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Summary

Relatamos dois protocolos de sincronização de células que fornecem um contexto para estudar eventos relacionados a fases específicas do ciclo celular. Mostramos que essa abordagem é útil para analisar a regulação de genes específicos em um ciclo celular não perturbado ou após a exposição a agentes que afetam o ciclo celular.

Abstract

O programa de expressão gênica do ciclo celular representa um passo crítico para a compreensão dos processos dependentes do ciclo celular e seu papel em doenças como o câncer. A análise de expressão de genes regulada pelo ciclo celular depende da sincronização celular em fases específicas. Aqui descrevemos um método que utiliza dois protocolos de sincronização complementares que é comumente usado para estudar a variação periódica da expressão gênica durante o ciclo celular. Ambos os procedimentos são baseados no bloqueio transitório do ciclo celular em um ponto definido. O protocolo de sincronização pelo tratamento com hidroxiureia (HU) leva à prisão celular na fase final G1 / início da S e a liberação da prisão mediada por HU fornece uma população celular progredindo uniformemente através de S e G2 / M. O protocolo de sincronização pelo tratamento com timidina e nocodazol (Thy-Noc) bloqueia as células na mitosis precoce e a liberação da prisão mediada por Thy-Noc fornece uma população celular sincronizada adequada para a fase G1 e a fase S-enTente estudos. A aplicação de ambos os procedimentos requer o monitoramento dos perfis de distribuição do ciclo celular, que normalmente é realizado após a coloração do iodeto de propídio (PI) das células e a análise mediada por citometria de fluxo do conteúdo de DNA. Mostramos que o uso combinado de dois protocolos de sincronização é uma abordagem robusta para determinar claramente os perfis transcricionais de genes que são diferencialmente regulados no ciclo celular ( ie E2F1 e E2F7) e, conseqüentemente, ter uma melhor compreensão de seu papel no ciclo celular Processos. Além disso, mostramos que essa abordagem é útil para o estudo de mecanismos subjacentes a terapias baseadas em drogas ( ou seja, mitomicina C, um agente anticancerígeno), porque permite discriminar genes que respondem ao agente genotóxico daqueles que são exclusivamente afetados por perturbações do ciclo celular Imposto pelo agente.

Introduction

A transição através de todas as fases do ciclo celular é acoplada a um programa de expressão de genes bem regulado. Este coordenado "ligado e desligado" da transcrição de genes ao longo do ciclo celular acredita estar sob o controle de sistemas regulatórios transcricionais complexos, regulando não apenas o tempo, mas também os níveis de expressão gênica. É sabido que a desregulamentação dos principais componentes do ciclo celular contribui para o desenvolvimento de várias doenças e é uma marca bem estabelecida da tumorigênese ^{1 , 2} . As análises transcriptômicas do genoma realizadas em células de leveduras e mamíferos revelaram que um grande número de genes exibem padrões periódicos de expressão gênica no ciclo celular, sugerindo que a flutuação da transcrição durante o ciclo celular é um reflexo do requisito temporal de um determinado produto de gene Em uma fase precisa ^{3 , 4 ,} </suP> ⁵ .

Uma tarefa importante no estudo da expressão de genes regulados pelo ciclo celular é a sincronização de células em fases específicas do ciclo celular. A sincronização celular ajuda a interpretar a associação de um padrão de expressão genética a uma transição de fase específica do ciclo celular e levou a uma melhor compreensão da regulação e função de vários genes. A sincronização celular também é importante para estudar o mecanismo de ação de fármacos anticancerígenos, já que os agentes quimioterapêuticos afetam tanto a expressão gênica como a cinética do ciclo celular ^{6 , 7} . No entanto, muitas vezes é difícil determinar se as diferenças de expressão gênica resultantes do tratamento com esses agentes são uma resposta direta ao tratamento ou são apenas a conseqüência de mudanças nos perfis do ciclo celular. Para distinguir entre essas possibilidades, a expressão gênica deve ser analisada em células que foram sE sincronizado antes da adição do medicamento quimioterapêutico.

