Artigo de método

Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

DOI:

10.3791/55738

⸱

1 de junho de 2017

 , 
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve a separação de complexos funcionais de cadeia de transporte de elétrons mitocondriais (Cx) IV e supercomplexos usando eletroforese nativa para revelar informações sobre sua montagem e estrutura. O gel nativo pode ser submetido a imunotransferência, ensaios em gel e purificação por eletroeluição para caracterizar ainda mais complexos individuais.

Resumo

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A cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) transduz a energia derivada da quebra de vários combustíveis na moeda bioenergética da célula, a ATP. O ETC é composto de 5 complexos de proteínas maciças, que também se reúnem em supercomplexos chamados respirasomes (CI, C-III e C-IV) e synthasomes (CV) que aumentam a eficiência do transporte de elétrons e produção de ATP. Vários métodos foram usados ​​por mais de 50 anos para medir a função ETC, mas esses protocolos não fornecem informações sobre a montagem de complexos e supercomplexos individuais. Este protocolo descreve a técnica de eletroforese de gel de poliacrilamida de gel nativo (PAGE), um método que foi modificado há mais de 20 anos para estudar a estrutura do complexo ETC. A eletroforese nativa permite a separação de complexos ETC em suas formas ativas, e esses complexos podem então ser estudados usando imunotransferência, ensaios em gel (IGA) e purificação por eletroeluição. Ao combinar o reResultados da PAGE PAGE nativa com os de outros ensaios mitocondriais, é possível obter uma imagem completa da atividade ETC, sua montagem dinâmica e desmontagem, e como isso rege a estrutura e função mitocondrial. Este trabalho também irá discutir limitações dessas técnicas. Em resumo, a técnica de PAGE nativa, seguida de imunotransferência, IGA e eletroeluição, apresentada abaixo, é uma maneira poderosa de investigar a funcionalidade e a composição dos supercomplexos ETC mitocondriais.

Introdução

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A energia mitocondrial na forma de ATP não é apenas essencial para a sobrevivência celular, mas também para a regulação da morte celular. A geração de ATP por fosforilação oxidativa requer uma cadeia funcional de transporte de elétrons (ETC, Cx-I a IV) e ATP sintetase mitocondrial (Cx-V). Estudos recentes mostraram que esses grandes complexos de proteínas são organizados em supercomplexos, chamados respirasomes e synthasomes 1 , 2 . É desafiador analisar a montagem, a dinâmica e a regulação da atividade desses complexos maciços e supercomplexos. Enquanto as medições de consumo de oxigênio tomadas com um eletrodo de oxigênio e ensaios enzimáticos realizados usando um espectrofotômetro podem fornecer informações valiosas sobre a atividade do complexo ETC, esses ensaios não podem fornecer informações sobre a presença, tamanho e composição da subunidade do complexo de proteína ou supercomplexos envolvidos. No entanto, o desenvolvimento de nativos azuis e nítidos (BN e CN, respectivamente) A PAGE 3 criou uma ferramenta poderosa para revelar informações importantes sobre composição complexa e montagem / desmontagem e sobre a regulação dinâmica da organização supramolecular desses complexos respiratórios vitais em condições fisiológicas e patológicas 4 .

A montagem desses complexos em supercomplexos de ordem superior parece regular a estrutura mitocondrial e a função 5 . Por exemplo, a montagem do respirasome aumenta a eficiência da transferência de elétrons e a geração da força motora do próton através da membrana interna mitocondrial 5 . Além disso, a montagem de synthasomes não só aumenta a eficiência da produção de ATP e a transferência de equivalentes de energia para o citoplasma 2 , mas também molda a membrana interna mitocondrial nas cristas tubulares 6 , </ Sup> 7 . Estudos de montagem de supercomplexos durante o desenvolvimento cardíaco em embriões de ratos mostram que a geração de supercomplexos contendo Cx-I no coração começa no dia embrionário 13,5 8 . Outros mostraram que a quantidade de supercomplexos contendo Cx-I diminui no coração devido ao envelhecimento ou lesões de isquemia / reperfusão 9 , 10 ou pode desempenhar um papel na progressão de doenças neurodegenerativas 11 .

