Itoforese em tempo real com tetrametilamônio para quantificar fração de volume e tortuosidade do espaço extracelular cerebral

Summary

Este protocolo descreve a iontoforese em tempo real, um método que mede os parâmetros físicos do espaço extracelular (ECS) dos cérebros vivos. A difusão de uma molécula inerte liberada no ECS é utilizada para calcular a fração de volume ECS e tortuosidade. É ideal para estudar alterações reversíveis agudas na ECS cerebral.

Abstract

Esta revisão descreve os conceitos e protocolos básicos para executar o método de iontoforese em tempo real (RTI), o padrão-ouro para explorar e quantificar o espaço extracelular (ECS) do cérebro vivo. O ECS envolve todas as células cerebrais e contém fluido intersticial e matriz extracelular. O transporte de muitas substâncias necessárias para a atividade cerebral, incluindo neurotransmissores, hormônios e nutrientes, ocorre por meio da difusão através do ECS. Mudanças no volume e geometria deste espaço ocorrem durante processos cerebrais normais, como o sono e condições patológicas, como a isquemia. No entanto, a estrutura e a regulação das ECS cerebrais, particularmente em estados doentes, permanecem largamente inexploradas. O método RTI mede dois parâmetros físicos do cérebro vivo: fração volumétrica e tortuosidade. A fração de volume é a proporção de volume de tecido ocupado pela ECS. A tortuosidade é uma medida do impedimento relativo que uma substância encontra ao difundir através de um cérebro reEm comparação com um meio sem obstruções. Em RTI, uma molécula inerte é pulsada a partir de um microeletrodo de origem no ECS do cérebro. À medida que as moléculas se difundem para longe desta fonte, a mudança da concentração do íon é medida ao longo do tempo usando um microeletrodo seletivo de íons, localizado a aproximadamente 100 um de distância. A partir da curva de difusão resultante, tanto a fração de volume quanto a tortuosidade podem ser calculadas. Esta técnica tem sido utilizada em fatias de cérebro de múltiplas espécies (incluindo seres humanos) e in vivo para estudar alterações agudas e crônicas para ECS. Ao contrário de outros métodos, RTI pode ser usado para examinar mudanças reversíveis e irreversíveis no ECS do cérebro em tempo real.

Introduction

O espaço extracelular (ECS) é a rede de canais interligados para todas as células cerebrais e contém fluido intersticial e matriz extracelular ( Figura 1a e Figura 1b ). A distribuição de muitas substâncias necessárias para a função das células cerebrais, incluindo nutrientes, hormônios e neurotransmissores, ocorre por difusão através da ECS. As mudanças nos parâmetros físicos deste espaço, incluindo o volume, a geometria e a matriz extracelular, podem afetar drasticamente a difusão através do ECS e as concentrações de íons locais que banham as células cerebrais, que têm um impacto profundo na função celular....

Protocol

Todos os procedimentos de animais, usados ​​para obter amostras de tecido, foram aprovados pelo comitê de ética animal no SUNY Downstate Medical Center.

1. Preparação de soluções e equipamentos

1. Prepare uma solução de enchimento de NaCl 150 mM para o barril de referência do ISM. Armazene-o em uma seringa de 10 mL anexada a um filtro de 0,22 μm (para remover bactérias ou partículas).
2. Prepare uma solução de aterramento de cloreto de TMA 150 mM (TMA-Cl) para os microeletrodos. Armazene-o em uma seringa de 10 mL anexada a um filtro de 0,22 μm. Prepare as soluções de TMA-Cl (neste protocolo) a partir de uma solução de estoq....

Results

A utilidade da técnica RTI é demonstrada em um experimento projetado para medir as mudanças em α e durante um desafio hipoosmolar ( Figura 8 e Figura 9 ). Já foi demonstrado que a redução da osmolaridade do ECS por lavagem na ACSF hipotônica produzirá uma diminuição em α e um aumento em λ ¹³ .

Nesta experiência, o RTI.......

