Este protocolo descreve métodos para purificar, quantificar e caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exossomos de células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimatosas e para utilizá-las para transferir a capacidade de formação de glândula mamária para células epiteliais mamárias luminal. EVs / exosomas derivados de células epiteliais mamárias semelhantes a tronco podem transferir esta propriedade celular para células que ingerem EVs / exossos.
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Artigo de método
Transferência de capacidade de formação de glândulas mamárias entre células epiteliais basais mamárias e células luminal mamárias através de vesículas / exossos extracelulares
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Neste artigo
Resumo
Resumo
As células podem se comunicar através de exossos, vesículas extracelulares de 100 nm (VE) que contêm proteínas, lipídios e ácidos nucleicos. As vesículas extracelulares derivadas de células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimatosas (NAMEC) podem ser isoladas do meio NAMEC por ultracentrifugação diferencial. Com base na sua densidade, os VE podem ser purificados através de ultracentrifugação a 110 000 x g. A preparação EV a partir da ultracentrifugação pode ser mais separada usando um gradiente de densidade contínua para evitar a contaminação com proteínas solúveis. Os EVs purificados podem então ser mais avaliados usando a análise de rastreamento de nanopartículas, que mede o tamanho eo número de vesículas na preparação. As vesículas extracelulares com um tamanho variando de 50 a 150 nm são exossos. Os EVs / exosomas derivados de NAMEC podem ser ingeridos por células epiteliais mamárias, que podem ser medidas por citometria de fluxo e microscopia confocal. Algumas propriedades das células-tronco mamárias ( por exemplo, capacidade de formação de glândula mamária) podemSer transferido dos NAMECs de haste para células epiteliais mamárias através dos EVs / exossomos derivados de NAMEC. As células epiteliais primárias preliminares da EpCAM hi / CD49f lo luminal não podem formar glândulas mamárias após serem transplantadas para almofadas de gordura de ratos, enquanto as células epiteliais mamárias basais EpCAM lo / CD49f hi formam glândulas mamárias após o transplante. A absorção de EVs / exosomas derivados de NAMEC pelas células epiteliais mamárias EpCAM hi / CD49f lo luminal permite que elas gerem glândulas mamárias após serem transplantadas para almofadas de gordura. Os EVs / exossomos derivados de células epiteliais mamárias semelhantes a tronco transferem a capacidade formadora de glândula mamária para as células epiteliais mamárias EpCAM hi / CD49f lo luminal.
Introdução
Os exossos podem mediar a comunicação celular através da transferência de proteínas de membrana e citossolo, lipídios e RNAs entre as células 1 . A comunicação mediada por exosomo demonstrou estar envolvida em muitos processos fisiológicos e patológicos ( ie, apresentação de antígenos, desenvolvimento de tolerância 2 e progressão tumoral 3 ). Os exossomos geralmente têm conteúdos semelhantes aos das células-fonte que as liberam. Assim, os exossos podem transportar propriedades celulares específicas das células originais e transferir essas propriedades para as células que as ingerem
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Protocolo
Todas as pesquisas envolvendo animais obedeceram aos protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados com Animais.
1. Isolação e Validação Extracelular da Vesícula / exossoma
- Células basais epiteliais mamárias culturais, NAMECs 4 , com meio fresco e sem soro feito de 500 mL de MCDB 170, pH 7,4 + 500 mL de DMEM / F12 com bicarbonato de sódio (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hidrocoríssona (0,5 μg / mL); Insulina (5 μg / mL); Extracto de pituitária bovina (BPE; 35 μg / mL); E GW627368X (1 μg / mL) em pratos de 15 cm.
- Depois de contar as células com um hemocitómetro, semente 1,2 x 10 6
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Resultados
Uma vez que foi demonstrado que o bloqueio da sinalização de PGE 2 / EP 4 desencadeia a liberação de EV / exossomo a partir de células-tronco basais semelhantes a mamas 4 , este trabalho apresenta um método para isolar os EVs / exosomas induzidos pela cultura de células basais epiteliais mamárias (NAMEC). Uma vez que os NAMECs são cultivados em meio isento de soro, não existem EVs / exossomos pré-existentes derivados do soro
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Discussão
Os exossomas geralmente carregam características das células que os liberaram e a quantidade de exosomas liberados pode ser induzida por estímulos 4 . O meio de cultura das células pode ser coletado e submetido a ultracentrifugação diferencial para a coleta de EV / exossomo ( Figura 1 ). Atualmente, não existe um acordo geral sobre um método ideal para isolar EVs / exossomos. O método ideal usado aqui foi determinado pelo aplicativo a jusante 14
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por bolsas dos Institutos Nacionais de Pesquisa em Saúde (05A1-CSPP16-014, HJL) e do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K ultracentrifuge | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotor | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotor | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | para análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | Solução de iodixanol a 60% (p/v) em água (estéril). |
| O anticorpo CD81 | GeneTex | GTX101766 | 1:1.000 em leite em pó desnatado a 5% p/v, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 ° C, durante a noite |
| O anticorpo CD9 | GeneTex | GTX100912 | 1:1.000 em 5% p/v de leite em pó desnatado, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 ° C, durante a noite |
| Anticorpo CD63 | Abcam | Ab59479 | 1:1.000 em 5% p/v de leite em pó desnatado, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 ° C, durante a noite |
| O anticorpo TSG101 | GeneTex | GTX118736 | 1:1.000 em 5% p/v de leite em pó desnatado, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 ° C, durante a noite |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6.000 em 5% p/v de leite em pó desnatado, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 ° C, durante a noite |
| CFSE (carboxifluoresceína succinimidil diacetato éster) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | analisador de células de fluorescência | |
| colagenase Tipo IV | Thermo | 17104019 | |
| tripsina | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | uma mistura de insulina humana recombinante, transferrina humana e selenito de sódio |
| accutase | ebioscience | 00-4555-56 | uma mistura enzimática natural com atividade enzimática proteolítica e colagenolítica |
| dispase | STEMCELL | 7913 | 5 mg/mL = 5 U/mL |
| anticorpo anti-CD49f | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| anticorpo anti-EpCAM | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | classificador de | |
| células carmim alúmen | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| células epiteliais mamárias humanas (células HMLE, NAMECs) | presentes do Dr. Robert Weinberg | ||
| Thermo | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| bicarbonato de sódio | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hidrocoritisona | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (extrato de hipófise bovina) | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| 15 cm | Falcon | ||
| centrífuga de mesa | Eppendrof | Tubo de ultracentrífuga Centrífuga 3415R | |
| Beckman | 344058 | ||
| PBS (solução salina tamponada com fosfato) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Hitachi | HT7700 | ||
| gelatina | STEMCELL | 7903 | |
| Placa de cultura de 10 cm | Falcon | ||
| prato de cultura de 6 poços | Camundongos C57BL | 3516 | |
| NLAC (National Laboratory Animal Center | |||
| FBS (Soro Fetal Bovino) | BioWest | S01520 | |
| gentamicina | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caneta/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| isofluorano | Halocarbono | NPC12164-002-25 | |
| formaldeído | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (Etanol) | J.T. Baker | 800605 | |
| ácido acético glacial | Panreac | 131008.1611 | |
| sulfato de potássio de alumínio | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| Xileno | Leica | 3803665 | |
| 0,22 μ m membranas | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Clips de Ferida, 9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Aplicador de Clipe | de Ferida BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ Termo Vermelho Profundo | Fisher Scientific | Coloração da membrana plasmática | C10046 |
Referências
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
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Reimpressões e permissões
