Este protocolo descreve a separação de complexos funcionais de cadeia de transporte de elétrons mitocondriais (Cx) IV e supercomplexos usando eletroforese nativa para revelar informações sobre sua montagem e estrutura. O gel nativo pode ser submetido a imunotransferência, ensaios em gel e purificação por eletroeluição para caracterizar ainda mais complexos individuais.
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Artigo de método
Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição
Neste artigo
Resumo
Resumo
A cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) transduz a energia derivada da quebra de vários combustíveis na moeda bioenergética da célula, a ATP. O ETC é composto de 5 complexos de proteínas maciças, que também se reúnem em supercomplexos chamados respirasomes (CI, C-III e C-IV) e synthasomes (CV) que aumentam a eficiência do transporte de elétrons e produção de ATP. Vários métodos foram usados por mais de 50 anos para medir a função ETC, mas esses protocolos não fornecem informações sobre a montagem de complexos e supercomplexos individuais. Este protocolo descreve a técnica de eletroforese de gel de poliacrilamida de gel nativo (PAGE), um método que foi modificado há mais de 20 anos para estudar a estrutura do complexo ETC. A eletroforese nativa permite a separação de complexos ETC em suas formas ativas, e esses complexos podem então ser estudados usando imunotransferência, ensaios em gel (IGA) e purificação por eletroeluição. Ao combinar o reResultados da PAGE PAGE nativa com os de outros ensaios mitocondriais, é possível obter uma imagem completa da atividade ETC, sua montagem dinâmica e desmontagem, e como isso rege a estrutura e função mitocondrial. Este trabalho também irá discutir limitações dessas técnicas. Em resumo, a técnica de PAGE nativa, seguida de imunotransferência, IGA e eletroeluição, apresentada abaixo, é uma maneira poderosa de investigar a funcionalidade e a composição dos supercomplexos ETC mitocondriais.
Introdução
A energia mitocondrial na forma de ATP não é apenas essencial para a sobrevivência celular, mas também para a regulação da morte celular. A geração de ATP por fosforilação oxidativa requer uma cadeia funcional de transporte de elétrons (ETC, Cx-I a IV) e ATP sintetase mitocondrial (Cx-V). Estudos recentes mostraram que esses grandes complexos de proteínas são organizados em supercomplexos, chamados respirasomes e synthasomes 1 , 2 . É desafiador analisar a montagem, a dinâmica e a regulação da atividade desses complexos maciços e supercomplexos. Enquanto as medições de consumo de oxigênio tomadas com um eletr....
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Protocolo
Todas as experiências foram realizadas usando corações de ratos C57BL / 6N (tipo selvagem). Os ratos foram anestesiados com CO 2 antes da luxação cervical e todos os procedimentos foram realizados em estrita conformidade com a Divisão de Medicina Animal de Laboratório da Universidade de Rochester e em conformidade com a lei estadual, estatuto federal e a política NIH. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal da Universidade de Rochester (Comitê Universitário de Recursos Animais).
1. CN e BN PAGE
NOTA: Todo o equipamento usado para BN e CN PAGE deve estar livre de det....
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Resultados
Para visualizar supercomplexos mitocondriais, foram usadas 17 , 18 mitocôndrias recentemente isoladas de camundongos. Os supercomplexos mitocondriais são sensíveis a ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, levando à sua desintegração, embora isso possa ser tolerável para alguns pesquisadores. Se o congelamento for necessário para o armazenamento, para garantir melhores resultados, as amostras não devem sofrer mais de .......
