Artigo de método

In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

DOI:

10.3791/55757

⸱

9 de agosto de 2017

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Physiology, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um método para eficientemente aproveitar o potencial de diferenciação cardíaca da jovens fontes de células-tronco mesenquimais humanas a fim de gerar células funcionais, contratantes, casos, como in vitro.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infarto do miocárdio e a subsequente cascata isquêmica resultam na perda extensa de cardiomyocytes, levando à insuficiência cardíaca congestiva, a principal causa de mortalidade em todo o mundo. Células-tronco mesenquimais (MSCs) são uma opção promissora das terapias baseadas em células substituir as técnicas atuais, invasivas. MSCs podem diferenciar em linhagens mesenquimais, incluindo tipos de células cardíacas, mas completa diferenciação em células funcionais ainda não foi alcançada. Métodos anteriores de diferenciação foram baseados em agentes farmacológicos ou fatores de crescimento. No entanto, estratégias mais fisiologicamente relevantes também podem habilitar o MSCs submeter-se a transformação do cardiomyogenic. Aqui, apresentamos um método de diferenciação usando MSC agregados em camadas de alimentador de casos para produzir células contratantes casos.

Cordão humano perivasculares células (HUCPVCs) foram mostradas para ter uma maior diferenciação potencial do que comumente investigados tipos MSC, tais como a medula óssea MSCs (BMSCs). Como uma fonte de ontogenetically mais jovem, nós investigamos o potencial de cardiomyogenic de HUCPVCs de (FTM) do primeiro trimestre em comparação com as fontes mais antigas. FTM HUCPVCs são uma fonte rica, romance de MSCs que retêm suas no utero immunoprivileged Propriedades quando cultivadas em vitro. Usando este protocolo de diferenciação, FTM e termo HUCPVCs alcançado cardiomyogenic significativamente maior diferenciação em relação ao BMSCs, conforme indicado pelo aumento da expressão de marcadores de casos (ou seja, miócito factor potenciador 2C, troponina cardíaca T, cardíaco miosina de cadeia pesada, α proteína reguladora de sinal e connexin 43). Eles também mantiveram significativamente mais baixa imunogenicidade, como demonstrado pela sua menor expressão de HLA-A e HLA-G maior. Aplicação de diferenciação baseada no agregado, FTM HUCPVCs mostrou maior formação de agregados potenciais e gerado contratação aglomerados de células dentro de 1 semana de co-cultura sobre camadas cardíacas alimentador, tornando-se o primeiro tipo MSC a fazê-lo.

Nossos resultados demonstram que esta estratégia de diferenciação pode efetivamente aproveitar o potencial de cardiomyogenic da jovens MSCs, tais como FTM HUCPVCs e sugere que em vitro pre-diferenciação poderia ser uma estratégia potencial para aumentar sua eficácia regenerativa em vivo.

Introdução

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Insuficiência cardíaca congestiva (ICC) persiste como das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. CHF ocorre frequentemente após a perda maciça de cardiomyocytes e o desenvolvimento do tecido de cicatriz sem célula como resultado patológico de um infarto do miocárdio (MI)1. Enquanto o coração é um órgão parcialmente auto renovadora, a residente tronco progenitoras célula piscina e responsável pela execução de regeneração tecidual significativamente diminui em abundância e função em pacientes idosos, muitas vezes tornando-se insuficiente para a recuperação ideal após a lesão. Assim, há grande interesse no desenvolvimento de tratamentos experimentais que envolvem o transplante de células de doadores saudáveis para o miocárdio danificado. É imperativo que as células do doador não só restaurar a estrutura do tecido, mas também alcançar a recuperação funcional do miocárdio afetado.