Este protocolo descreve métodos para o PAGE gel nativo que podem ser usados ​​para investigar a montagem e a atividade dos complexos ETC e supercomplexos. O peso molecular aproximado dos supercomplexos mitocondriais pode ser avaliado separando os complexos de proteínas em géis de poliacrilamida CN ou BN. O CN PAGE também permite a visualização da atividade enzimática de todos os complexos mitocondriais diretamente no gel (ensaios em gel;IGA) 12 . Este trabalho demonstra a atividade dos respirasomes ao destacar a capacidade do Cx-I de oxidar o NADH através do IGA e a presença de sinteticos devido à atividade de hidrolização de ATP da Cx-V pela IGA. Os múltiplos complexos e supercomplexos contendo Cx-I e Cx-V também podem ser demonstrados pela transferência das proteínas para membranas de nitrocelulose e realização de imunotransferência. A vantagem desta abordagem é que BN ou CN PAGE geralmente separam complexos de proteínas com base em seu tamanho e composição fisiológica; A transferência para uma membrana preserva esse padrão de bandas. A análise de complexos de proteína em uma BN ou CN PAGE também pode ser feita usando 2D-PAGE (ver Fiala et al. 13 para uma demonstração) ou por centrifugação de densidade de sacarose 14 , 15 . Para analisar ainda mais uma banda específica, ela pode ser excluída da BN PAGE, e as proteínas deste complexo proteico podem ser purificadasD, electroelutando-os sob condições nativas. A eletroeluição nativa pode ser realizada dentro de poucas horas, o que poderia fazer uma diferença significativa na difusão passiva (como usada na Referência 16) de proteínas de um gel para o amortecedor circundante.

Em resumo, esses métodos descrevem várias abordagens que permitem a caracterização adicional de supercomplexos de alto peso molecular de membranas mitocondriais.

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Protocolo

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Todas as experiências foram realizadas usando corações de ratos C57BL / 6N (tipo selvagem). Os ratos foram anestesiados com CO 2 antes da luxação cervical e todos os procedimentos foram realizados em estrita conformidade com a Divisão de Medicina Animal de Laboratório da Universidade de Rochester e em conformidade com a lei estadual, estatuto federal e a política NIH. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal da Universidade de Rochester (Comitê Universitário de Recursos Animais).

1. CN e BN PAGE

NOTA: Todo o equipamento usado para BN e CN PAGE deve estar livre de detergente. Para garantir isso, lave todo o equipamento com ácido clorídrico 0,1 M, seguido de enxaguamento extensivo com H 2 O desionizada.

  1. Preparação
    1. Preparar tampão de ânodo consistindo em imidazol 25 mM, pH 7,0, a 4 ° C; Armazenar a 4 ° C.
    2. Prepare o tampão catódico para CN ou BN PAGE.
      1. Para CN PAGE, use 7,5 mM de imidazole e 50 mM de tricina; Adicionar 0,5 g de desoxicolato de sódio e 0,2 g de lauril maltósido por litro de tampão. Ajuste o pH para 7,0 a 4 ° C e armazene a 4 ° C.
      2. Para BN PAGE, use 7,5 mM de imidazole e 50 mM de tricina e ajuste o pH para 7,0 a 4 ° C. Armazenar a 4 ° C.
      3. Para tampão de cátodo BN azul claro, use imidazol 7,5 mM e tricina 50 mM. Ajuste o pH para 7,0 a 4 ° C e adicione 20 mg de Coomassie por litro de tampão. Armazenar a 4 ° C.
    3. Prepare o tampão de extração (EB) com 50 mM de NaCl, 50 mM de imidazole, 2 mM de ácido aminocaproico e 1 mM de EDTA. Ajuste o pH para 7,0 a 4 ° C e armazene a 4 ° C.
    4. Prepare o tampão de gel 3x (usado para os géis BN e CN) com imidazole 75 mM e ácido aminocaproico 1,5 M. Ajuste o pH para 7,0 a 4 ° C e armazene a 4 ° C.
    5. Prepare um tampão de carga (LB) de 0,01 g de Ponceau S, 5 g de glicerol e 5 mL de H 2 O. Armazene na salatemperatura.
    6. Prepare o azul de Coomassie adicionando 50 mg de Coomassie a 1 mL de ácido 6-amino-hexanóico 500 mM. Ajuste o pH para 7,0 a 4 ° C e armazene a 4 ° C.
    7. Prepare 20 mM e 200 mM de lauril maltosido em H 2 O. Faça alíquotas de 200 μL e guarde-as congeladas. Desengate o detergente antes de usar.
3% a 8% (mini) 4% a 10% (maxi)
0,5 géis (luz) 0,5 géis (pesados) 0,5 géis (luz) 0,5 géis (pesados)
AAB (mL) 0,42 1,3 2,5 7,7
Tampão CN / BN (mL) 1,6 1,6 8,5 8,5
H2O (mL) 2,7 1,4 14 6.3
Glicerol (g) 0 0,47 0 2,5
Volume (mL) 4.72 4.77 25 25
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

