Protocolo otimizado para a extração de proteínas da válvula mitral humana

Summary

A composição protéica da válvula mitral humana ainda é parcialmente desconhecida, pois sua análise é complicada pela baixa celularidade e, portanto, pela baixa biossíntese de proteínas. Este trabalho fornece um protocolo para extrair eficientemente proteínas para a análise do proteoma valvar mitral.

Abstract

A análise do proteoma celular pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares subjacentes às doenças devido ao desenvolvimento de tecnologias que permitem a identificação e quantificação em larga escala das proteínas presentes em sistemas biológicos complexos. O conhecimento adquirido a partir de uma abordagem proteômica pode potencialmente levar a uma Melhor compreensão dos mecanismos patogênicos subjacentes às doenças, permitindo a identificação de novos marcadores diagnósticos e de doenças prognósticas e, espero, de alvos terapêuticos. No entanto, a válvula mitral cardíaca representa uma amostra muito desafiadora para análise proteômica devido à baixa celularidade em proteoglicano e matriz extracelular enriquecida com colágeno. Isso torna desafiador extrair proteínas para uma análise proteômica global. Este trabalho descreve um protocolo que é compatível com análises de proteínas subseqüentes, como proteômica quantitativa e imunotransferência. Isso pode permitir a correlação de dados relacionadosG expressão de proteína com dados sobre a expressão quantitativa de mRNA e análise imuno-histoquímica não-quantitativa. Na verdade, essas abordagens, quando realizadas em conjunto, levarão a uma compreensão mais abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes às doenças, do mRNA à modificação da proteína pós-tradução. Assim, este método pode ser relevante para pesquisadores interessados ​​no estudo da fisiopatologia valvular cardíaca.

Introduction

Evidências recentes alteraram a compreensão dos papéis dos muitos mecanismos regulatórios que ocorrem após a síntese de mRNA. Na verdade, processos translacionais, pós-transcrição e proteolíticos podem regular a abundância e a função da proteína. O dogma - que diz que as concentrações de mRNA são proxies para as proteínas correspondentes, assumindo que os níveis de transcrição são o principal determinante da abundância de proteína - foi parcialmente revisado. De fato, os níveis de transcrição apenas prevêem parcialmente a abundância de proteína, sugerindo que os eventos pós-transcrição Ocorrem para regular as proteínas nas células ^{1 , 2} .

Além disso, as proteínas determinam a função da célula e, portanto, ditar seu fenótipo, que pode sofrer mudanças dinâmicas em resposta a fatores autocrinos, paracrinos e endócrinos; Mediadores transmitidos pelo sangue; temperatura; Tratamento medicamentoso; E desenvolvimento da doençaMent. Assim, uma análise de expressão focada no nível de proteína é útil para caracterizar o proteoma e desvendar as mudanças críticas que ocorrem como parte da patogênese da doença ³ .

Portanto, as oportunidades que a proteômica apresentar para esclarecer condições de saúde e doença são formidáveis, apesar dos desafios tecnológicos existentes. As áreas de pesquisa particularmente promissoras para as quais a proteômica pode contribuir: a identificação da expressão protéica alterada em qualquer nível ( ou seja, células inteiras ou tecido, compartimentos subcelulares e fluidos biológicos); Identificação, verificação e validação de novos biomarcadores úteis para o diagnóstico e prognóstico da doença; E, esperançosamente, a identificação de novos alvos de proteínas que podem ser utilizados para fins terapêuticos, bem como para a avaliação da eficácia e toxicidade da droga ⁴ .

Capturar a complexidade deO proteoma representa um desafio tecnológico. As ferramentas proteômicas atuais oferecem a oportunidade de realizar análises em grande escala e de alto débito para identificação, quantificação e validação de níveis de proteína alterados. Além disso, a introdução de técnicas de fracionamento e enriquecimento, visando evitar a interferência causada pelas proteínas mais abundantes, também melhorou a identificação de proteínas, incluindo as proteínas menos abundantes. Finalmente, a proteômica foi complementada pela análise de modificações pós-tradução, que emergem progressivamente como importantes moduladores da função protéica.

No entanto, a preparação da amostra e a recuperação de proteínas nos espécimes biológicos em análise continuam a ser as etapas limitantes no fluxo de trabalho proteômico e aumentam o potencial de possíveis armadilhas ⁵ . Na verdade, na maioria das técnicas de biologia molecular que devem ser otimizadas, os primeiros passos são homogeneização de tecidoLise de íons e células, especialmente durante a análise de proteínas de baixa abundância para as quais os métodos de amplificação não existem. Além disso, a natureza química das proteínas pode influenciar a sua própria recuperação. Por exemplo, a análise de proteínas altamente hidrofóbicas é muito desafiadora, porque elas se precipitam facilmente durante a focagem isoelétrica, enquanto as proteínas trans-membranas são quase insolúveis (revisada na Referência 5). Além disso, a variabilidade da composição do tecido cria uma barreira significativa ao desenvolvimento de um método de extração universal. Finalmente, porque quase todos os espécimes clínicos são de quantidade limitada, é essencial ativar a preparação de proteínas com recuperação máxima e reprodutibilidade a partir de quantidades mínimas de amostras ⁶ .

Este trabalho descreve um protocolo otimizado para a extração de proteínas a partir da valva mitral cardíaca humana normal, o que representa uma amostra muito desafiadora para análise proteômica. A válvula mitral normal é um compEstrutura lex situada entre o átrio esquerdo e o ventrículo esquerdo do coração ( Figura 1 ). Ele desempenha um papel importante no controle do fluxo sanguíneo do átrio para o ventrículo, evitando o refluxo e garantindo o nível adequado de fornecimento de oxigênio para todo o corpo, mantendo um débito cardíaco adequado. No entanto, muitas vezes é considerado um tecido "inativo", com baixa celularidade e poucos componentes, principalmente na matriz extracelular. Isso ocorre porque, em condições normais, as células intersticiais valvulares residentes (VICs) apresentam um fenótipo quiescente com baixa taxa de biossíntese de proteína ⁷ .