O coração nativo emprega coração tecido-residente e endógenas células-tronco da medula óssea-originou para pós-lesão reparar2,3,4. Regenerativa células-host e doador derivada de iguais, deve ter a capacidade de obter o fenótipo apropriado e a função do microambiente do miocárdio remodelação, juntamente com a capacidade de forma eficiente e segura a substituir as células perdidas. Métodos de diferenciação in vitro têm sido amplamente utilizados para alcançar alta eficiência, com base em células estaminais casos produção5,6. O perfil de expressão de marcadores de linhagem cardíaca é usado para definir o processo de diferenciação de células-tronco para a linhagem cardíaca7. Início diferenciação marcadores, tais como NKX2.5, factor potenciador de miócito 2C (Mef2c) e GATA48,9, podem ser uma indicação do início do processo de cardiomyogenic. Marcadores de casos maduro, comumente usados para avaliar a eficácia de diferenciação são sinal proteína reguladora α (SIRPA)10, troponina cardíaca T (miocardite)11, cadeia pesada miosina cardíaca (MYH6)8,12,13e connexin 43 (Cx43)14,15,16. Os métodos usando células-tronco embrionárias (CES) e as células-tronco pluripotentes (EPS) foram cuidadosamente otimizados e discutidos sobre os detalhes de fatores indutivos, oxigênio e nutrientes gradientes e o momento exato da ação5,6,7,17,18. No entanto, ESC e PSC-com base em tecnologias ainda apresentam várias preocupações éticas e de segurança, juntamente com características eletrofisiológicas e imunológicos suboptimal19,20. Hosts transplantados com estas células frequentemente experimentam immunorejection e requerem imunossupressão permanente. Isto é principalmente devido ao descasamento de histocompatibilidade (MHC) as moléculas complexas no host e o doador e o resultante de resposta de células T21. Enquanto indivíduo MHC classe I de correspondência é uma solução possível, uma prática clínica mais acessível exigiria uma fonte de celular que é universalmente immunoprivileged superar a preocupação de rejeição.

Como uma fonte alternativa de células para uso em aplicações clínicas, MSCs e em particular, BMSCs, têm sido investigados para uso na regeneração de tecidos desde sua descrição inicial em 199522. MSCs são acreditados para ser residentes células regenerativas que podem ser encontradas em quase qualquer tecido vascularizado23. Após o isolamento da fonte desejada, MSCs podem facilmente ser expandidos na cultura, têm capacidade extensa parácrina e frequentemente possuem immunoprivileged ou imunomoduladores propriedades24,25. Sua segurança e eficácia já foram mostrados em diversos estudos pré-clínicos, em particular para regeneração cardíaca3,26.

Muitas estratégias de diferenciação de MSC utilizam agentes farmacológicos, tais como azacytidine 522 e DMSO27e crescimento ou fatores morphogenic, BMPs5,7,28,29 ou da angiotensina-II30, com eficiência variável. Estas estratégias, no entanto, não se baseiam os obstáculos que um celular regenerativa ingênuo é provável encontrar depois de hospedagens ou sendo entregue para o local da lesão in vivo. Estratégias mais fisiologicamente relevantes, embora mais difícil de definir e manipular, baseiam-se na premissa de que a diferenciação de MSC pode ser induzida através de sinais do microambiente do tecido em si. Estudos anteriores mostraram que a exposição à célula cardíaca lysates31 ou32,de miocárdio ventricular33, ou direto contato com cardiomyocytes primária em vitro15,34, pode aumentar a expressão dos marcadores cardíacos no MSCs. Outros demonstraram cardiomyogenesis espontânea após o tratamento de lesões cardíacas com MSCs35,36,37,38, embora em parte, a fusão de BMSCs e cardiomyocytes39,40 gerado o miocárdio nascente. A nosso conhecimento, funcionais, espontaneamente contratantes cardiomyocytes do MSCs humanas (hMSCs) de qualquer fonte de tecidos ainda não foram relatados.

O consenso atual é que todos os MSCs surgem a partir de células perivasculares23. Young MSCs com Pericito propriedades podem ser isolados da região perivascular de4342,41,do tecido humano do cordão umbilical. Em comparação com BMSCs, HUCPVCs possuem potencial maior diferenciação e várias outras vantagens regenerativas, ambos em vitro41,44 e na vivo45,46,47. Notavelmente, a fonte, sendo a interface materno-fetal, HUCPVCs têm significativamente mais baixa imunogenicidade em comparação com adultas fontes do MSCs. Nossa pesquisa centra-se na caracterização e aplicações pré-clínicas de FTM HUCPVCs, a mais nova fonte de MSCs investigados, que mostramos anteriormente ter aumentado multilineage proliferativa e maior capacidade de diferenciação, incluindo a linhagem de cardiomyogenic41.