Tabela 1: Quantidades de Ingredientes Necessárias para Verter 1 Mini- ou Maxi-PAGE. Os volumes utilizados nesta tabela são calculados para 1 mini- ou 1 maxi-gel, 1,5 mm de espessura. O volume de AAB baseia-se em uma solução de estoque de 40%. Light e heavy se referem ao concentradoIon de AAB. APS e TEMED são adicionados após cada coluna do misturador de gradiente ser preenchida com a solução AAB.

  1. Vertendo e correndo géis
    NOTA: Use 3-8% ou 4-10% de gradiente de acrilamida / bisacrilamida (AAB) para geles CN ou BN, respectivamente. A Tabela 1 resume as quantidades de tampão, AAB, H2O, glicerol, sulfato de amônio (APS) e tetrametiletilenodiamina (TEMED) utilizados para um mini-gel (85 mm de largura x 73 mm de altura x 1,5 mm de espessura) ou maxi-gel (160 Mm de largura x 200 mm de altura x 1,5 mm de espessura). As montagens de placas de vidro com geles CN ou BN podem ser refrigeradas em um saco com alguns mL de 1x tampão de gel ou envolvidos em uma toalha de papel molhada com 1x tampão de gel para armazenamento. Os géis são estáveis ​​para uso por até uma semana.
    1. Para derramar o gel, coloque o misturador de gradiente em uma placa de agitação elevada para garantir que o gel fluirá por gravidade na câmara de gel preparada.
    2. Preencha a câmara de saída do misturador gradiente com 4,77 / 25 mL (Mini / maxi) da solução pesada (com maior concentração de AAB).
    3. Abra suavemente a conexão da bujão entre a câmara pesada e a câmara de luz e permita que uma gota de solução atravesse o outro lado.
      NOTA: Isso empurra bolhas de ar do tubo de conexão e do pino de parada, o que impedirá o fluxo entre as duas câmaras. Isso não pode ser feito se ambos os lados já foram preenchidos, porque a pressão igual impedirá que a bolha se mova.
    4. Encha a outra câmara do misturador gradiente com 4,72 / 25 mL (mini / maxi) da solução de luz.
    5. Coloque uma barra de agitação na câmara de saída com a solução pesada e comece a mexer. Use uma velocidade de barra de agitação que não cause borbulhamento.
    6. Adicione rapidamente APS e TEMED a cada câmara para iniciar a polimerização.
    7. Abra a conexão entre as duas câmaras do misturador de gradiente e permita a mistura por alguns segundos antes de abrir a câmara de saída para despejar o gel.
      NOTA: gravidade wiVai drenar as duas câmaras igualmente e a mistura da luz na solução pesada diminuirá lentamente a densidade de acrilamida do fundo para o topo do gel. Use todo o conteúdo que está no misturador de gradiente para despejar o gel.
      1. No final, monte cuidadosamente o pente, com os poços dentro do gel para evitar a mistura de bolhas e camadas.
    8. Lavar imediatamente o misturador de gradiente com etanol para enxaguar qualquer gel. Enxague com água e despeje o segundo gel. Deixe que os géis polimerizem (geralmente menos de 20 min é necessário para mini-géis).
    9. Para executar os géis, montá-los na braçadeira do conjunto do eléctrodo e preencher a câmara central / superior com tampão de cátodo BN ou azul claro. Aguarde alguns minutos para verificar se há vazamentos antes de adicionar o buffer anódico à câmara externa / inferior.
      1. Retire delicadamente os pentes bem e lave os poços com tampão de cátodo usando uma seringa ou uma pipeta.
      2. Execute os géis em uma sala fria (4 ° C) ou completamente embalado em gelo.
        1. Para o CN mini-PAGE, use 100 V pela primeira hora e 200 V até terminar, geralmente um adicional de 1-1,5 h. Alternativamente, execute a mini-PAGE da NC a 30-40 V durante a noite.
