombar da medula espinhal e do músculo quadríceps (B), tratados com AAV9-miR-298-GFP ou AAV9-simulação-GFP. Níveis de transcrição foram normalizados para snoRNA202 (n = 5 por tratamento). * P < 0.05, * * P < 0,01. Todos os dados são relatados como significa ± erros-padrão. A figura foi modificada de doi: 10.1038/mt.2016.13. ¹⁴

Figura 4: MiR-298 sobre-expressão melhora o funcionamento do motor e reduz a perda de peso. Avaliação comportamental realizou-se uma vez por semana (w), entre a semana de 5 a 40. Peso corporal (à esquerda) e desempenho de fio (à direita) dos ratos de suspensão (n = 15 por grupo). Todos os dados são relatados como significa ± erros-padrão. A figura foi modificada de doi: 10.1038/mt.2016.13. ¹⁴

Discussão

Aqui vamos demonstrar uma metodologia altamente eficiente e acessível para selecionar e entregar através da injeção de cauda uma miRNA usando rAAV9 como um vetor viral para atingir o músculo esquelético e neurônios motores em camundongos. ¹⁴ em comparação com outras estratégias de RNAi, miRNAs são menos tóxicas e menos imunogênica. ¹⁸ além disso, seu pequeno tamanho torná-los bem adaptado à capacidade limitada de embalagens de vetores virais. ² algoritmos computacionais e ferramentas de previsão permitem a identificação de alvos putativos miRNA-mRNA. Uma vez identificados, os efeitos de miRNA na expressão do gene alvo devem ser verificados. Uma abordagem comum é overexpress um determinado miRNA em vitro e detectar níveis de expressão da proteína alvo usando análise ocidental. ^{14 , 19}

Diversos estudos utilizaram estratégias virais e não virais para a entrega de miRNAs. ¹³ aqui usamos vírus adeno-associado (AAV) como uma ferramenta de entrega do gene. Em comparação com outros vetores virais, AAV provoca baixa imunogenicidade, permite a transferência de genes a longo prazo, e tem um amplo espectro de tropismo em dividir e não dividir células. ¹⁸ este método de entrega também pode contornar a necessidade de modificação química que possa afetar a funcionalidade e a especificidade da molécula de RNA. Existem vários sorotipos de vírus adeno-associados, que são determinados principalmente pela composição das proteínas do capsídeo. Estes sorotipos diferem no seu tropismo e transduce diferentes tipos de células. É necessário selecionar o sorotipo correto quando se considera o tecido-alvo. Nós selecionamos rAAV9, devido a sua eficiência de transdução alta no sistema nervoso central e músculo esquelético após administração periférica^19,20. Esta abordagem tem demonstrado maior eficácia de transdução em animais neonatais em comparação com animais adultos, provavelmente devido a diferenças na composição da matriz extracelular, relação do neurônio-para-glia e maturidade da barreira hemato-encefálica. ^{21 , 22}

Um passo importante para este protocolo é o design do vetor de expressão. Comparado com bicistronic vetores, que são dificultados pela menor expressão do gene do segundo, em comparação com o primeiro gene ao lado o promotor, o vetor de promotor dual permite uma configuração consecutiva produzindo alta expressão da miRNA e EGFP, assim permitindo a localização da miRNA no tecido do mouse por imunofluorescência.

Injeção intravenosa de AAV9 resultou em alta eficiência e transdução homogénea no tecidos-alvo, músculo esquelético e os neurônios motores. Esta rota de injeção permite que a dose administrada alcançar a circulação sistêmica e atravessar a barreira de sangue do cérebro, que é importante para terapias alvo do sistema nervoso central. Além disso, é um método não-invasivo para entrega ao SNC. MiR-298 expressão aumentada na medula espinhal e muscular após 2-4 semanas, com uma única injeção periférica em 5 semanas de idade. Quando usando vetores AAV single-stranded do genoma, a síntese de novo da segunda cadeia de DNA pode contabilizar a transdução retardada. ²³

Níveis de miR-298 humana foram indetectáveis em camundongos tratados 20 semanas após uma única administração, sugerindo que para doenças crônicas, múltiplas injeções podem ser necessárias para alcançar um benefício terapêutico. No entanto, miRNA degradação ao longo do tempo pode ser um fator limitante quando uma administração repetida ao longo da vida é necessária. Além disso, a imunidade adaptativa aos vetores AAV pode formar outra barreira para uma entrega bem sucedida gene. ²⁴ assim geração de vetores AAV que são imunologicamente inerte é crucial para a administração repetida e alcançar efeitos a longo prazo com este sistema de entrega a promissora. ²⁵

Uma limitação do uso de miRNA como uma estratégia terapêutica é o risco de efeitos fora do alvo. Os MiRNAs podem interagir através de emparelhamento base incomplementary com outras transcrições de gene, que representa um risco de segurança com esta abordagem. Melhorada a criação de sequências de RNAi, incluindo o uso de miRNAs não-canônicos, tais como mirtrons, que ignorar o complexo de microprocessador e extensos estudos de segurança e tolerabilidade a longo prazo são essenciais antes de traduzir esta estratégia em um cofre e terapia eficaz. ^{26 , 27 , 28}

O método descrito aqui foi originalmente desenvolvido para superexpressão de miRNA, mas também pode ser utilizada para a terapia de inibição de miRNA usando antagomirs.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente de lise QIAzol	Qiagen	79306	Lise de tecidos gordurosos e padrão antes do isolamento de RNA
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	Purificação de miRNA e RNA total
TaqMan MicroRNA Kit de transcrição reversa	ThermoFisher Scientific	4366596	Um kit altamente específico que quantifica apenas miRNAs maduros
snoRNA202 Primer	ThermoFisher Ensaio de	controle de miRNA Taqman	1232
miR-298 Primer	ThermoFisher Ensaio de	miRNA-298 Taqman	2190
Anticorpo anti-GFP	abcam	ab290	Coelho policlonal para GFP - Almofada de tinta vermelha de grau ChIP
	Dovecraft Essentials
Almofada de tinta azul	Dovecraft Essentials
AAV9-GFP vetor	SignaGen Laboratories	SL100840	Construção, embalagem e purificação de plasmídeos AAV em grande escala
mmu-miR-298-5p	ThermoFisher Scientific		MC12525 miRNA imitam
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP	Vector Biosystems Inc