Discussion

Figura 10: Dados não ideais que demonstram problemas técnicos comuns. (A) Diagramas de problemas técnicos comuns com microeletrodos de iontoforese: Comparação da versão normal do TMA de um microeletrodo funcionamento iontoforese com três fontes demonstrando questões técnicas. [Ampliação alta, a1] A corrente em uma fonte iontoforética ideal é carregada igualmente pela liberação de TMA e absorção de clor.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conversor A/D e D/A	National Instruments Corporation NI	USB-6221 DAQ	O NI USB-6221 ainda é vendido como um dispositivo 'Legacy' pela NI. Eles recomendam o uso de DAQs NI USB-6341 X Series para novas instalações, no entanto, não testamos as unidades mais recentes. Descrevemos o uso do NI USB-6221 com MATLAB e Windows 7 (32 bits). Alternativas: o conversor A/D PCI-MIO-16E-4 muito mais antigo (usado apenas no Windows XP ou sistema operacional mais antigo) com painel de conectores BNC-2090 BNC e cabo SH68-68-EP. Conforme observado no Manual Wanda, um programa experimental do MATLAB para usar arquivos binários de axônio está disponível.
agarose	Lonza	NuSieve GTG Agarose #50081	para preparar gel de agarose diluído para medições RTI
amplificador para ISM	Dagan	Modelo IX2-700 Pré-amplificador intracelular duplo	amplificador de íons e tensão de referência com N=0,1 (para barril de referência) e N=0,001 (para barril de íon) headstages
miscroscópio composto biológico (com objetiva de 4x e 10x)			para lascar as pontas dos microeletrodos e inspecionar microeletrodos; vários fornecedores, e.g.
Tubo de vidro capilar de borossilicato	Harvard Apparatus	Warner Instruments modelo TG200-4; pedido #64-0811	tubo de vidro de barril duplo para microeletrodos seletivos de íons e microeletrodos iontoforéticos; diâmetro externo 2,0 mm, diâmetro interno 1,4 mm, septo 0,2 mm, comprimento 10 cm
escova	Winsor & Newton	University Series 233,	escova de cabo shoft redondo tamanho 0, disponível na Amazon
Fisher			bico de bunsen
para visualização de micropipetas	Olympus	OLY-150	requer monitor, filtro IR no iluminador de subestágio é gravador
			gráfico opcionalregistrar continuamente tensões em microeletrodos seletivos de íons durante a calibração em padrões de tetrametilamônio e durante o experimento RTI; por exemplo Kipp & Zonen tipo BD112 gráfico de canil duplo registrado, clorotrimetilsilano recondicionado disponível
, puriss., > 99%	Catálogo Sigma-Aldrich	# 92360	para silanização; CUIDADO: inflamável, toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação), corrosão da pele, danos aos olhos, reage violentamente com a água, consulte as informações de segurança da Sigma-Aldrich para obter uma descrição completa
Software comercial	O MathWorks	MATLAB, caixa de ferramentas de aquisição de	dados para aquisição e análise de dados usando os programas Wanda e Walter. Observe que uma licença acadêmica está disponível.
óculos de proteção para os olhos	Microscópio
	Olympus	BX51WI	pode usar outros microscópios compostos com fórceps de estágios fixos
	Ferramentas de Belas	Ciências#11251-10	para lascar capilares de vidro; Dumond # 5, preferencialmente usado e não mais necessário para
capela			para silanização e enchimento da ponta do barril seletivo de íons com trocador de íons líquidos; vários supliers, e.g.< / em> Captair com filtro apropriado vendido pela
lâmina de microscópio de vidro	Erlab Fisher	# 12-550A	para chip de pontas de microeletrodo
aquecedor / agitador	Fisher	Corning PC-420D	para preparar gel de agarose diluído e agitar soluções
iontoforéticas	unidade Dagan	ION-100 e PS-100	ION-100 é uma unidade de iontoforese de canal único +/- 130 V conformidade; PS-100 é uma fonte de alimentação externa; alternativas: por exemplo Axoprobe-1A fabricado pela Axon Instruments (agora Molecular Devices), fora de produção, verifique a disponibilidade de unidades recondicionadas (eBay e outros sites)
trocador de íons líquido (LIX) para tetrametilamônio	World Precision Instruments	IE190 Trocador de íons de potássio	Nota: isso é equivalente ao trocador de potássio Corning original 477317 baseado em tetrafeniliborato - não confunda com trocador de potássio neutro originário do laboratório do Dr. Simon, ETH, Zurique, que não detecta tetrametilamônio e é vendido pela Fluka. Você também pode fazer trocador de íons líquido para tetrametilamônio: 3% em peso tetraquis de potássio = borato (p-clorofenil) dissolvido em 2,3-dimetilnitrobenzeno. Compre produtos químicos da Fluka (agora parte da Sigma). Veja Oehme e Simon (1976) Anal. Acta 86: 21-25; CUIDADO: As propriedades toxicológicas deste trocador de íons líquido não foram totalmente determinadas. A ingestão ou o contato com o corpo humano podem ser prejudiciais. Tenha o devido cuidado! Os trocadores de íons líquidos devem ser armazenados em local fresco, longe da luz solar direta.