          NOTA: O foco aqui é sobre complexos de proteína de alto peso molecular, de modo que os complexos de proteína com um peso molecular inferior a 140 kDa ficarão fora do gel. Pequenos tempos de funcionamento para eletroforese podem ser usados ​​para reter complexos de baixo peso molecular.
        2. Para BN maxi-PAGE, use 100 V e execute os géis durante a noite (cerca de 18 h).
          NOTA: A corrente será muito baixa (<15 mA), portanto, é necessária uma fonte de alimentação que possa lidar com essas condições. Neste ponto, os géis podem ser usados ​​para IGA ou imunotransferência. Em alguns casos, bandas ou faixas podem ser cortadas dos géis usando uma lâmina de barbear em uma placa de vidro para eletroeluição.
  2. Preparação de amostra
    NOTA: Os supercomplexos mitocondriais ligados à membrana devem ser extraídos deE membrana mitocondrial interna. Para preservar supercomplexos mitocondriais, use mitocôndrias recentemente isoladas ou amostras congeladas e descongeladas apenas uma vez. Os cálculos / volumes abaixo são dados para mini-géis (o poço de um pente de 10 poços em um gel de 1,5 mm de espessura detém até 35-40 μL) e maxi-géis (o poço de um pente de 15 po mantém até 200 μL). Além disso, salve uma alíquota de cada amostra (geralmente 10 μL), para ser executada em um gel SDS desnaturante para a detecção do canal aniónico dependente da tensão (VDAC), como controle de carga.
    1. Coloque uma quantidade apropriada ( por exemplo, 10-50 μg de proteína para mini-géis e 50 - 200 μg para maxi géis) de mitocôndrias isoladas ou homogeneizado de tecido em microtubos e centrifugação a 17.000 xg durante 10-15 min a 4 ° C.
      NOTA: Esta etapa remove algumas das proteínas mitocondriais solúveis e / ou citossólidas solúveis.
    2. Aspirar e descartar o sobrenadante e adicionar o buffer de extração à quantidade desejadaPara carregar no gel. Ressuspenda gentilmente o sedimento no gelo. Se desejado, adicione uma mistura geral de inibidor de protease neste ponto.
      NOTA: Com base no equipamento aqui utilizado, utilizou-se 30 μL para um mini-gel e 100 μL para um maxi-gel, limitando a relação proteína / tampão a não mais de 2 μg de proteína para 1 μL de tampão.
    3. Adicione detergente ( por exemplo, 2 μg de lauril maltósido / 1 μg de proteína, veja os Resultados representativos e Discussão para mais informações).
      NOTA: Geralmente, utiliza-se lauril maltosido, mas a digitonina também pode ser usada.
    4. Incubar no gelo por 20 min. Misture gentilmente no início e ocasionalmente durante a incubação triturando e / ou agitando o tubo.
    5. Centrifugar a 17,000 xg durante 10 min a 4 ° C para remover qualquer fragmento de membrana e tecido.
    6. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Para amostras de CN, adicionar 1 μL de LB por cada 10 μL de volume da amostra; O volume total da amostra deve ser a aplicaçãoAproximadamente 40 μL para um mini-gel e 130 μL para um maxi-gel. Para amostras de BN, adicione Coomassie às amostras para que a proporção de corante para detergente seja de 1: 4 (p / p).
    7. Carregue 30 e 120 μL das amostras nos poços do mini- ou maxi-gel, respectivamente. Use os 10 μL restantes de cada amostra para o gel SDS desnaturante para detectar VDAC como um controle de carga.
    8. Para preparar os marcadores de peso molecular, dissolva 1 frasco de uma mistura de calibração de alto peso molecular (veja a Tabela de Materiais para mais informações) em 60 μL de tampão de gel BN / CN e adicione 120 μL de H 2 0 e 20 μL de LIBRA. Carregue 15 μL por pista.
    9. Execute os géis conforme descrito na etapa 1.2.9.2.

