Utilizou-se uma metodologia baseada em gradiente de centrifugação por densidade modificada para isolar células epiteliais do tecido intestinal de Rhipicephalus microplus . As proteínas ligadas à superfície foram biotiniladas e purificadas através de esferas magnéticas de estreptavidina para utilização em aplicações a jusante.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de
Neste artigo
Resumo
Resumo
Rhipicephalus microplus - o carrapato do gado - é o ectoparasito mais significativo em termos de impacto econômico sobre o gado como um vetor de vários agentes patogênicos. Os esforços foram dedicados ao controle do carrapato do gado para diminuir seus efeitos deletérios, com foco na descoberta de vacinas candidatas, como o BM86, localizado na superfície das células epiteliais do intestino do carrapato. Pesquisa atual enfoca a utilização de bibliotecas de cDNA e genômicas, para pesquisar outras vacinas candidatas. O isolamento das células intestinais do carrapato constitui uma vantagem importante na investigação da composição das proteínas superficiais sobre a membrana das células intestinais do carrapato. Este artigo constitui um método inovador e viável para o isolamento de células epiteliais, a partir dos índices de intestino de carvão de R. microplus semi-engrossado . Este protocolo utiliza TCEP e EDTA para libertar as células epiteliais dos tecidos de suporte subepitelial e um gradiente de centrifugação de densidade descontínuaNt para separar as células epiteliais de outros tipos de células. As proteínas da superfície celular foram biotiniladas e isoladas das células epiteliais intestinais do carrapato, utilizando grânulos magnéticos ligados à estreptavidina, permitindo aplicações a jusante em FACS ou LC-MS / MS-analysis.
Introdução
Rhipicephalus microplus , o carrapato do gado, é o ectoparasito mais significativo em termos de impacto econômico na indústria pecuária de regiões tropicais e subtropicais, na medida em que eleva a febre do carrapato bovino (babesiose), anaplasmose e piroplasmose equina 1 , 2 , 3 , 4 . Os esforços foram dedicados ao controle do carrapato do gado, para diminuir o efeito deletério, no entanto, os métodos convencionais, como o uso de acaricidas químicos, apresentam desvantagens implícitas, como a presença de resíduos químicos no leite....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Dissecção do Epitélio Gut de R. microplus
- Recolher carrapatos semi-engorrosados do gado no dia do experimento. Dissecte os tiques dentro de 24 h após a remoção do hospedeiro.
- Aderir uma tira de fita adesiva ao fundo da placa de Petri 92 mm x 16 mm. Adicione uma gota de super cola à fita adesiva. Coloque o tiquetaque, lado ventral para baixo sobre a super cola, deixe secar por 2 min.
- Despeje 100 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) na placa Petri, ou até que o carrapato esteja completamente submerso.
- Utilizando um bisturi do tamanho 11, corte do topo dos olhos para as festinhas inferiores....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
As células epiteliais foram isoladas dos tecidos intestinais de R. microplus de acordo com o esquema apresentado na Figura 1 . A imagem de microscopia de fluorescência representativa das células epiteliais intestinais do carrapato, preparada usando este protocolo, é mostrada na Figura 2A E 2B. À medida que o isolamento das células é conduzido com .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
As infestações por carrapatos de gado constituem um grande problema para a indústria do gado em regiões tropicais e subtropicais do mundo, com o método de controle mais comum dependendo do uso de acaricidas 1 , 4 . O Bm86 foi previamente identificado dentro da superfície epitelial do intestino do carrapato como um antígeno protetor contra a infestação de R. microplus 10 , com sucesso limitado como estratégia de vacina devido à va.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores desejam agradecer a Biosecurity Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fisheries, Austrália) para a prestação de carrapatos Rhipicephalus microplus utilizados para este estudo e Lucas Karbanowicz para assistência em video-filmagem.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3,03 g Na2CO3, 6,0 g NaHCO3 1000 ml de água destilada pH 9,6 | ||
| Tubos de centrífuga de 16 mL com tampa de vedação | Thermo Scientific | 3138-0016 | Resfrie no gelo antes do gradiente |
| 250 µ Filtro de células M | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidina (TMB) Sistema de substrato líquido para ELISA | Sigma | T0440 | armazenado a 4C |
| 30% de peróxido de hidrogênio | Labscene BSPA5.500 | ||
| 4-20% Tris-MOPS Gel Gen | Script | M42015 | |
| 4-cloro-1-naftol comprimido | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| Tubo Falcon de 50 mL | Corning Azul | 30 x 115mm estilo. Tubo cônico de polipropileno. | |
| 70 µ Filtro de células M | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 papel de filtro | de | Millipore | |
| Abcam | Ab102865 | ||
| Olympus | SZX7 | ||
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Software de imagens celulares |
| Fita adesiva Fita | adesiva | 48mm x 25mm Fita adesiva | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM - gelado para protocolo |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Placa Imunológica | Nunc | 439454 | |
| Soro Fetal Bovino | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Microscópio de fluorescência | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield com DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Fórceps | Dumont | #9 Dumont - Switerzland | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glicerol para biologia molecular >99% |
| Glicine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Contador Portátil | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank' s Solução Salineira Balanceada | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – gelada para protocolo |
| Hemacitômetro | Optik Lakor | - | - |
| L-Glutationa oxidada | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Suporte de Separação Magnética | Novagen-4-Tube | Rack de Separação Magnética | |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Sistema Integral de Purificação de Água para Água Ultrapura |
| Membrana de Nitrocelulose Life | Sciences | 66485 | 30cm x 3M membrana de nitrocelulose pura |
| PageRuler Proteína Prestada Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1,16 g Na2HPO4, 0,1 g KCl, 0,1 g K3PO4, 4,0 g NaCl (500 ml de água destilada) pH 7,4 | ||
| Bomba Peristáltica Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Masterflex | 7518-10 | ||
| Ácido fosfórico | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce T20 livre de proteína PBS tampão de bloqueio | Thermo-Scientific | 37573 | Armazenado a 4C. |
| Inibidor de protease | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – armazenado a -20 ° C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | Para Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standards for Bradford |
| Assay Scalpel | . Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrífuga | Thermo Scientific | 46910 | |
| Estreptavidina (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Cola - Ultra Rápida Mini | UHU | UHU Super Cola 1mg. Centrífuga de Mesa Ultra Rápida Mini | |
| Eppendorf | 22331 | ||
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Misturador de Vórtice | Ratek | VM1 | |
Referências
- Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
- De Rose, R., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