o suporte WPI do microeletrodo		M3301EH	para guardar o microeletrodo íon-seletivo pré-fabricado para silanização e o enchimento da ponta do tambor íon-seletivo com o permutador de íon líquido; A WPI vende duas versões deste suporte, M3301EH transparente e M3301EH preto. Em nossa experiência, o M3301EH transparente parece ser mais resistente do que o M3301EH preto.
micromanipulador	Narishige	MM-3	para posicionar o microeletrodo íon-seletivo pré-fabricado durante a silanização e enchendo a ponta do barril íon-seletivo com trocador de íons líquido; pode ser substituído por qualquer micromanipulador de três eixos em boas condições de trabalho
extrator de micropipeta	Sutter Instruments	Modelo P-97	para puxar tubos de vidro de cano duplo; outros extratores podem ser usados desde que possam acomodar tubos de vidro de cano duplo de grande diâmetro
termômetro de microssonda	Physiotemp	Modelo BAT-12R	sonda fina deste termômetro é colocada perto da agulha do local de registro
		Seringas e agulhas BD # 305122 (calibre 25)	para silanização; Agulhas BD PrecisionGlide 25 G x 5/8 pol (0,5 mm x 16 mm)
objetiva 5X seca	Olympus	MPlan N
objetiva 10X imersão em água	Olympus	UMPlan FL N	10X a objetiva é imersão em água, a abertura numérica é 0,3, a distância de trabalho é de 3,3 mm
recipientes de plástico (com tampas)	Fisher	#14-375-148	para armazenar soluções padrão de tetrametilamônio e microeletrodos
plataforma e platina de translação x-y para microscópio de platina fixa	EXFO	Gibraltar A plataforma Burleigh	contém câmara de fatia, micromanipuladores e acessórios, a platina translacional x-y move o microscópio sem comprometer a estabilidade de gravação
minicup			para medições de RTI em gel de agarose diluído;
adesivo reutilizável	Bostik	Blu-Tack	para prender microeletrodos ao recipiente de retenção e outros usos; vários fornecedores, disponíveis na Amazon
micromanipulador robótico com posicionamento preciso x, y, z	Sutter Instruments	MP-285	dois micromanipuladores são necessários para segurar separadamente o microeletrodo íon-seletivo e o microeletrodo iontoforético. Também é possível colar micropipetas em uma matriz espaçada (ver texto).
unidade de condicionamento de sinal com filtro passa-baixo	Axon Instruments	CyberAmp 320 ou 380	não está mais disponível no fabricante, mas pode estar disponível no E-Bay; alternativas: por exemplo Filtro/Amplificador FLA-01 da Cygnus Technology. Este é um instrumento de canal único com um corte mínimo de 10 Hz usando um filtro Bessel multipolar, mas a empresa pode estar disposta a modificá-lo para uma frequência de corte mais baixa (2 Hz), se necessário.
fio de prata	A-M Systems	#7830	diâmetro 0.015", câmara de fatia nua (sem revestimento)
	Harvard Apparatus	Warner Modelo RC-27L	esta é uma câmara de fatia de submersão; não use
estereomicroscópio			para silanização e enchimento da ponta do barril seletivo de íons com trocador de íons líquido; montado horizontalmente; seringa de vários fornecedores
, 10 mL		Seringas e agulhas BD #309604	para preenchimento de microeletrodos e para silanização; Filtro de seringa de ponta BD Luer-Lok
0.22 µ m pore	Whatman	#6780-1302	para filtrar soluções de aterro; disponível na
agulha de seringa Fisher, calibre 28, 97mm	World Precision Instruments	MicroFil MF28G-5	para microeletrodos de aterro
Tubulação de teflon (=PTFE)	Fornecimento de componentes	STT-28 Parede de luz do tubo de PTFE (calibre 28)	para silanização de barril seletivo de íons; se encaixa em agulhas BD PrecisionGlide 25 G x 5/8 in. Nota: O teflon é essencial, a tubulação de PVC derreteria por cera quente.
sistema de controle de temperatura	Harvard Apparatus	Warner Models TC-344B e SH-27A	TC-344B é um controlador de temperatura automático duplo, SH-27A é um aquecedor em linha; controlador e aquecedor funcionam com Warner slice chambers
tetramethyammonium (TMA) cloreto	Sigma-Aldrich	T-3411	5 M solução; CUIDADO: toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação), carcinogenicidade, perigosa para o ambiente aquático, consulte as Informações de Segurança Sigma-Aldrich para obter a descrição completa
micrótomo de lâmina vibratória	Leica	VT1000S	para cortar fatias de cérebro
xilenos	Fisher	X5-1	para silanização; CUIDADO: inflamável, toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação), corrosão da pele, danos aos olhos, carcinogenicidade, consulte as informações de segurança da Fisher para obter a descrição completa