2. Ensaios em gel para Cx-I e Cx-V

NOTA: Os ensaios são realizados a temperatura ambiente. Tire fotos, varredura ou imagens das bandas em desenvolvimento para obter documentação. (Importante) As proteínas não podem ser transferidas aiO membranas de nitrocelulose após completar um IGA.

  1. Ensaio Cx-I
    1. Preparação.
      1. Preparar um tampão de ensaio de Tris 5 mM em H 2 O, com um pH de 7,4; armazenar em temperatura ambiente.
      2. Dissolver 10 mg de NADH em 1 mL de tampão de ensaio. Armazenar em alíquotas de 100 μL a -20 ° C até o uso; Evite congelar e descongelar.
      3. Pesar 25 mg de Nitroblue tetrazolium em um microtube.
      4. Prepare o fixador diluindo 5 mL de ácido acético em 95 mL de H 2 O; armazenar em temperatura ambiente.
    2. Realizando o ensaio.
      1. Combine 10 mL de tampão de ensaio com 25 mg de Nitroblue tetrazolium (concentração final: 2,5 mg / mL) e 100 μL de 10 mg / mL de NADH (0,1 mg / mL). Adicione isso a todo o gel, uma pista ou uma área de interesse excisada de um gel de CN.
        NOTA: Isto pode ser feito em um recipiente de plástico ou vidro transparente. Observe que este ensaio não pode ser realizado após BN PAGE.
      2. Siga o desenvolvimento de bandas azuis após agitação suave (rocker) por> 3 min.
      3. Corrigir o gel em 10 a 20 mL de solução de ácido acético ou lavar em Tris 5 mM, pH 7,4 para parar a reação. Pegue fotografias para documentação (veja a Tabela de Materiais).
  2. Ensaio Cx-V
    NOTA: O ensaio Cx-V deve ser feito usando geles CN ou BN duplicados, onde um é incubado com 5 μg / mL de oligomicina (um inibidor de Cx-V) para demonstrar atividade independente de Cx-V.
    1. Preparação.
      1. Preparar um tampão de ensaio com Tris 35 mM e glicina 270 mM; Ajuste o pH para 8,3 à temperatura ambiente. Armazene o tampão congelado em alíquotas de 50 mL, mas verifique o pH após congelamento e descongelamento.
      2. Preparar MgSO4 1 M em H 2 O; Armazenar a 4 ° C até o uso.
      3. Pesar 27,28 mg de Pb (NO 3 ) 2 em um microtube.
      4. Pesar 60 mg de ATP em um microtube.
      5. Dissolver 1 mg de oLigomicina em 1 mL de etanol. Armazenar a -20 ° C até o uso.
      6. Prepare um fixador misturando 50 mL de metanol com 50 mL de H 2 O; armazenar em temperatura ambiente.
    2. Realizando o ensaio.
      1. Incube um gel, uma pista ou uma área de interesse de um gel BN ou CN durante 2 h com agitação suave (rocker) em 10-20 mL de tampão de ensaio ± 5 μg / mL de oligomicina (50-100 μL de 1 mg / ML em etanol) à temperatura ambiente.
      2. Após a incubação, substitua o tampão por 14 mL de tampão de ensaio fresco e adicione, por ordem, 190 μL de MgSO4 1 M (14 mM), 27,28 mg de Pb (NO3) 2 (5 mM), 60 mg de ATP ( 8 mM) e 75 μL de oligomicina (quando necessário).
      3. Incubar com agitação suave (rocker) e assistir a um precipitado branco, como bandas sobre géis tratados com oligomicina darão bandas não dependentes de Cx-V.
        NOTA: O aparecimento do precipitado pode levar várias horas.
      4. Corrigir o gel em metanol-Fixador baseado ( por exemplo, 50% de metanol), porque soluções ácidas dissolverão o precipitado de chumbo. Fotografe os resultados.
        NOTA: O precipitado de chumbo não interfere com a coloração de Coomassie dos géis.

