Preparação de Vesículas de Membranas Plasmáticas de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea para Terapia Potencial de Substituição de Citoplasma

Resumo

As doenças relacionadas à idade estão associadas a múltiplos defeitos nos componentes do citoplasma. Aqui, apresentamos um protocolo para preparar vesículas de membranas plasmáticas de células estaminais mesenquimais de medula óssea. Esta técnica poderia potencialmente ser utilizada como um meio de terapia de substituição do citoplasma para melhorar ou mesmo reverter fenotipos associados à idade.

Resumo

Nós já relatamos sobre a geração de vesículas de membrana plasmática (PMVs) através da extrusão mecânica de células de mamíferos. A fusão de PMVs com células RhoO deficientes mitocondriais restaurou a actividade mitótica em condições de cultura normais. A aterosclerose, diabetes tipo 2, doença de Alzheimer e cancro são doenças relacionadas com a idade que foram relatadas como estando associadas a múltiplos defeitos mecânicos e funcionais no citosol e organelas de uma variedade de tipos de células. As células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs) representam uma população única de células da medula óssea que possuem capacidades de auto-renovação, mantendo a sua multipotência. A suplementação de células de senescência com citoplasma jovem a partir de BMSCs autólogas através da fusão de PMVs proporciona uma abordagem promissora para melhorar ou mesmo reverter fenotipos associados à idade. Este protocolo descreve como preparar PMVs de BMSCs através de extrusão através de uma membrana de policarbonato com 3Determinam a existência de mitocôndrias e examinam a manutenção do potencial de membrana dentro de PMVs usando um microscópio confocal, concentram PMVs por centrifugação e realizam a injeção in vivo de PMVs no músculo gastrocnêmio de camundongos.

Introdução

Uma enorme quantidade de esforço tem sido dedicada ao estabelecimento de abordagens para genes, enzimas e terapias de reposição celular. Isto resultou em grandes avanços e mesmo aplicações clínicas ^{1 , 2 , 3} . Recentemente, uma polêmica mitocôndria substituição terapia baseada em tecnologia de transferência de núcleo foi aplicado à fertilização in vitro para mulheres de idade avançada ou portador de uma mitocondrial letal DNA mutação [ ^4] . Defeitos encontrados em doenças relacionadas à idade, incluindo aterosclerose, diabetes tipo 2, d....

Protocolo

Foram adquiridos ratinhos BALB / c com 8 a 12 semanas de idade de Xangai Experimental Animal Center (Xangai, China) e criados numa instalação animal específica isenta de agentes patogénicos e com ar condicionado. O cuidado animal e os procedimentos experimentais estavam em conformidade com as diretrizes para o uso e cuidado de animais de laboratório estabelecidos pela Universidade de Shantou.

1. Montagem do Aparelho

1. Para garantir a esterilidade, ligue a luz UV de um capuz de cultura de tecidos durante 30 min antes de usar.
2. Desparafuse uma unidade de filtro descartável de 25 mm e mergulhe a tampa eo fundo da unidade em....

Resultados

A chave para uma preparação bem-sucedida de PMVs depende muito da montagem correta da unidade de filtro ( Figura 1 ), que pode ser testada empurrando 1 mL de PBS através da membrana. Se ocorrer vazamento, volte a montar a unidade de filtro e teste novamente. No entanto, a fuga só pode ser testada de forma fiável quando as células são empurradas através da membrana. Se somente alguns PMVs forem detectados sob um microscópio regular usando o objetivo 10X, ou se o tamanho d.......

Discussão

A terapia de reposição citoplasmática, conforme proposta neste manuscrito, tem vantagens únicas sobre outras abordagens relatadas, como terapia genética, molecular e celular. Os PMVs gerados a partir de BMSCs encapsulam não apenas os produtos dos genes de stemness, mas também organelas celulares intactas, que são essenciais para remediar os fenótipos de envelhecimento associados à senescência. Quando o citoplasma jovem é entregue às células senescentes, os mecanismos de mau funcionamento podem obter um breve alívio; Ao m.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Membranas IsoporeTM	Millipore	TSTP04700	3 mm de poro
Unidade de filtro descartável	Xinya, Xangai, China	25 mm	Seringa de insulina de polipropileno de grau médico
	BD	328446	1 mL
pN1-EGFP	Clontech	6085-1
MitoTracker	Sondas Moleculares	M7514	Verde FM, 1 μ M
JC-1	Beyotime, Haimen, China	C2006	10 mg/mL
CM-DiI	Beyotime, Haimen, China	C1036	10 mM
PEI	Sigma	P3143	Mn = 75.000
Microscópio de fluorescência	Nikon	Eclipse TE 2000	com câmera CCD
Microscópio Confocol	Carl Zeiss	LSM 510 Meta
PolyJet	SigaGen	SL100688	para transfecção celular