Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

Summary

sistemas de expressão em células de insecto Nonlytic são pouco utilizados para a produção, o tráfico celular / localização, e a análise funcional da proteína recombinante. Aqui, nós descrevemos métodos para gerar vectores de express e subsequente expressão da proteína transiente em linhas de células de lepidópteros disponíveis comercialmente. A co-localizao de aquaporinas de Bemisia tabaci com proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares também é apresentada.

Abstract

sistemas de expressão de proteínas heterólogas são utilizados para a produção de proteínas recombinantes, a interpretação de tráfico celular / localização, e a determinação da função bioquímica de proteínas ao nível sub-organismos. Embora os sistemas de baculovírus de expressão são cada vez mais utilizados para a produção de proteína em numerosos biotecnológica, farmacêutica e aplicações industriais, sistemas nonlytic que não envolvem infecção viral tem benefícios claros, mas muitas vezes são esquecidos e subutilizados. Aqui, descrevemos um método para a geração de vectores de expressão nonlytic e a expressão da proteína recombinante transiente. Este protocolo permite a localização celular eficiente de proteínas recombinantes e pode ser utilizado para discernir rapidamente proteína tráfico dentro da célula. Mostramos a expressão de quatro proteínas recombinantes em uma linha celular de insecto disponível comercialmente, incluindo duas proteínas aquaporina do Bemisia tabaci insectos, bemcomo proteínas marcadoras subcelulares específicos para a membrana plasmática da célula e para os lisossomas intracelulares. Todas as proteínas recombinantes foram produzidas como quimeras com marcadores de proteínas fluorescentes nas suas extremidades carboxilo, que permite a detecção directa das proteínas recombinantes. A dupla transfecção das células com plasmeos albergando construes para os genes de interesse e um marcador subcelular conhecido permite imagens de células vivas e melhorada validação de localização da proteína celular.

Introduction

A produção de proteínas recombinantes, utilizando sistemas de expressão de células de insecto oferece numerosos benefícios para o estudo de proteínas eucarióticas. Ou seja, as células de insectos possuir modificações semelhantes pós-tradução, processamento, e os mecanismos de triagem como os presentes em células de mamíferos, o que é vantajoso para a produção de proteínas correctamente dobradas ^{1, 2, 3.} Sistemas de células de insectos também tipicamente requerem menos recursos e menos tempo e esforço para manutenção de linhas celulares de mamíferos ^4,<....

Protocol

1. OE-PCR para a construção de plasmídeos de expressão

Nota: Ver Tabela 1 para todos os iniciadores utilizados na OE-PCR. A utilização de uma polimerase de DNA de alta-fidelidade é recomendada para todas as amplificações. No entanto, porque estas enzimas frequentemente não deixe um 3' , é necessário realizar uma breve, a incubação não-amplificação com uma polimerase de ADN de Taq a 'um-cauda' produtos do PCR antes da clonagem-los em uma expressão de célula de insecto TA vetor. Este protocolo demonstra um método para gerar os plasmídeos de expressão de insecto abrigando proteínas quiméricas, com as proteínas fluo....

Results

OE-PCR

OE-PCR permite a síntese de produtos de ADN quiméricas que, uma vez inserida num vector de expressão, para permitir a produção de proteínas quiméricas recombinantes correspondentes a qualquer gene de teste de interesse e proteína marcador fluorescente. A Figura 1 representa um esquema geral para a produção de vectores de expressão contendo PIB B. sequências de codificação (BtDrip1 e BtDrip2_v1) em.......

Discussion

Sistemas de expressão de proteínas heterólogas são ferramentas importantes para a produção de proteínas recombinantes utilizadas em numerosas aplicações a jusante ^4. Escolhendo a partir de diversos sistemas de expressão disponíveis depende do objectivo final para a proteína de interesse. Vários sistemas de expressão em células de insecto estão disponíveis que oferecem alternativas flexíveis para sistemas de expressão de células procariotas e eucariotas ^5,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA polimerase	EMD Millipore	71085-3	DNA polimerase de alta fidelidade KOD usada para amplificação de PCR de produtos de PCR de extensão de sobreposição
ExTaq DNA polimerase	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA polimerase usada para A-tailing de produtos de PCR
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA polimerase Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA polimerase usado para PCR
de colônia bacterianaBiometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Ágaro LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Kit de Extração de Gel de DNA	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His Kit de Expressão TOPO TA	ThermoFisher	K89020	Contém componentes necessários para clonar produtos de PCR de extensão sobrepostos, incluindo vetor pIB/V5-His-TOPO linearizado e ativado por topoisomerase I, E. coli quimicamente competente One Shot TOP10 e solução salina.
Kit QIAprep Spin MiniPrep	Qiagen	27104
Estação de Trabalho Robótica QIAcube	Qiagen	9001292
Purificador Vertical Bancada Limpa	Labconco	3970401
Linha de Células de Insetos Cultivadas em Tni	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Linha de Células de Insetos Cultivadas Sf9	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Meio de cultura de insetos sem soro	Allel Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Meio de cultura de insetos	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Meio	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Reagente de transfecção	ThermoFisher	10362100
16 cm Raspadores de células descartáveis	Sarstedt	83.1832	Cell raspadores com lâmina de duas posições
25 cm2 (T25) Frascos de cultura de tecidos com tampas de filtro de ventilação	para ciências da vida	CT-229331
Pipetas de transferência	Fisher	1371120
Estéril, tubos de bio-reação de 50 mL Produtos	para ciências da vida	CT-229475
PipeBoy	VWR	14222-180
5 mL sorológico Pipetas	Sarstedt	86.1253.001
Tubos PCR de tampa plana de 0,5 mL	Sacos	14230200
Polipropileno Biohazard Fisher		01828C
Pratos com fundo de vidro de 35 mm #1,5 Vidro	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U Diâmetro do	prato de 35 mm, diâmetro do vidro de 14 mm, espessura do vidro de 1,5 mm, incubadora não revestida
, modelo 1510E	VWR	35823-961
Contador de células Countess II FL	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides com reagente azul de tripano a 0,4%	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Microscópio confocal de varredura a laser	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2 / pCS6 plasmídeo DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagente (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605