3. Transferência de Proteína para Membranas de Nitrocelulose ou Difluoreto de Polivinilideno (PVDF)

  1. Prepare um tampão de transferência de Tris 25 mM e glicina 200 mM. Ajuste o pH para 8,3 e adicione 0,0005 g / L de SDS e 200 mL / L de metanol. Armazenar em temperatura ambiente.
    1. Corte uma membrana de nitrocelulose ou PVDF (tamanho de poro: 0,45 μm) com uma lâmina de barbear ou tesoura para um tamanho ligeiramente maior que o do gel.
      NOTA: As membranas de nitrocelulose permitem a coloração de Ponceau S para avaliar o carregamento de proteínas, enquanto as membranas de PVDF produzem bandas mais definidas.
  2. Protocolo.
    1. Mergulhe a membrana de nitrocelulose, o papel de filtro e as esponjas para umaPelo menos 10 min no buffer de transferência. Coloque a membrana PVDF em metanol a 100% durante 15 s ou de acordo com a recomendação do fabricante antes de colocá-la em buffer de transferência. Coloque a cassete aberta do kit de transferência em uma tigela plana com buffer de transferência.
    2. Coloque a esponja e 1-2 camadas de papel de filtro na parte de trás da cassete. Remova as bolhas.
    3. Coloque o gel no papel de filtro. Indique a orientação do gel cortando um canto do gel e / ou a membrana.
    4. Coloque a membrana sobre o gel. Remova todas as bolhas.
    5. Coloque papel de filtro e uma esponja na parte superior da membrana. Remova todas as bolhas neste sanduíche.
    6. Feche a cassete e coloque-a no suporte da cassete do kit de transferência.
    7. Transfira as proteínas a 25 V por cerca de 12-18 h.

4. Imunotransferência

  1. Preparação.
    1. Prepare uma Mancha de Ponceau (500 mL) adicionando 25 mLDe ácido acético e 0,5 g de Ponceau S a 475 mL de H 2 O; Armazenar à temperatura ambiente (pode ser reutilizado).
    2. Preparar solução salina tamponada com Tris (TBS) com 200 mM de NaCl, 25 mM de Tris-Base e 2,7 mM de KCl. Ajuste o pH para 8.0 e armazene à temperatura ambiente.
    3. Prepare o TBS-tween (TBST) adicionando 0,5 mL / L de Tween 20 ao TBS; armazenar em temperatura ambiente.
    4. Preparar sólidos de leite / TBST dissolvendo 5 g de sólidos de leite em 100 mL de TBST. Armazenar a 4 ° C e usar dentro de 3 dias.
    5. Preparar BSA / TBST dissolvendo 3 g de albumina de soro bovino (BSA, fração V) em 100 mL de TBST. Armazenar a 4 ° C e usar dentro de 3 dias.
  2. Protocolo.
    1. Quando a transferência for concluída, coloque a membrana na solução Ponceau S para visualizar todas as proteínas transferidas. Rotule a posição dos marcadores na membrana com um lápis e documente a membrana pintada com Ponceau-S por fotografia ou digitalização.
    2. Lave a membrana 3 vezes por 10 min cada wiTh TBS sob suave agitação.
    3. Bloqueie a membrana com sólidos de leite / TBST durante 1-2 h à temperatura ambiente ou durante a noite em uma sala fria com agitação suave.
    4. Lave a membrana por 10 min com TBST sob agitação suave.
    5. Incubar com anticorpo primário durante a noite na sala fria sob agitação suave. Diluir o anticorpo ( por exemplo, 1: 1000 para anti-ATP5A e -NDUFB6) em BSA / TBST.
      NOTA: A maioria dos anticorpos dá um sinal melhor nas membranas a partir de géis nativos quando incubados durante a noite.
    6. Lave a membrana por 10 min com TBST sob agitação suave.
    7. Incubar com anticorpo secundário durante pelo menos 60 minutos à temperatura ambiente sem agitação suave. Diluir o anticorpo (1: 5.000 a 1: 50.000) em sólidos de leite / TBST.
    8. Lave a membrana 3 vezes durante 10 minutos à temperatura ambiente com TBST com agitação suave.
    9. Durante a última lavagem, prepare o substrato de quimioluminiscência melhorada (ECL) de acordo com as instruções da manufaCturer.
    10. Incube a membrana com o substrato ECL usando as instruções fornecidas pelo fabricante.
    11. Detectar o sinal no filme usando as instruções fornecidas pelo fabricante do substrato ECL.