Com a exceção de algumas células primárias, como células linfóides recém-isoladas – que constituem uma população de células homogêneas sincronizadas em G0 ⁸ -, as linhas celulares estabelecidas in vitro crescem de forma assíncrona em cultura. Sob condições de crescimento regulares, essas células de ciclagem assíncrona são encontradas em todas as fases do ciclo celular, mas preferencialmente em G1 ⁹ . Portanto, esse contexto não fornece um cenário ótimo para análises de expressão funcional ou genética em uma fase específica do ciclo celular ( por exemplo , G1, S, etc.). As linhas celulares imortalizadas não transformadas ( por exemplo, fibroblastos) podem ser sincronizadas com os chamados métodos fisiológicos ¹⁰ . Esses métodos são baseados nos recursos de células primárias retidos das células não transformadas, como a inibição do contato celular e a dependência do fator de crescimento para continuar a andar de bicicleta. RemoçãoDe soro em combinação com inibição de contato torna as células não transformadas presas em G0 / G1. No entanto, a entrada e progressão sincronizada do ciclo celular muitas vezes requer subcultura, o que também envolve o desprendimento artificial das células e re-chapeamento ¹⁰ . Mais importante ainda, este método não é adequado para a sincronização de linhas celulares transformadas, a grande maioria das linhas celulares estabelecidas atualmente em uso, caracterizada por falta de inibição do crescimento mediada por contato celular ou resposta à retirada do fator de crescimento. Assim, é claro que são necessários métodos alternativos para a sincronização celular eficiente em fases específicas do ciclo celular. Em termos gerais, os métodos de sincronização mais utilizados são baseados em inibição química ou farmacológica transitória de um ponto definido do ciclo celular, tipicamente síntese de DNA ou formação de fuso mitótico. A inibição da síntese do DNA sincroniza as células prendendo-as no final da fase G1 ou inicial S. Isso pode ser achiEvitado pela adição de compostos como a mimosina, um inibidor da biossíntese de nucleótidos ^{11 , 12} , a afidicolina, um inibidor das polimerases de ADN ^{13 , 14} , a hidroxiureia, um inibidor da ribonucleótido redutase ^{15 , 16} ou por quantidades excessivas de timidina ^{17 , 18} . Por outro lado, os inibidores da polimerização de microtúbulos, como a colchicina ou o nocodazol, são capazes de bloquear a formação de fuso mitótico, levando à sincronização celular no início da fase M ^{19 , 20 , 21} .

Neste trabalho descrevemos um método envolvendo dois protocolos de sincronização complementares baseados na inibição química transitória para estudar a expressão de genes regulados pelo ciclo celular no mRNAnível. Este método é fundamental para definir o papel dos genes do ciclo celular em processos específicos do ciclo celular. Além disso, fornece um quadro geral para estudar o impacto de tratamentos anticancerígenos, a fim de detectar com precisão os genes sensíveis a drogas e minimizar as interpretações erradas derivadas de perturbações na progressão do ciclo celular gerada por esses medicamentos.

