Relatamos dois protocolos de sincronização de células que fornecem um contexto para estudar eventos relacionados a fases específicas do ciclo celular. Mostramos que essa abordagem é útil para analisar a regulação de genes específicos em um ciclo celular não perturbado ou após a exposição a agentes que afetam o ciclo celular.
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Artigo de método
Estudando a expressão de genes regulada pelo ciclo celular por dois protocolos complementares de sincronização de células
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O programa de expressão gênica do ciclo celular representa um passo crítico para a compreensão dos processos dependentes do ciclo celular e seu papel em doenças como o câncer. A análise de expressão de genes regulada pelo ciclo celular depende da sincronização celular em fases específicas. Aqui descrevemos um método que utiliza dois protocolos de sincronização complementares que é comumente usado para estudar a variação periódica da expressão gênica durante o ciclo celular. Ambos os procedimentos são baseados no bloqueio transitório do ciclo celular em um ponto definido. O protocolo de sincronização pelo tratamento com hidroxiureia (HU) leva à prisão celular na fase final G1 / início da S e a liberação da prisão mediada por HU fornece uma população celular progredindo uniformemente através de S e G2 / M. O protocolo de sincronização pelo tratamento com timidina e nocodazol (Thy-Noc) bloqueia as células na mitosis precoce e a liberação da prisão mediada por Thy-Noc fornece uma população celular sincronizada adequada para a fase G1 e a fase S-enTente estudos. A aplicação de ambos os procedimentos requer o monitoramento dos perfis de distribuição do ciclo celular, que normalmente é realizado após a coloração do iodeto de propídio (PI) das células e a análise mediada por citometria de fluxo do conteúdo de DNA. Mostramos que o uso combinado de dois protocolos de sincronização é uma abordagem robusta para determinar claramente os perfis transcricionais de genes que são diferencialmente regulados no ciclo celular ( ie E2F1 e E2F7) e, conseqüentemente, ter uma melhor compreensão de seu papel no ciclo celular Processos. Além disso, mostramos que essa abordagem é útil para o estudo de mecanismos subjacentes a terapias baseadas em drogas ( ou seja, mitomicina C, um agente anticancerígeno), porque permite discriminar genes que respondem ao agente genotóxico daqueles que são exclusivamente afetados por perturbações do ciclo celular Imposto pelo agente.
Introdução
A transição através de todas as fases do ciclo celular é acoplada a um programa de expressão de genes bem regulado. Este coordenado "ligado e desligado" da transcrição de genes ao longo do ciclo celular acredita estar sob o controle de sistemas regulatórios transcricionais complexos, regulando não apenas o tempo, mas também os níveis de expressão gênica. É sabido que a desregulamentação dos principais componentes do ciclo celular contribui para o desenvolvimento de várias doenças e é uma marca bem estabelecida da tumorigênese 1 , 2 . As análises transcriptômicas do genoma realizadas em células de leveduras e ....
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Protocolo
1. Sincronização, liberação e monitoramento celular da progressão do ciclo celular
- Timidina e nocodazol (Thy-Noc) sincronização e liberação de células U2OS da mitose
- Prepare o meio de cultura celular necessário. As células U2OS são cultivadas rotineiramente em meio DMEM-Glutamina complementado com 10% (vol / vol) de FBS (opcional: 1% de penicilina / estreptomicina). Execute toda a preparação e manipulação do meio em condições estéreis e aquecer o meio complementado (a partir de agora referido como "meio completo") a 37 ° C antes de usar.
- Semente 2 x 10 6 células U2OS por placa de 100 mm em 10 mL de meio de cul....
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Resultados
Representação esquemática dos protocolos Thy-Noc e HU para sincronização celular.
A Figura 1 resume as etapas necessárias para a sincronização de células U2OS e posterior coleta de amostras, a fim de verificar a progressão através do ciclo celular e realizar análises de expressão gênica.
A coloração de Phospho-H3 e PI são bons parâmetros de avaliação para.......