5. Electroeluição

  1. Preparação.
    1. Prepare um tampão de eluição de tricina 25 mM, imidazole 3,75 mM (pH 7,0 a 4 ° C) e ácido 6-aminohexanóico 5 mM.
      NOTA: Use luvas sempre que manipule o eletroeluter e tampas de membrana para evitar contaminação com proteínas externas.
  2. No dia anterior ao uso do eletroelutador para eletroeluição nativa, execute o seguinte:
    1. Mergulhe as tampas de membrana (corte: 3,5 kDa) em tampão de eluição durante 1 h a 60 ° C. Transfira as tampas para o tampão de eluição fresco e remova-os por 12 h ou mais no refrigerador.
      NOTA: Um peso molecular de corte de 3,5 kDa evita a perda de pequenas pRoteínas que podem facilmente dissociar-se do complexo proteico de interesse.
    2. Lave bem o módulo de eletroeluter, tubos de vidro, tanque e tampa com etanol. Enxaguar com água e deixar o equipamento secar.
  3. No dia da eletroeluição nativa, faça o seguinte.
    1. Coloque uma frita no fundo (fosco) de cada tubo de vidro a ser usado. Se necessário, coloque o tubo de vidro no tampão de eluição e empurre a frita do interior para o fundo do tubo.
    2. Empurre o tubo de vidro com a frita no módulo do eletroelutador. Molhe o grommet com tampão de eluição e deslize o tubo de vidro no lugar. Certifique-se de que a parte superior dos tubos de vidro seja uniforme com o grommet.
    3. Feche os grommets vazios com rolhas.
    4. Coloque uma tampa de membrana molhada na parte inferior do adaptador de silicone e encha o adaptador com tampão de eluição. Puxe lentamente o buffer no adaptador para cima e para baixo para remover as bolhas de ar ao redor da membrana de diálise.
    5. Deslize o adaptador cheio de buffer para a parte inferior do tubo de vidro. Remova todas as bolhas que aparecem na frita dentro do tubo de vidro.
    6. Encha cada tubo de vidro com tampão de eluição.
    7. Coloque as bandas excisadas da BN PAGE nos tubos de vidro (ver passo 1.2.9.3). Corte peças grandes em pedaços menores. Certifique-se de que a altura de preenchimento dentro do tubo de vidro seja de cerca de 1 cm.
    8. Coloque todo o módulo no tanque.
    9. Adicione cerca de 600 ml de tampão de eluição fria ao tanque. Certifique-se de que as tampas de adaptador de silício estejam no buffer para evitar bolhas na membrana de diálise.
    10. Coloque uma barra de agitação na parte inferior do tanque.
      NOTA: A agitação evitará que as bolhas se aderem ao fundo da membrana de diálise.
    11. Elute as proteínas por 4 h a 350 V em uma sala fria.
    12. Depois que a eluição for completada, remova o módulo eletroeluter do tanque tampão e coloque-o em uma pia ou tigela.
    13. Se uma rolha foi usada, remova-a para desenharNa câmara tampão superior. Caso contrário, use uma pipeta grande para remover o buffer.
    14. Remova o tampão de cada tubo de vidro e descarte. Certifique-se de que o adaptador de silicone permaneça no lugar e que o líquido abaixo da frita não seja perturbado ou abalado.
    15. Remova cuidadosamente o adaptador de silicone, juntamente com a tampa da membrana do fundo do tubo de vidro. Pipetar o conteúdo (cerca de 400 μL) da tampa de silicone em um microtube. Com outros 200 μL de tampão de eluição, enxágue a tampa de silicone e adicione ao microtube. Repita para todos os tubos de vidro.
    16. À medida que as tampas de membrana podem ser reutilizadas, preserve as tampas de membrana, colocando-as em tampão de eluição contendo 0,5 mg / mL de azida de sódio. Refrigere-os.
      NOTA: O eluato tem baixa concentração de proteína e pode ser concentrado usando dispositivos de filtro centrífugo.

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Resultados

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Para visualizar supercomplexos mitocondriais, foram usadas 17 , 18 mitocôndrias recentemente isoladas de camundongos. Os supercomplexos mitocondriais são sensíveis a ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, levando à sua desintegração, embora isso possa ser tolerável para alguns pesquisadores. Se o congelamento for necessário para o armazenamento, para garantir melhores resultados, as amostras não devem sofrer mais de ...