Aqui, apresentamos um protocolo que combina a formação de agregados e camadas de alimentador primário de células cardíacas como indutivas forças para alcançar a diferenciação de cardiomyogenic completa de MSCs. agregados fornecem um ambiente 3D, que modela melhor condições em vivo em comparação com as culturas aderentes 2D. Utilizar camadas cardíacas alimentador fornece um ambiente que é representante do site do transplante final para os MSCs. Demonstramos que fontes mais jovens de MSCs isoladas de cordões umbilicais de pré ou pós-natal têm uma maior capacidade para agregados de forma e atingir o fenótipo cardíaco em comparação com BMSCs adultos, mantendo ainda o seu privilégio imunológico. Além da elevação íngreme de genes marcadores de linhagem cardíaca e a expressão induzida de intracelular (i.e., miocardite e MYH6) e as proteínas da pilha-superfície (i.e., SIRPA e Cx43) específicos para cardiomyocytes, mostramos que o potencial de diferenciação da FTM HUCPVCs pode ser aproveitado com esse método e que eles podem dar origem a contratantes espontaneamente células casos.

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Protocolo

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Todos os estudos envolvendo animais foram conduzidos e relatados de acordo com as diretrizes ARRIVE48. Todos os estudos foram realizados com aprovação do conselho de ética em pesquisa institucional (REB número 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, Universidade de Toronto, Toronto, Canadá). Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da University Health Network (Toronto, Canadá), e todos os animais receberam cuidados humanitários em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório,8ª edição (National Institutes of Health 2011).

1. Cultura de tecidos

  1. Cultura FTM HUCPVCs, termo HUCPVCs (previamente estabelecido, n ≥ 3 linhas independentes para cada um)42 e BMSCs disponíveis comercialmente em meio essencial alfa-mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e um coquetel de penicilina/estreptomicina (P/S) a 1%. Cultura de cardiomiócitos primários de ratos e co-culturas de cardiomiócitos MSC no meio Eagle modificado de Dulbecco: Mistura de nutrientes F-12 (DMEM-F12) contendo 10% de FBS e 1% de P/S.
    NOTA: Esterilize o meio usando um filtro de 0.2 μm. Conservar as soluções médias preparadas a 4 °C durante um período máximo de 3 semanas.
  2. Manter culturas de células em incubadoras umidificadas (95% de umidade relativa, 37 °C e 5% de CO2) e passagem a 70-80% de confluência, determinada por microscopia de contraste de fase. Use volumes apropriados de meio para o tamanho da placa de cultura de tecidos usada (por exemplo, 10 mL em uma placa de 10 cm e 2 mL por poço em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços). Utilizar estas condições de cultura durante o período de vigência do protocolo.
  3. Dissocie as monocamadas de MSC para passagem ou estabelecimento de co-cultura de cardiomiócitos MSC usando uma solução enzimática de dissociação (2 mL / poço em uma placa de 6 poços) e incube a 37 ° C por 4 min.
  4. Transfira as células dissociadas para um tubo de 15 ml e centrifugue a 400 x g durante 5 min.
  5. Aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular e ressuspender as células em 1 ml de um meio de cultura adequado para a contagem utilizando um contador de células automático. Semeie as células conforme descrito nas seções de protocolo a seguir.

