Artigo de método

A perfusão DiI como método de visualização vascular em Ambystoma mexicanum

DOI:

10.3791/55740

⸱

16 de junho de 2017

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1Department of Orthopedic Surgery, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital, 2Division of Graduate Medical Sciences, Boston University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Utilizando uma técnica de coloração de perclorato de diisoxifenil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina lipofílica (DiI) lipofílica, o Ambystoma mexicanum pode sofrer perfusão vascular para permitir uma fácil visualização da vasculatura.

Resumo

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As técnicas de perfusão têm sido utilizadas há séculos para visualizar a circulação de tecidos. Axolotl (Ambystoma mexicanum) é uma espécie de salamandra que emergiu como um modelo essencial para estudos de regeneração. Pouco se sabe sobre como a revascularização ocorre no contexto da regeneração nesses animais. Aqui, relatamos um método simples para a visualização da vasculatura no axolotl através da perfusão de perclorato de 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocyanina (DiI). DiI é um corante de carbocyanina lipofílico que se insere instantaneamente na membrana plasmática de células endoteliais. A perfusão é feita usando uma bomba peristáltica, de modo que a DiI entre na circulação através da aorta. Durante a perfusão, o corante flui através dos vasos sanguíneos do axolotl e incorpora na bicamada lipídica das células endoteliais vasculares após o contato. O procedimento de perfusão leva aproximadamente uma hora para um axolotl de oito polegadas. Imediatamente após a perfusãoDiI, o axolotl pode ser visualizado com um microscópio fluorescente confocal. O DiI emite luz no intervalo vermelho-laranja quando excitado com um filtro fluorescente verde. Este procedimento de perfusão DiI pode ser usado para visualizar a estrutura vascular de axolotls ou para demonstrar padrões de revascularização em tecidos regeneradores.

Introdução

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A visualização da vasculatura desempenha um papel vital na compreensão da estrutura e função dos organismos em muitas espécies. A partir do século 16 com Leonardo da Vinci, foram estudados modelos e representações gráficas da circulação 1 . Usando ceras e moldes de borracha, os tecidos foram perfundidos para criar modelos tridimensionais da vasculatura, o que permitiu o estudo de organogênese e patogênese 1 , 2 . As resinas e as ceras foram coloridas com corantes, tais como a tinta da Índia ou vermelho carmin para permitir a sua fácil visualização 1 <....

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Protocolo

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Toda experimentação axolotl foi realizada de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Brigham and Women's Hospital (BWH).

1. Configurar Experiência de Perfusão

  1. Coloque um axolotl adulto em um recipiente de plástico preenchido com 0,1% de solução de tricaína (MS222) por 15-20 min ou até completamente anestesiado. Certifique-se de que o recipiente esteja cheio de solução de tricaína suficiente, de modo que o axolotl esteja completamente submerso.
    Nota: Todos os procedimentos devem ser realizados de acordo com as diretrizes institucionais de cuidados com animais. Na BWH, um axolotl é considerado....

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Resultados

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Com a coloração DiI, a vasculatura do axolotl pode ser facilmente visualizada. Os vasos sanguíneos de animais perfundidos com o corante lipofílico são imediatamente visíveis sob um microscópio confocal fluorescente. A Figura 1 .1-1.5 é uma representação esquemática do protocolo de perfusão. Após a perfusão com o corante rosa brilhante, um axolotl perfundido com sucesso aparecerá rosa. Usando um filtro fluorescente verde em um microscópio con.......

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Discussão

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A visualização da vasculatura do axolotl pode ser realizada com sucesso através da perfusão com o corante de carbocyanina lipofílico, DiI. Neste estudo, descrevemos um novo protocolo para a perfusão do axolotl com DiI usando uma bomba peristáltica. Mostramos também a subsequente visualização da vasculatura axolotl utilizando um microscópio confocal fluorescente. Este protocolo foi uma adaptação do protocolo de perfusão Dii de roedores visto em Li et al. 7 , no entanto, as principais dife.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Brigham & Women's Hospital e March of Dimes. Os autores agradecem a todos os membros do Laboratório Whited por seu apoio e conselho.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bomba Peristáltica Marshall Scientific RD-RP1
Tubo de perfusãoExcelon Lab & Tubo de Vácuo436901705tamanho S1A
27g agulha borboletaEXELint Medical Products26709
NaClAmericanBio7647-14-5
KClAmericanBio7747-40-7
Na2HPO4 AmericanBio7558-79-4
NaH2PO4AmericanBio10049-21-5
destilada
HClAmericanBio7647-01-0
GlicoseThermoFischerA2494001
1,1′-Dioctadecil-3,3,3′,3′- perclorato de tetrametilindocarbocianinaSigma Aldrich468495
Etanol (100% vol/vol)Sigma Aldrich64-17-5
Antecedentes cirúrgicos Espuma deMDG0748741
emolduraqualquer quadrado de espuma de poliestireno com um recorte em forma de axolote
Tesoura cirúrgicaMedlineDYND04025
BisturiMedlineMDS15210
AbsorventeUnderpad Avacare MedicalPKUFSx
Toalhas de
Pipeta de transferência descartável padrãoFisherbrand50216954
Suporte de braçadeiraAdafruit291
Etil 3-aminobenzoato metanossulfonatoSigma AldrichE10521Tricaine pó
Axolote
MgSO4AmericanBio10034-99-8
CaCl2Sigma AldrichC1016-100G
NaHCO3Sigma AldrichS5761-500G
TanquesTamanho variável apropriado para o axolote
ParaformaldeídoSigma Aldrich30525-89-4
Axolotl
Leica Microscópio LeicaM165 FC
ET-CY3 Filtro FluorescenteLeicaM205FA/M165FC
MS-222
Água poliestireno Medline;papeladulto de plástico

Referências

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  1. Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
  2. Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R.

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Reimpressões e permissões

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Etiquetas

Vasculatura de AxoloteBomba Perist lticaMicroscopia ConfocalCanula o A rticaCorante FluorescenteColora o EndotelialPerfus o TecidualEstudos de Regenera o

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