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Discussão
Um ETC funcional é necessário para a geração de ATP mitocondrial. Os complexos do ETC são capazes de formar dois tipos de supercomplexos: os respirasomes (Cx-I, -III e -IV) 1 e os synthasomes (Cx-V) 2 . A montagem de cada complexo é necessária para um ETC intacto, enquanto a organização do ETC em supercomplexos é pensado para aumentar a eficiência geral ETC 5 , 22 . Como esses supercomplexos se mestam e desmontam n.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por bolsas do Afiliado do Fundador da American Heart Association [12GRNT12060233] e do Centro de Pesquisa de Crianças Fortes da Universidade de Rochester.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Câmara de mini-gel Protean II | Biorad | 1658004 | Conjunto completo para verter e correr a eletroforese em mini-gel |
| Maxi-gel Protean XL | Biorad | 1653189 | Conjunto completo para verter e correr a eletroforese em maxi-gel |
| Criador de gradientes, Hoefer SG15 | VWR | 95044-704 | Despejar mini-gel |
| gradientes Gradiente maker, maxi-gel | VWR | GM-100 | Derramar maxi-gel gradientes |
| Kit de transferência | Biorad | 1703930 | Conjunto completo para transferência úmida de proteínas para membranas |
| Electroeluter modelo 422 | Biorad | 1652976 | Electroeluição de proteínas de PÁGINAS nativas ou SDS Placas |
| vidro | Biorad | 1653308 | Placas curtas |
| Placas de vidro | Biorad | 1653312 | Placas espaçadoras |
| Placas | de vidroBiorad | 1651823 | Placas internas |
| Placas de vidro | Biorad | 1651824 | Placas externas |
| Fonte de alimentação | Biorad | 1645070 | Fonte de alimentação adequada para eletroforese nativa |
| ECL-Western | Thermo Scientific | 32209 | Substrato de quimiomolumniscense |
| SuperSignal-West Dura | Thermo Scientific | 34075 | Substrato de quimolumniscense aprimorado |
| Filme/filme de autorradiografia | GE Health care | 28906845 | Documentação de Western blots Processador de |
| filme CP1000 | Agfa | NC0872640 | |
| Canon Power Shot 640 | Canon | NA | Tirar fotos para documentar géis, membranas e borrões. |
| Capuz de câmera Canon Power Shot 640 | Câmera de blindagem Canon para fotos tiradas em uma mesa de luz | ||
| Desoxiquelato de sódio | Sigma | D66750 | Detergente |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Sacarose | Sigma | S9378 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | Tampão |
| Imidazol | Sigma | I15513 | Tampão |
| Lauril maltosídeo | Sigma | D4641 | Detergente |
| Coomassie G250 | Biorad | 161-0406 | |
| Ácido aminohexanoico | Sigma | O7260 | |
| Kit de peso molecular nativo | GE Health care | 17-0445-01 | Kit de calibração de alto peso molecular para eletroforese nativa. |
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| Nitroblue tetrazólio | Sigma | N6639 | |
| Tris HCl | Sigma | T3253 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| < strong > Nome< / strong > | < strong > Empresa < / strong > | < strong > Número de catálogo< / strong > | < strong > Comentários< / strong > |
| Nitrato de chumbo (II) (Pb (NO< sub> 3< / sub>) < sub > 2< / sub>): | Sigma | 228621 | |
| Oligomicina | Sigma | O4876 | |
| < strong> Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| anti-ATP5A | Abcam | ab14748 | anticorpo para ATP sintase subunidade ATP5A |
| anti-NDUFB6 | Abcam | ab110244 | anticorpo para Cx-1 subunidade NDUFB6 |
| anti-VDAC | Calbiochem | 529534 anticorpo para anticorpo ligado a VDAC | |
| ECL HRP GE | Health Care | NA931V | anticorpo secundário para ATP5A, NDUFB6 e VDAC |
| Reagente de bloqueio | Biorad | 170-6404 | |
| BSA | |||
| cloreto de sódio | Sigma | S9888 | |
| cloreto de potássio | Sigma | P9541 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Nome | Empresa | Número de Catálogo< | strong>Comentários |
| Kit de coloração de prata | Invitrogen | LC6070 |
Referências
- Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
- Saks, V., et al.
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Reimpressões e permissões