2. Preparação de Co-culturas Primárias de Cardiomiócitos de Ratos-MSC

  1. Obtenha tecido cardíaco para isolamento primário de cardiomiócitos.
    1. Eutanasiar filhotes de ratos (5-6 dias pós-parto) usando asfixia por CO2. Defina as câmaras de CO2 para 20% de reposição de gás (vazão = 0,2 x volume da câmara por minuto). Confirme o exitus pela ausência do reflexo de pinça.
    2. Remova os átrios com os principais vasos sanguíneos conectados usando instrumentos esterilizados (ou seja, fórceps e tesouras curvas)41. Transfira os corações para tubos de 50 mL contendo PBS estéril com 1% de P/S (PBS-P/S) no gelo.
    3. Corte os ventrículos ao meio e deixe o sangue sair em um prato de 10 cm com 10 mL de PBS-P/S no gelo. Corte as paredes ventriculares em pedaços pequenos (diâmetro = 2-3 mm) usando uma tesoura curva.
    4. Transfira os pedaços de coração de 10-12 animais para um tubo de 50 mL usando uma pipeta sorológica e deixe-os repousar.
    5. Remova o máximo possível de PBS-P / S sem remover nenhum pedaço de coração. Adicione 10 mL de novo PBS-P / S.
  2. Digerir o tecido cardíaco para isolar os cardiomiócitos.
    1. Deixe os pedaços do coração assentarem. Substitua o PBS-P/S por 10 mL de tripsina a 0,15% em PBS e agite a 37 °C por 10 min.
    2. Descarte o sobrenadante. Repita a digestão descrita na etapa 2.2.1 mais três vezes, mas decanta os sobrenadantes em tubos de coleta de 50 mL contendo 10 mL de FBS 100%.
  3. Centrifugar as células (400 x g, 5 min) e aspirar o sobrenadante. Ressuspenda as células em DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P/S e semeie em uma placa de 6 poços (1 x 10 5 células/cm2, 2 mL de meio por poço).
  4. Após 1 h, transfira o meio contendo células não anexadas para um tubo de 50 mL e descarte as células anexadas. Conte as células em suspensão e coloque-as novamente em novas placas de 6 poços (1 x 105 células/cm2, 2 mL de DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P/S por poço).
  5. Inibir a proliferação celular com bromodeoxiuridina (BrdU).
    Cuidado: BrdU é um forte teratogênico e suspeito de mutagênico. Certifique-se de que o treinamento adequado seja fornecido e consulte a ficha de dados de segurança antes de usar.
    1. Uma vez que as células tenham se fixado, substitua o meio na placa de 6 poços por DMEM-F12 contendo 10% de FBS, 1% de P/S (2 mL de meio por poço) e 5 μM de BrdU. Incubar durante 16 h (37 °C, 5% CO2).
    2. Remova o meio contendo BrdU e substitua por DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P/S (2 mL de meio por poço).
  6. Prepare MSCs pré-coradas.
    1. Quando as culturas de MSC estiverem a 70-80% de confluência em placas de 10 cm, remova o meio de cultura e adicione 3 mL de solução de dissociação celular. Incubar a cápsula a 37 °C e 5% de CO2 durante 5 min.
    2. Transfira as células dissociadas para um tubo de 15 ml e centrifugue a 400 x g durante 5 min.
    3. Aspire o sobrenadante sem interromper o pellet celular e ressuspenda as células em 1 mL de DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P/S para contagem usando um contador de células automatizado.
    4. Dilua as células a uma concentração de 1 x 106 MSC / mL de DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P / S.
    5. Incube as MSCs com corante fluorescente viável e intransferível (5 μM, 30 min, 37 °C, 5% CO2) em tubos de centrífuga de 1,5 mL por 1 h.
    6. Centrifugue os tubos a 400 x g por 5 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P / S para uma concentração celular de 1 x 106 MSC / mL. Repita isso um total de 3 vezes.
  7. Transfira as MSCs para cardiomiócitos (etapa 2.5.2) a uma concentração de 10 x 104 células por poço da placa de 6 poços.

3. Preparação de coculturas agregadas

  1. Prepare uma suspensão unicelular de MSCs (2 x 104 células/mL de meio, passagem # ≤ 6) em alfa-MEM suplementada com 10% de FBS e 1% de P/S (consulte a etapa 2.6).
    NOTA: Consulte a seção 1 do protocolo para a passagem de células. Como alternativa, pré-core as MSCs de acordo com a etapa 2.6.
  2. Inicie a formação de agregados colocando gotas de 25 μL de suspensão celular (500 células) na superfície interna das tampas de placas de cultura de tecidos de 10 cm (até 50 gotas por tampa). Coloque as tampas em suas contrapartes inferiores contendo PBS-P / S. Incube a 37 ° C e 5% CO2.
    NOTA: Coloque 5-7 mL de PBS-P/S na placa de cultura abaixo das gotas suspensas para evitar a evaporação da gota.
  3. Observe a formação de agregados nas gotas após 3 dias usando um estereomicroscópio. Se mais de 40 das 50 gotas contiverem agregados formados, colete as gotas das tampas usando uma micropipeta de 1 mL e transfira os agregados diretamente para monocamadas primárias de cardiomiócitos de rato (preparadas nas etapas 2.1-2.7; 10 gotas/poço). Evite pipetagem vigorosa para preservar a integridade do agregado.
  4. Mantenha as coculturas agregadas nas incubadoras por até 2 semanas, alterando o volume total do meio (2 mL de DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P/S por poço) a cada 72 h.
    1. Observe diariamente os agregados que se ligam às camadas de células alimentadoras usando microscopia de campo claro. Registre agregados de contratação quando observados.
  5. Prepare agregados para análise.
    1. Remova o meio e adicione 2 mL de PBS por alvéolo de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços. Remova o PBS e adicione 2 mL de solução de dissociação por poço. Incubar durante 3 min a 37 °C e 5% de CO2.
    2. Centrifugue a 400 x g por 5 min para obter um pellet de célula. Ressuspenda em meio, conforme especificado para as aplicações descritas nas etapas subsequentes (consulte as etapas 4.1, 5.1 e 6.1) e passe por um filtro de células de 70 μm.