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Discussão
A análise de genes regulados por ajuste fino envolvidos em papéis temporários e temporários no ciclo celular requer uma população celular uniforme. Muitos pesquisadores usam rotineiramente linhas de células tumorais estabelecidas há muito tempo para esses propósitos e uma variedade de métodos foram desenvolvidos para obter populações celulares síncronas (ou parcialmente síncronas), com o objetivo de acumular o maior número possível de células em fases definidas do ciclo celular. Além disso, esforços intensos foram reali.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros dos laboratórios Zubiaga e Altmeyer por discussões úteis e suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por doações do Ministério espanhol (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), do governo basco (IT634-13 e KK-2015/89) e da Universidade do País Basco UPV / EHU ( UFI11 / 20).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM, glicose alta, suplemento GutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 61965-059 | |
| FBS, qualificado, aprovado pela UE, origem da América do Sul | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 0,25% Tripsina-EDTA (1x), vermelho de fenol | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| Timidina | SIGMA | T1895-5G | Recém-preparado. Um leve aquecimento pode ajudar a dissolver a timidina. |
| Nocodazol | SIGMA | M-1404 Solução-mãe | em DMSO armazenado a -20 º C em pequenas alíquotas |
| Hidroxiureia | SIGMA | H8627 | Mitomicina C recém-preparada |
| de Streptomyces caespitosus | SIGMA | M4287 | 1,5 mM solução estoque em H2O estéril protegida da luz e armazenada a 4 &�; C |
| Dimetilsulfóxido | SIGMA | D2650 | |
| Iodeto de propídio | SIGMA | P4170 | Solução-mãe em PBS estéril a 5 mg/ml, conservada a 4 "m; C protegido da luz. |
| PBS pH 7,6 | Etanol caseiro | ||
| PANREAC | A3678,2500 | ||
| Clorofórmio | SIGMA | C2432 | |
| Citrato de sódio | PANREAC | 131655 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| RNAse A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| TRIzol Reagente | LifeTechnologies | 15596018 | |
| RNeasy Mini kit | QIAGEN | 74106 | |
| Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Anti-Ciclina E1 anticorpo | Sinalização celular | 4129 | Diluição 1:1000 em 5% de leite, o/n, 4 º C |
| Anti-Ciclina B1 anticorpo | Sinalização celular | 4135 | Diluição de 1:1000 em 5% de leite, o/n, 4 & C |
| Anti-β-actina | SIGMA | A-5441 | diluição 1:3000 em leite a 5%, 1 hora, RT |
| Anti-pH3 (Ser 10) antiboty | Millipore | 06-570 | Especificado no protocolo |
| Anticorpo secundário anti-coelho AlexaFluor 488 | Invitrogen | R37116 | Especificado no protocolo |
| Anticorpo secundário anti-camundongo-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-3697 | Diluição 1:3000 em 5% de leite, 1 hora, anticorpo RT |
| Forward E2F1 (humano) TGACATCACCAACGTCCTTGA | Biolegio | Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Anticorpo E2F1 reverso (humano) CTGTGCGAGGTCCTGGGTC | Biolegio | Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Anticorpo Forward E2F7 (humano) GGAAAGGCAACAGCAAACTCT | Biolegio | Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Anticorpo E2F7 reverso (humano) TGGGAGAGCACCAAGAGAGAGA | Biolegio | Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward p21Cip1 antibody (humano) AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC | Biolegio | Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse p21Cip1 antibody (humano) TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG | Biolegio | Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Gene de referência do anticorpo TBP (humano) | Biolegio | Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Anticorpo TBP reverso (humano) | Biolegio | Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Gene de referência do anticorpo Oxa1L (humano) Forward CACTTGCCAGAGATCCAGAAG | Biolegio | Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse Oxa1L anticorpo (humano) CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG | Biolegio | Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Power SYBRGreen PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4368702 | |
| Tubos FACS | poços Sarstedt | 551578 | |
| MicroAmp | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Plate | Corning Corning | ||
| Costar placas de cultura de células 6 poços | Corning | 3506 | |
| Microcentrífuga refrigerada de bancada | Eppendorf | 5415 R | |
| Centrífuga de bancada refrigerada Jouan CR3.12 | Jouan | 743205604 | |
| NanoDrop Lite Espectrofotômetro | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| BD FACSCalibur Citômetro de fluxo | BD Bioscience | ||
| QuantStudio 3 Sistema de PCR em tempo real | Thermo Fisher Scientific | A28567 |
Referências
- Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
- Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
- Cho, ....
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Reimpressões e permissões