Protocol

1. Sincronização, liberação e monitoramento celular da progressão do ciclo celular Timidina e nocodazol (Thy-Noc) sincronização e liberação de células U2OS da mitose Prepare o meio de cultura celular necessário. As células U2OS são cultivadas rotineiramente em meio DMEM-Glutamina complementado com 10% (vol / vol) de FBS (opcional: 1% de penicilina / estreptomicina). Execute toda a preparação e manipulação do meio em condições estéreis e aquecer o meio complementado (a partir de agora referido como "meio completo") a 37 ° C antes de usar. Semente 2 x 10 6 células U2OS por placa de 100 mm em 10 mL de meio de cultura completo. Para calcular o número de pratos necessários, tenha em conta que cada prato de 100 mm geralmente fornece células mitóticas suficientes para re-colocar aproximadamente 5 poços de uma placa de 6 poços (0,2-0,25 x 10 6 células / poço) (ver Figura 1B ). Dois poços por ponto de tempo selecionado são requeridosEd no experimento (1 poço para extração de RNA e 1 poço para monitorização do ciclo celular). Além disso, um terceiro poço pode ser coletado por ponto de tempo para análise de proteínas. NOTA: células de placa à noite (cerca de 7 da noite) para que as etapas subsequentes possam ser realizadas durante o horário de trabalho nos dias seguintes. Inclua 2 poços adicionais de células de crescimento assíncrono para definir as configurações de compensação de análise FACS. Deixe as células se juntarem incubando pratos de 100 mm a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 durante 24 h. Para o bloqueio de timidina, preparar uma solução de reserva de timidina 200 mM dissolvendo 145,2 mg de pó de timidina em 3 mL de H 2 O (ou quantidades equivalentes) e esterilizar a solução por filtração através de um filtro de tamanho de poro de 0,2 μm. Um leve aquecimento pode ajudar a dissolver a timidina. Adicione 100 μL do estoque 200 mM recentemente preparado a cada prato de cultura de 100 mm (concentração final de 2 mM). Incubar células com timidina durante 20 h a 37ºC76; C em uma atmosfera humidificada com 5% de CO 2 . NOTA: Tratar celas à noite (cerca de 7 horas), ter tempo para realizar a liberação de timidina e nocodazol no dia seguinte. Para libertar do bloqueio de timidina, remova o meio de crescimento contendo timidina na tarde do dia seguinte (3 horas); Lavar as células duas vezes com 1x PBS pré-aquecido e adicionar 10 mL de meio completo a cada prato de 100 mm. Incubar células durante 5 h a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 . Para a prisão de células mitóticas, adicione nocodazol a uma concentração final de 50 ng / mL (8 horas). Prepare uma solução de reserva dissolvendo o pó de nocodazol em DMSO ( por exemplo, 5 mg / mL) e armazene congelado a -20 ° C. Incubar células com nocodazol por não mais de 10 a 11 h a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 . Liberação da prisão mediada por nocodazol na fase M inicial (mitotic shake-off) e coleta de amostras em várias vezes poiNts (a partir das 6-7 da manhã). Descarte as células arredondadas (mitóticas) agitando cada placa e pipetando suavemente o meio de crescimento contendo nocodazol. Colete o meio com células separadas de cada placa de 100 mm em tubos estéreis de 50 mL, centrifugue (300 xg, 5 min, temperatura ambiente (RT)) e lave duas vezes por adição de 1x PBS seguido por centrifugação. O uso de PBS frio ou PBS plus nocodazole é recomendado para evitar deslizamento mitótico (ver seção de Discussão). Ressuspender as células mitóticas recolhidas de cada placa de 100 mm em 10 mL de meio completo. Economize 2 mL para extração de RNA e 2 mL para análise FACS para o ponto de tempo de 0 h (aproximadamente 0,2-0,25 x 10 6 células por amostra). Replaca as células mitóticas restantes para pontos de tempo subsequentes em placas de 6 poços (2 mL / poço, 0,2-0,25 x 10 6 células / poço). NOTA: Lembre-se de que são necessários 2 poços por ponto de tempo selecionado (1 para RNA e 1 para análise FACS). Coletar amostras no selPontos de tempo. Todas as 1,5 a 3 h são recomendadas para obter um perfil adequado da progressão do ciclo celular. Para extração de RNA, remova o meio, enxague bem com 2 mL de pré-aquecimento 1x PBS e adicione 1 mL de reagente de isolamento de RNA adequado ( por exemplo, TRIzol) no poço (execute este último passo em um gabinete de segurança para produtos químicos). Pipetar para cima e para baixo para separar e lisar células, transferir lisado celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, incubar 5 min na RT e armazenar o tubo a -80 ° C até o uso posterior. Para a análise FACS, enxágue bem com 2 mL de pré-aquecimento 1x PBS, adicione solução de tripsina-EDTA pré-aquecida (0,3 mL / poço) para separar as células, bloqueie a tripsina-EDTA adicionando 1 mL de meio completo e colete cada amostra separadamente Tubo de 15 mL. Células de centrifugação (300 xg, 5 min, RT), salve o sedimento celular e descarta o sobrenadante. A fim de consertar células, ressuspenda as células em 1 mL de etanol