4. Citometria de fluxo (FC) e classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)

  1. Incubar suspensões celulares (1 x 105 células em 200 μL de PBS contendo 3% de FBS) com anticorpos primários conjugados com fluoróforo (FITC ou APC) (ou seja, CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G e SIRPA para FC ou TRA-1-85 para FACS; 1:40) a 4 ° C por 30 min, protegidos da luz.
  2. Centrifugar (400 x g, 5 min) e ressuspender as células em 1 mL de PBS com 3% de FBS para FC ou PBS com 0,5% de FBS para FACS.
    NOTA: A FC das MSCs foi otimizada por Hong et al.41.
  3. Manter as células a 4 °C no escuro até que estejam prontas para serem analisadas por FC (pelo menos 1 x 104 eventos) ou FACS. Classifique as células conforme descrito41. Recoloque as células classificadas TRA-1-85 de alta positividade em placas de 6 poços (1 x 10,4 células/poço, 2 mL de DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P/S) dentro de 1 h.
    NOTA: Para a estratégia de gating do antígeno de superfície celular humana TRA-1-85, consulte a Figura Suplementar.

5. Imunocitoquímica (ICC) e Microscopia

  1. Recoloque as suspensões celulares obtidas das coculturas (etapa 3.5.2) ou FACS (seção 4) em lâminas de câmara (1 x 104 células/poço, 2 mL de DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% P/S por poço). Deixe as células se fixarem durante a noite em uma incubadora de cultura de tecidos (consulte a seção 1 para as condições).
  2. Fixe as células usando 3 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS por 15 min em temperatura ambiente. Lavar 3 vezes com 3 mL de PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA; PBS-BSA) por 5 min por lavagem.
    Cuidado: Use equipamento de proteção individual adequado ao manusear o PFA.
  3. Permeabilize as células em 3 mL de PBS-BSA com 0,1% de Triton X-100. Incubar em temperatura ambiente por 10 min para antígenos intracelulares (ou seja, actinina alfa sarcomérica (aSarc) e Cx43) ou 25 min para antígenos intranucleares (ou seja, Mef2c e antígeno nuclear humano (HuNu)). Lave 3 vezes com 3 mL de PBS-BSA por 5 min por lavagem.
  4. Bloqueie as amostras contra reações de anticorpos não específicos com 3 mL de PBS contendo 5% de soro de cabra normal (NGS) e 1% de BSA por 15 min em temperatura ambiente. Lave 3 vezes com 3 mL de PBS-BSA por 5 min por lavagem.
  5. Incubar as células nos anticorpos primários (ou seja, Mef2c, aSarc, Cx43 e HuNu) diluídas a 1:200 em 3 mL de PBS-BSA a 4 °C durante a noite.
  6. Lave 3 vezes com 3 mL de PBS-BSA por 5 min por lavagem e incube com anticorpos secundários por 30 min em temperatura ambiente. Lave 3 vezes com 3 mL de PBS-BSA por 5 min por lavagem.
  7. Armazene as amostras coradas em 3 mL de meio de montagem.
  8. Adquira imagens usando um microscópio de fluorescência. Use uma objetiva de 10X (NA = 0,3) e uma objetiva de 20X (NA = 0,45) para imagens de menor ampliação. Use cubos de filtro de fluorescência e comprimentos de onda para GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) e RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) para os anticorpos secundários usados (consulte a Tabela de Materiais e Equipamentos).
  9. Quantifique as imagens usando software de imagem (consulte a Tabela de Materiais e Equipamentos para obter o software recomendado). Normalize as leituras de intensidade de fluorescência para as aquisições de controle secundário.

