Protocolo otimizado para a extração de proteínas da válvula mitral humana

Resumo

A composição protéica da válvula mitral humana ainda é parcialmente desconhecida, pois sua análise é complicada pela baixa celularidade e, portanto, pela baixa biossíntese de proteínas. Este trabalho fornece um protocolo para extrair eficientemente proteínas para a análise do proteoma valvar mitral.

Resumo

A análise do proteoma celular pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares subjacentes às doenças devido ao desenvolvimento de tecnologias que permitem a identificação e quantificação em larga escala das proteínas presentes em sistemas biológicos complexos. O conhecimento adquirido a partir de uma abordagem proteômica pode potencialmente levar a uma Melhor compreensão dos mecanismos patogênicos subjacentes às doenças, permitindo a identificação de novos marcadores diagnósticos e de doenças prognósticas e, espero, de alvos terapêuticos. No entanto, a válvula mitral cardíaca representa uma amostra muito desafiadora para análise proteômica devido à baixa celularidade em proteoglicano e matriz extracelular enriquecida com colágeno. Isso torna desafiador extrair proteínas para uma análise proteômica global. Este trabalho descreve um protocolo que é compatível com análises de proteínas subseqüentes, como proteômica quantitativa e imunotransferência. Isso pode permitir a correlação de dados relacionadosG expressão de proteína com dados sobre a expressão quantitativa de mRNA e análise imuno-histoquímica não-quantitativa. Na verdade, essas abordagens, quando realizadas em conjunto, levarão a uma compreensão mais abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes às doenças, do mRNA à modificação da proteína pós-tradução. Assim, este método pode ser relevante para pesquisadores interessados ​​no estudo da fisiopatologia valvular cardíaca.

Introdução

Evidências recentes alteraram a compreensão dos papéis dos muitos mecanismos regulatórios que ocorrem após a síntese de mRNA. Na verdade, processos translacionais, pós-transcrição e proteolíticos podem regular a abundância e a função da proteína. O dogma - que diz que as concentrações de mRNA são proxies para as proteínas correspondentes, assumindo que os níveis de transcrição são o principal determinante da abundância de proteína - foi parcialmente revisado. De fato, os níveis de transcrição apenas prevêem parcialmente a abundância de proteína, sugerindo que os eventos pós-transcrição Ocorrem para regular as proteínas nas células ^{1 ,}

Protocolo

Neste protocolo, os corações humanos são coletados durante a explicação multiorgânica (tempo de isquemia de 4-12 h, média 6 ± 2 h) de doadores de múltiplos órgãos excluídos do transplante de órgãos por razões técnicas ou funcionais, apesar dos parâmetros ecocardiográficos normais. Eles são enviados ao Banco de Tecidos Cardiovasculares de Milão, Monzino Cardiologic Center (Milão, Itália) para o banco das válvulas aórtica e pulmonar. Os folhetos mitrais posteriores não são utilizados para fins clínicos, portanto são coletados durante o isolamento da válvula aórtica e pulmonar após o consentimento informado dos parentes dos doadores. O tecido para transplante e pesquisa....

Resultados

A extração e dissolução de proteínas no tampão de ureia é diretamente compatível com métodos proteômicos baseados em isolectrofocus (eletroforese bidimensional (2-DE) ¹¹ e foco isoelétrico em fase líquida (IEF) ¹² ) e com imunotransferência após diluição no tampão Laemmli ¹³ Contendo um coquetel inibidor de protease ¹⁴ .

Para método.......

Discussão

Um passo crítico deste protocolo é o uso de nitrogênio líquido para congelar a amostra e refrigerar o sistema de moagem. O uso de nitrogênio líquido evita a degradação biológica e permite o pulverização eficiente, mas requer treinamento específico para um manuseio seguro.