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Discussão

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Um ETC funcional é necessário para a geração de ATP mitocondrial. Os complexos do ETC são capazes de formar dois tipos de supercomplexos: os respirasomes (Cx-I, -III e -IV) 1 e os synthasomes (Cx-V) 2 . A montagem de cada complexo é necessária para um ETC intacto, enquanto a organização do ETC em supercomplexos é pensado para aumentar a eficiência geral ETC 5 , 22 . Como esses supercomplexos se mestam e desmontam n...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por bolsas do Afiliado do Fundador da American Heart Association [12GRNT12060233] e do Centro de Pesquisa de Crianças Fortes da Universidade de Rochester.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Câmara de mini-gel Protean IIBiorad1658004Conjunto completo para verter e correr a eletroforese em mini-gel
Maxi-gel Protean XLBiorad1653189Conjunto completo para verter e correr a eletroforese em maxi-gel
Criador de gradientes, Hoefer SG15VWR95044-704Despejar mini-gel
gradientes Gradiente maker, maxi-gelVWRGM-100Derramar maxi-gel gradientes
Kit de transferênciaBiorad1703930Conjunto completo para transferência úmida de proteínas para membranas
Electroeluter modelo 422Biorad1652976Electroeluição de proteínas de PÁGINAS nativas ou SDS Placas
vidroBiorad1653308Placas curtas
Placas de vidroBiorad1653312Placas espaçadoras
Placasde vidroBiorad1651823Placas internas
Placas de vidroBiorad1651824Placas externas
Fonte de alimentaçãoBiorad1645070Fonte de alimentação adequada para eletroforese nativa
ECL-Western Thermo Scientific32209Substrato de quimiomolumniscense
SuperSignal-West DuraThermo Scientific34075Substrato de quimolumniscense aprimorado
Filme/filme de autorradiografiaGE Health care28906845Documentação de Western blots Processador de
filme CP1000AgfaNC0872640
Canon Power Shot 640 CanonNATirar fotos para documentar géis, membranas e borrões.
Capuz de câmera Canon Power Shot 640 Câmera de blindagem Canon para fotos tiradas em uma mesa de luz
Desoxiquelato de sódioSigmaD66750Detergente
EDTASigmaE5134
SacaroseSigmaS9378
MOPSSigmaM1254Tampão
ImidazolSigmaI15513Tampão
Lauril maltosídeoSigmaD4641Detergente
Coomassie G250Biorad161-0406
Ácido aminohexanoicoSigmaO7260
Kit de peso molecular nativoGE Health care 17-0445-01Kit de calibração de alto peso molecular para eletroforese nativa.
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
NADHSigmaN4505
Nitroblue tetrazólioSigmaN6639
Tris HClSigmaT3253
ATP   SigmaA2383
< strong > Nome< / strong >< strong > Empresa < / strong >< strong > Número de catálogo< / strong >< strong > Comentários< / strong >
Nitrato de chumbo (II) (Pb (NO< sub> 3< / sub>) < sub > 2< / sub>):Sigma228621
OligomicinaSigmaO4876
< strong> NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ponceau SSigmaP3504
anti-ATP5AAbcamab14748anticorpo para ATP sintase subunidade ATP5A
anti-NDUFB6Abcamab110244anticorpo para Cx-1 subunidade NDUFB6
anti-VDACCalbiochem529534 anticorpo para anticorpo ligado a VDAC
ECL HRP GEHealth CareNA931Vanticorpo secundário para ATP5A, NDUFB6 e VDAC
Reagente de bloqueioBiorad170-6404
BSA
cloreto de sódioSigmaS9888
cloreto de potássioSigmaP9541
EGTASigmaE3889
NomeEmpresaNúmero de Catálogo<strong>Comentários
Kit de coloração de prataInvitrogenLC6070
de Acrilamida/bisacrilamida Biorad 1610148 solução pré-misturada a 40% Glicina Sigma G7403 SDS (dodecil sulfato de sódio)Invitrogen 15525-017 Tris-base Sigma T1503 Buffer Tricine Sigma T0377

Referências

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Mitochondrial SupercomplexesBlue Native PAGEImmunoblottingProtein Complex AssemblyMitochondrial BiologyMitochondrial Isolation

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