6. Isolamento de RNA e RT-PCR quantitativo

  1. Prepare amostras de RNA de culturas de MSC indiferenciadas ou MSCs classificadas de co-culturas usando isolamento de RNA baseado em coluna, de acordo com as instruções do fabricante. Prepare 1 x 104 a 1 x 106 células em 0,7 mL de tampão de lise celular (fornecido com o kit de isolamento de RNA) por amostra.
  2. Prepare o cDNA de até 2 μg de RNA por reação de RT de 100 μL.
  3. Realize qPCR usando 10 ng de cDNA por reação (40 ciclos, temperatura de recozimento/extensão de 60 °C).
    1. Use primers para MY6H e cTnT humanos em uma concentração de 500 nM e 1-100 ng de cDNA por reação (consulte a Tabela de Materiais e Equipamentos). Use GAPDH, ACTB e HPRT como normalizadores internos de manutenção. Use cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos comercialmente disponíveis como controle positivo.
      NOTA: Expresse a mudança de dobra da expressão em comparação com amostras indiferenciadas de cDNA derivadas de MSC.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HUCPVCs exibem maior potencial de formação de agregados e níveis de expressão de CD49f em comparação com BMSCs:

Para induzir a diferenciação de hMSCs (ou seja, FTM HUCPVCs, termo HUCPVCs e BMSCs), suspensões unicelulares de MSCs indiferenciadas ou gotas pendentes contendo MSC (Tabela 1) foram transferidas para monocamadas primárias de cardiomiócitos de ratos para estabelecer co-culturas...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A diferenciação cardíaca de células-tronco tem sido sob desenvolvimento por mais de 2 décadas, com várias estratégias diferentes, sendo usadas para gerar células casos de fontes MSC. Muitas destas estratégias, no entanto, são ineficientes, e as condições usadas frequentemente não são representativas do ambiente transplantada células encontro na vivo.

Em contraste com os métodos existentes, o protocolo aqui apresentado utiliza uma combinação de camadas de alimentador cardíaca primária ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Clifford L. Librach é co-titular da patente: métodos de isolamento e o uso de células derivadas de tecido de cordão umbilical do primeiro trimestre, concedido no Canadá e Austrália.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecer os seguintes membros de pessoal e investigação pessoal para suas contribuições: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg e Andrée Gauthier-Fisher. Este trabalho foi financiado pelo fundo de pesquisa The Ontário - excelência em pesquisa (ORF-RE, rodada #7) e criar programa Inc..