refrigerado a 70% (v / v) em 1x PBS por tubos suavemente vórtex e coloque-os no gelo para o aplicativoCerca de 15 min antes de armazenar a 4 ° C ou a coloração para posterior análise por FACS (descrito nos passos 1.4 – 1.5). Sincronização baseada em HU e liberação de células U2OS do limite G1 / S Prepare o meio completo de cultura de células como descrito no passo 1.1. Semente 0,25 x 10 6 células U2OS por poço em placas de 6 poços (2 mL de meio de cultura completo por poço). Para calcular o número de poços necessários para o experimento, tenha em conta que serão necessários 2 poços por ponto de tempo selecionado (1 poço para extração de RNA e 1 poço para monitoração do ciclo celular) e que 2 poços adicionais de células de crescimento assíncrono são Precisava definir as configurações de compensação de análise FACS. As células se ligam por incubação de placas de 6 poços durante a noite (O / N) a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 . Remova o meio completo dos poços na manhã seguinte e adicione 2 mLDe meio DMEM-Glutamina pré-aquecido sem FBS por poço. Incubar células durante mais 24 h a 37 ° C em uma atmosfera humidificada com 5% de CO 2 . NOTA: Execute esta etapa em todos os poços, exceto para 2 (aqueles salvos para definir configurações FACS). O passo de retirada de soro pode ser omitido se a sincronização eficiente for conseguida simplesmente incubando células com HU. Parada do ciclo celular G1 / S com HU. Prepare uma solução de reserva fresca de HU (500 mM) antes de cada uso. Adicione 2 mL de H 2 O a 76,06 mg de pó de HU e misture até dissolver completamente. Esterilize a solução por filtração através de um filtro de tamanho de poro de 0,2 μm. Misture 50 mL de meio completo com 400 μL de solução de reserva de HU esterilizada por filtro para uma concentração final de HU de 4 mM. Remova o meio de todos os poços, exceto dos 2 poços necessários para a definição das configurações de FACS e substitua-os por um meio completo contendo 2 mM de HU preparado recentemente (2 mL / poço). Incube células por 24 h emMeio contendo HU a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 . Liberação de células da prisão mediada por HU. Remova o meio contendo HU dos poços e enxágue os poços duas vezes com 1x PBS pré-aquecido (2 mL a cada vez). Adicione 2 mL de meio completo por poço. Coletar 2 amostras para o ponto de tempo de 0 h (1 para extração de RNA e 1 para verificação de parada de ciclo celular por FACS), bem como 2 amostras salvas para configurações de FACS. Coloque os poços remanescentes na incubadora. Coletar amostras a cada 1,5 a 3 h para obter uma distribuição adequada da progressão do ciclo celular. Em cada ponto de tempo, execute um processamento de amostra (para extração de RNA e análise FACS) conforme descrito em 1.1.8.1-1.1.8.2. Tratamento com agentes prejudiciais ao DNA NOTA: Sempre que o objetivo é elucidar o efeito de um composto ( por exemplo , agentes prejudiciais ao DNA) nos eventos do ciclo celular, qualquer um dos métodos de sincronização descritos anteriormente pode serCombinado com o tratamento de células com o agente genotóxico. Para selecionar o método de sincronização, é importante considerar a fase do ciclo celular que gostaríamos de analisar. Em geral, o procedimento de Thy-Noc pode ser adequado para estudar o efeito de um composto em fase G1 ou entrada de fase S, enquanto a sincronização mediada por HU pode ser mais adequada para estudar o impacto nas fases S a G2 ou na entrada na mitose. Análise do efeito de agentes genotóxicos na fase G1 ou na entrada da fase S Sincronize células como descrito em 1.1.2. Para 1.1.6. Libere as células do nocodazol e re-placa-as como descrito em 1.1.7. Incubar a 37 ° C em uma atmosfera humidificada com 5% de CO 2 por 3 h para permitir que eles se apeguem antes do agente de adição (o período de incubação requerido pode variar de acordo com a linha celular). Adicione agente e colete amostras como descrito anteriormente em 1.1.8. Análise do efeito de agentes genotóxicos em SG2 fases ou M entrada Sincronize as células conforme descrito em 1.2.2. Para 1.2.5. Libere células da HU conforme descrito em 1.2.6. E adicione imediatamente agente. Coletar amostras como descrito anteriormente em 1.8. Monitoramento da sincronização celular e progressão através do ciclo celular por coloração com iodeto de propídio (PI) e análise FACS NOTA: As amostras coletadas em todos os pontos de tempo juntamente com as necessárias para definir as configurações FACS podem ser armazenadas a 4 ° C uma vez que foram corrigidas (conforme mencionado em 1.1.8.2). Execute manchas com solução PI seguida de análise FACS para todas as amostras da experiência simultaneamente. O PI intercala no sulco principal do DNA de cadeia dupla produzindo um sinal altamente fluorescente quando excitado a 535 nm com um amplo pico de emissão em torno de 600 nm. Como o PI também pode se ligar ao ARN de cadeia dupla, é necessário tratar as células com RNase para uma resolução de DNA ideal. Prepare uma