Neste protocolo apresenta um sistema de moagem para moagem de amostras porque pequenas amostras são difíceis de recuperar de argamassa e pilão padrão. Neste caso, pequenas amostras se espalham como um pó fino sobre a superf.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução			0,9 % NaCl
Eurocollins A	SALF	30874046	Meio de transporte de órgãos equilibrados. Combine 400 mL de Eurocollins A com 100 mL de Eurocollins B para obter meio balanceado Eurocollins
Eurocollins B	SALF	30874022	meio de transporte de órgãos balanceados. Combine 400 mL de Eurocollins A com 100 mL de Eurocollins B para obter meio balanceado Eurocollins
Wisconsin	Bridge life	RM/N 4081	Meio de transporte de órgão balanceado
Biohazard fluxo vertical de ar	Burdinola		Classe A Classificação GMP
Frasco Dewar Thermo	Scientific	Nalgene 4150-1000
Sistema de criomoedor Diagnóstico	OPS	CG 08-01	Sistema de moagem contendo almofarizes, pilões e chave de fenda
			de aço inoxidável
Espátula
Bisturi estéril descartável	Medisafe	MS-10
Tesoura			Autoclavável
Picaretas			Autoclavável
Cortina estéril descartável	Mon& Tex	3.307.08
Solução esterilizante com álcool			álcool isopropílico 70%
Solução esterilizante com peróxido de hidrogénio	6% Micropipeta
Tubos de centrífuga de 15 mL VWR	international	9278
Tubos de centrífuga de 1,7 mL	VWR internacional	PIER90410
Tampão			8 M ureia, 2 M tioureia, 4% p/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Ditiotreitol
Uréia	Sigma aldrich	U6504-1KG	Para ser usado para tampão de ureia
Thiourea	Sigma aldrich	T8656	Para ser usado para tampão de ureia
CHAPS	Sigma aldrich	C3023-5GR	Para ser usado para tampão
de ureiaDithiotreitol	Sigma aldrich	D0632-5G	Para ser usado para tampão de ureia
Seringa 50 mL	PIC		Para ser usado para filtrar Tampão de ureia
0,22 µ m filtro	Millipore	SLGP033RB	Para ser usado para filtrar tampão de ureia
PFTE Pilão, 2 mL	Kartell	6302	Parte do homogeneizador Potter-Elvehjem
Argamassa de vidro borossilicato	Kartell	6102	Parte do homogeneizador Potter-Elvehjem
Agitador	VELP scientifica	Agitador DLH	Para ser usado para homogeneização por Potter-Elvehjem
Bradford Ensaio de proteína	Laboratórios Bio-Rad	5000006
Rotador de tubo	Pbi International	F205
Nitrogênio
Folha
			poliestireno
de gelo
Centrífuga
			Para centrifugação de tubos de centrífuga de 1,7 mL a 13.000 x g
Freezer -80° C
Autoclave
de equilíbrio
Luvas criogênicas para nitrogênio
Luvas
Ventilação forçada profissional e forno			Para esterilização
Coquetel de inibidor de protease	Sigma aldrich	P8340-5ML	100X solução
ProteoExtract Protein Precipitation Kit	Calbiochem	539180
RapiGest	Waters	186001861
Cytoscape	www.cytoscape.org	versão 2.7	Plataforma de software para análise de ontologia genética
BiNGO		http://apps.cytoscape.org/apps/bingo versão 3.0.3	Plugin para análise de ontologia gênica
Anticorpo AlphaB Crystallin/CRYAB	Novus Biologicals	NBP1-97494	Anticorpo monoclonal de camundongo contra CryAB
Anticorpo Septina-11	Novus Biologicals	NBP1-83824	Anticorpo policlonal de coelho contra septina-11
Anticorpo FHL1	Novus Biologicals	NBP-188745	Anticorpo policlonal de coelho contra FHL-1
Anticorpo Dermatopontina	Novus Biologicals	NB110-68135	Anticorpo policlonal de coelho contra dermatopontina
Cabra Anti camundongo IgG HRP	Sigma aldrich	A4416-0.5ML	Anticorpo secundário para immunoblotting
Cabra Anti coelho IgG HRP	Bio-Rad laboratórios	170-5046	Anticorpo secundário para immunoblotting

salina Pinça de aço inoxidável de aço inoxidável de aço inoxidável isopropílico , 1 ml, com pontas de ureia líquidode alumínioCaixa de de gelo secode precisão para esterilização líquido de convecção de ar natural