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% Trypsin / EDTAGibco25200056para dissociação celular
Alpha-MEMGibco12571071para meios de cultura HUCPVC e BMSC.
Anticorpo anti-humano/camundongo conjugado com PE CD49fMarcador deintegrina313612
anticorpo humano Cx43/GJA1 conjugado com FC APCR& D SystemsFAB7737Amarcador de conexina 43 para anticorpo
HLA-A2 conjugado com FC FITCGenway Biotech Inc.GWB-66FBD2Marcador de imunogenicidade para
anticorpo anti-HLA-G [MEM-G/9] conjugado com FC FITCAbcamab7904Marcador de imunogenicidade para
anticorpo anti-SIRPA / CD172a de camundongo conjugado com FC FITCAbD Serotec / Bio-RadMCA2518FMarcador cardíaco para
anticorpo humano TRA-1-85 / CD147 conjugado com FC APCR & D SystemsFAB3195AMarcador de células humanas para anticorpos
TRA-1-85/CD147 humanos conjugadosFITC R& D SystemsFAB3195FMarcador de células humanas para anticorpo FC e FACS
Anti-conexina 43 / GJA1Abcamab11370Cx43. Para anticorpo
secundário de absorção cruzada IgG (H+L) anti-coelho de cabra ICC, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21428Para anticorpo ICC
anti-sarcomérico alfa actinina [EA-53]Abcamab9465aSARC. Para o
anticorpo secundário de absorção cruzada de cadeia pesada IgM anti-rato de cabra ICC, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21426Para ICC
Mef2C (D80C1) XP anticorpo de coelhoNew England BioLabs Ltd.5030SPara anticorpo
secundário IgG (H+L) anti-coelho ICC Donkey, Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21206Para anticorpo ICC
Anti-núcleos (HuNu) (clone 235-1)EMD MilliporeMAB1281Para estereomicroscópio ICC
MZ9.5LeicaPara agregados de imagem.
Microtubos de centrífuga de 1,5 mlAxygenMCT-150-CPara coloração de MSCs com corante fluorescente.
ImageJSoftware de processamento de imagem de código aberto.
Aria II Instalação BDUHN SickKids FC. Para classificação de células.
Células estromais mesequimais da medula ósseaLonzaPT-2501BMSCs
Albumina sérica bovinaSigma-AldrichA7030-100GBSA. Para preparar soluções para ICC
BrdUEMD MilliporeMAB3424Cuidado: BrdU é um forte teratogênico e suspeito de mutagênico. Certifique-se de um treinamento adequado e consulte o SDS antes de usar.
Canto IIBDUHN SickKids FC Facility. Para citometria de fluxo.
cDNA EcoDry PremixClontech/Takara639570Para preparação de cDNA para qPCR
CellTracker Green CMFDA DyeLife TechnologiesC7025Imagem fluorescente do citoplasma celular
Contador de células automatizado CountessInvitrogen Inc.C10227Para contagem de células
DMEM-F12Sigma-AldrichD6421Para meio de cultura de cardiomiócitos primários de ratos.
Gibco de solução salina tamponada com fosfato da Dulbecco10010023D-PBS, sem Ca2+, Mg2+
EVOSLife TechnologiesMicroscópio fluorescente interno
FACSCaliburBDInterno. Para citometria de fluxo.
Soro fetal bovino (Hyclone)GE HealthcareSH3039603FBS. Componente do meio de cultura celular.
Sondas de qPCR IDT Prime Timede Dados IntegradasFAM fluoróforohttp://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Meio de Montagem AquosaThermoScientificTA-030-FMPara armazenamento de células a serem submetidas a ICC
LSR II Instalação BDUHN SickKids FC. Para citometria de fluxo.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC Instalação. Para classificação de células.
Tecnologia de sinalização celularde soro de cabra normal5425SNGS. Usado na solução de bloqueio para a
lamínula da câmara ICC Nunc Lab-Tek II, 8 poçosThermo Scientific Nunc155409Para preparar amostras para o
surfactante ICC OmniPur Triton X-100EMD Millipore9410-OPComo um componente da solução permeabilizante ao preparar células para
ICC Paraformaldeído, solução a 16%,ciências de microscopia eletrônica15710Para fixar células para ICC.
Penicilina/estreptomicinaGibco15140122Componente do meio de cultura celular.
PrimersSigmaCustom Standard DNA Oligos, Dessalinizado, 0.2 μ molCTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Quorum Spinning Disk ConfocalZeissSickKids Imaging Facility
ReproCardio Cardiomiócitos derivados de células hiPSReproCellRCD001NControle positivo para qPCR
RNeasy mini kitQiagen74106Para isolar RNA para qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074Para qPCR com master mix
RPMI 1640GibcoA1049101Para MSC, meio de cocultura de monócitos.
Ensaios de primer TaqMan qPCRThermo Fisher Scientific4444556para qPCR
Trypan BlueLife TechnologiesT10282Coloração de células para viabilidade e contagem
TrypsinGibco272500108Para dissociação celular
VolocidadePerkin-ElmerVolocidade 6.3Software de imagem
0.2 μ filtro de poros mThermo Fisher Scientific566-0020Para esterilizar meios de cultura de tecidos
HERAcell 150i CO2 IncubadoraThermo Fisher Scientific51026410Para incubação de células
Dulbecco's fosfato tamponado salinoSigma-AldrichD8537PBS. 1X, Sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio
FórcepsAlmedic7727- A10-704Para entregar coração de rato. Pode usar qualquer fórceps semelhante.
TesouraFine Science Tools14059-11Para picar coração de rato. Tesouras curvas recomendadas.
Tubo de 50 mLBD Falcon352070Para coleta durante a coleta de cardiomiócitos e procedimentos gerais de cultura de tecidos Tubo de
15 mLBD Falcon352096Para procedimentos gerais de cultura
de tecidos Placas de 6 poçosThermo Scientific NuncCA73520-906Para cultura de
tecidos Placas de cultura de tecidos de 10 cmCorning25382-428Para formação de agregados
Microscópio Axiovert 40CZeissPara imagens de campo claro através da cultura de tecidos e do resto do protocolo
70 μ filtro de células mFisherbrand22363548Para garantir uma suspensão de célula única antes da citometria de fluxo ou classificação
Triton X-100EMD Millipore9410-1LUsado na solução de permeabilização para ICC
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Mancha usada durante a visualização da localização Cx43
Biolegend para com FC e FACS Tecnologias de grau EM

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