solução de coloração com fraco fraco. Uma solução de reserva de PI pode ser preparada por dissolução de pó PI em PBS ( por exemplo, 5 mg / mL). Armazene a solução de reserva a 4 ° C (na escuridão). A solução de coloração é composta por PI (140 μM), citrato de sódio (38 mM) e Triton X-100 (0,01% v / v). Aquecer uma superfície apropriada ( por exemplo, forno) a 37 ° C. Centrifugar células fixas (450 xg, 5 min, RT), decantar o sobrenadante (etanol) e lavar uma vez com 1x PBS. Centrifugar as células novamente, remover PBS e adicionar 300 μL de solução de coloração PI por amostra (exceto para uma das amostras para configurações FACS, adicionar PBS a esta amostra). Transferir células para Tubos FACS (5 mL de tubos de poliestireno de fundo redondo). Adicione 1 μL de RNase A a cada amostra, misture e incuba as amostras durante 30 min na escuridão a 37 ° C. As amostras podem ser armazenadas protegidas da luz a 4 ° C por um período máximo de 2 a 3 dias. Analisar o conteúdo de DNA em amostras por fluxoCitometria. Defina as configurações de compensação de análise FACS com amostra assíncrona manchada com PI. Use amostra em branco (sem solução de coloração PI) para verificar a autofluorescência. Os conceitos básicos da análise mediada por picoterapia de DNA do conteúdo de DNA por citometria de fluxo foram descritos anteriormente 9 . Determinação do índice mitótico por coloração fosfo-H3 (Ser 10) / PI NOTA: As células que sofrem mitosis podem ser facilmente detectadas por citometria de fluxo com anticorpos específicos para fosfo-histona H3 em Serina 10 (pH3). Uma coloração concomitante de PI é útil para determinar a distribuição baseada em conteúdo de DNA da população de células. São necessárias 5 amostras para as configurações ótimas das configurações de FACS: em branco, somente para PI, apenas para pH3, anticorpo secundário e colorações duplas. Centrifugar células fixas (450 xg, 5 min, 4 ° C) e descartar o sobrenadante. As seguintes etapas são descritas para realizar a coloração em tubos de 15 mL. Lavar as células adicionando 1ML de PBS-T (PBS + 0,05% de Tween-20) ao sedimento e centrífuga (450 xg, 5 min, 4 ° C). Retire o sobrenadante. Adicionar anticorpo anti-pH3 diluído (1: 500) em 100-200 μL de PBS-T + 3% BSA e incubar com balanço durante 2 h à TA (ou O / N a 4 ° C). Adicione 2 mL de PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) e centrifugação (450 xg, 5 min, 4 ° C). Retire o sobrenadante. Lave mais uma vez adicionando 2 mL de PBS-T ao sedimento, centrifugando e descarte o sobrenadante. Adicionar anticorpo secundário (AlexaFluor 488 anti-coelho no caso do anticorpo pH3 selecionado) diluído (1: 500) em 100-200 μL de PBS-T + 3% de BSA e incubar com balanço durante 1 h à TA (ou O / N A 4 ° C). Proteja as amostras da luz. Lavar duas vezes com PBS-T (2 mL) por centrifugação como descrito no passo 1.5.4. Execute a coloração PI como descrito (passos 1.4.1 a 1.4.6). 2. Recolha e Processo de Amostras para Análise de Expressão Genética Levar1,5 mL de amostras de microcentrífuga no reagente de isolamento de ARN do congelador e deixá-los descongelar à temperatura ambiente dentro de um armário de segurança para produtos químicos. Adicione 400 μL de clorofórmio a cada amostra e agite vigorosamente (mas não vortex) até completar a mistura. Incubar amostras por 5 min à TA. Centrifugação de tubos por 15 min (≥8,000 xg, 4 ° C) em uma microcentrífuga de bancada. Transfira a fase aquosa (superior) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e registre o volume transferido (para simplificar o procedimento, recomenda-se coletar volumes iguais em todas as amostras da experiência). Adicione 1 volume de etanol 100% lentamente (gota a gota) à fase aquosa enquanto se mistura. Não centrifugue. Execute os próximos passos com o kit de preparação de RNA mini comercial. Pipetar até 700 μL de cada amostra, incluindo qualquer precipitado que tenha se formado, em uma coluna de rotação em um tubo de coleta de 2 mL (fornecido pelo fabricante). Feche oTampa e centrífuga (≥ 8,000 g, RT) por 15 s. Descarte o fluxo contínuo. Repita a etapa anterior com a amostra restante (se houver). Siga as instruções dos fabricantes para a lavagem e eluição do ARN (eluir cada amostra em 30 a 40 μl de H 2 O isento de nuclease para obter uma concentração apropriada de ARN para o próximo passo). Determine a concentração de ARN e a pureza das amostras por medidas de absorvência (uma razão de 260/280 de 2,0-2,1 indica boa pureza da amostra de ARN). Armazene amostras de ARN a -80 ° C até uso para análise de RT-qPCR. Para a conversão de ARN em cDNA e subsequente PCR quantitativa, tome 1 μg de RNA por amostra e prepare a reação retrotranscriptase de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de cDNA obtidas podem ser armazenadas a 4 ° C (por alguns dias) ou a -20 ° C (por períodos de tempo mais longos). NOTA: A preparação de amostras, o design do primer e outras considerações para PCR em tempo real foram exDetalhadamente descrito na literatura 22 , 23 .

Representative Results

Representação esquemática dos protocolos Thy-Noc e HU para sincronização celular. A Figura 1 resume as etapas necessárias para a sincronização de células U2OS e posterior coleta de amostras, a fim de verificar a progressão através do ciclo celular e realizar análises de expressão gênica. A coloração de Phospho-H3 e PI são bons parâmetros…

Discussion

A análise de genes regulados por ajuste fino envolvidos em papéis temporários e temporários no ciclo celular requer uma população celular uniforme. Muitos pesquisadores usam rotineiramente linhas de células tumorais estabelecidas há muito tempo para esses propósitos e uma variedade de métodos foram desenvolvidos para obter populações celulares síncronas (ou parcialmente síncronas), com o objetivo de acumular o maior número possível de células em fases definidas do ciclo celular. Além disso, esforços i…

Materials

DMEM, high glucose, GutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	61965-059
FBS, qualified, E.U.-approved, South America origin	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
0.25% Trypsin-EDTA (1X), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200-072
Thymidine	SIGMA	T1895-5G	Freshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine.
Nocodazole	SIGMA	M-1404	Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots
Hydroxyurea	SIGMA	H8627	Freshly prepared
Mitomycin C from Streptomyces caespitosus	SIGMA	M4287	1.5mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4ºC
Dimethyl sulfoxide	SIGMA	D2650
Propidium iodide	SIGMA	P4170	Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4º C protected from light.
PBS pH 7.6			Home made
Ethanol	PANREAC	A3678,2500
Chloroform	SIGMA	C2432
Sodium Citrate	PANREAC	131655
Triton X-100	SIGMA	T8787
RNAse A	Thermo Fisher Scientific	EN0531
TRIzol Reagent	LifeTechnologies	15596018
RNeasy Mini kit	QIAGEN	74106
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	4368814
Anti-Cyclin E1 antibody	Cell Signaling	4129	1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-Cyclin B1 antibody	Cell Signaling	4135	1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-β-actin	SIGMA	A-5441	1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Anti-pH3 (Ser 10) antiboty	Millipore	06-570	Specified in the protocol
Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibody	Invitrogen	R37116	Specified in the protocol
Secondary anti-mouse-HRP antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-3697	1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Forward E2F1 antibody (human)                    TGACATCACCAACGTCCTTGA	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F1 antibody (human)                    CTGTGCGAGGTCCTGGGTC	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward E2F7 antibody (human)                    GGAAAGGCAACAGCAAACTCT	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F7 antibody (human)                    TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 antibody (human)                    AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 antibody (human)                    TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward TBP antibody (human) reference gene	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse TBP antibody (human)	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L antibody (human) reference gene   CACTTGCCAGAGATCCAGAAG	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L  antibody (human)    CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4368702
FACS Tubes	Sarstedt	551578
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Thermo Fisher Scientific	N8010560
Corning 100mm TC-Treated Culture Dish	Corning
Corning Costar cell culture plates 6 well	Corning	3506
Refrigerated Bench-Top Microcentrifuge	Eppendorf	5415 R
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12	Jouan	743205604
NanoDrop Lite Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
BD FACSCalibur Flow Cytometer	BD Bioscience
QuantStudio 3 Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	A28567