No entanto, demonstrou-se que, em um estado patológico, o número de VICs no spongiosa aumenta e sua síntese protéica é ativada, juntamente com outras mudanças funcionais e fenotípicas ⁸ . Portanto, não é surpreendente que os dados mínimos disponíveis emA literatura se concentra no análise de válvulas mitrais patológicas ^{9 , 10} , nas quais o aumento do número de VICs ativados pode explicar o número relativamente alto de proteínas identificadas.

Em conclusão, o presente protocolo pode servir para desenvolver a compreensão dos mecanismos patogênicos responsáveis ​​pelas valvopatias mitrais através do estudo dos componentes da proteína valvar mitral. De fato, uma maior compreensão dos processos patológicos subjacentes poderia ajudar a melhorar o manejo clínico das doenças valváticas, cujas indicações atuais de intervenção são em grande parte fundamentadas em considerações hemodinâmicas.

Protocol

Neste protocolo, os corações humanos são coletados durante a explicação multiorgânica (tempo de isquemia de 4-12 h, média 6 ± 2 h) de doadores de múltiplos órgãos excluídos do transplante de órgãos por razões técnicas ou funcionais, apesar dos parâmetros ecocardiográficos normais. Eles são enviados ao Banco de Tecidos Cardiovasculares de Milão, Monzino Cardiologic Center (Milão, Itália) para o banco das válvulas aórtica e pulmonar. Os folhetos mitrais posteriores não são utilizados para fins clínicos, portanto são coletados durante o isolamento da válvula aórtica e pulmonar após o consentimento informado dos parentes dos doadores. O tecido para transplante e pesquisa é coletado somente após o consentimento dos pais; Na folha de consentimento, eles autorizam (ou não) o uso do tecido cardíaco somente para pesquisa se não for adequado para uso clínico humano ( ou seja, problemas microbiológicos, funcionais e serológicos), seguindo as diretrizes do comitê de ética deMonzino Cardiologic Center.

1. Preparação da válvula mitral

1. Colhe a válvula mitral humana o mais rápido possível após a explicação do órgão (tempo de isquemia de 4-12 h).
2. Em uma sala limpa, remova o coração do saco de transporte contendo uma solução fria (4 ° C) ( isto é, solução salina ou Eurocollins de média equilibrada ou Wisconsin). Coloque-o em um balde e coloque-o em um gabinete de biossegurança (fluxo de ar vertical de risco biológico, classe A, classificação boas práticas de fabricação (GMP)) para prosseguir com a preparação da válvula.
3. Coloque o coração sobre uma camada estéril descartável no armário. Usando um bisturi descartable estéril, corte o coração completamente, perpendicularmente ao seu eixo principal, no nível dos ventrículos esquerdo e direito, a cerca de 4 cm do ápice.
4. Mova a aorta ascendente e a artéria pulmonar para exibir o telhado do átrio esquerdo.
5. Com pinças esterilizadas autoclaváveis ​​e picaretas, corte ao redor da aurícula esquerda naTelhado do atrial esquerdo, visando a válvula mitral e permitindo a identificação do grande folheto mitral (anterior) e do pequeno folheto mitral (posterior).
   NOTA: As comissuras medulares antero-laterais e posteriores definem a borda do folheto anterior e a área posterior.
6. Usando tesoura esterilizada autoclavável e fórceps não traumáticos, dissecar o átrio esquerdo e a espessura da parede do ventrículo ao redor da circunferência de toda a valva mitral .
7. Identificar a continuidade da válvula mitro-aórtica.
   NOTA: O ventrículo esquerdo contém toda a válvula mitral e acordes.
8. Separe o folheto da válvula mitral anterior do folheto da válvula mitral posterior, cortando o folheto posterior ao longo da inserção com o ventrículo (comissura).
9. Lave o folheto posterior na solução salina. Corte o folheto em pequenos pedaços (<1 cm ² ) e envolva-os individualmente em papel alumínio. Feche-os com nitrogênio líquido.
   Cuidado: siga procedimentos de segurança organizacional ao usar nitrogênio líquido.
   1. Desinfecte a mesa do armário com uma solução de álcool isopropílico a 70% e uma solução de peróxido de hidrogênio a 6% no final do procedimento.

2. Extração de proteínas

1. Use fórceps para retirar a amostra armazenada em nitrogênio líquido e coloque-a imediatamente em gelo seco enquanto ainda está envolvido na folha de alumínio. Não deixe a amostra descongelar durante as transferências.
2. Antes da moagem, esfriar a argamassa de porcelana / zircónio e pilões de um sistema de moedor ( por exemplo, CryoGrinder) , juntamente com a amostra, colocando-os em um balão Dewar contendo nitrogênio líquido (~ 500 mL).
   Cuidado: siga procedimentos de segurança organizacional ao usar nitrogênio líquido.
3. Coloque a argamassa e pilões em uma caixa de poliestireno contendo gelo seco. Remova a amostra da folha de alumínio e coloque-a na argamassa.
4. Grind tEle provoca com o grande pilão contra a argamassa 15-20 vezes, usando a chave de fenda para girar o pilão. Misture a amostra com a ponta de uma espátula pré-congelada durante o processo de moagem.
   1. Repita com o pequeno pilão.
5. Transfira a amostra de solo para um tubo previamente pesado ( por exemplo, tubo de centrífuga de 15 mL), invadindo o tubo, colocando-o sobre a argamassa e invadindo-os para mover a amostra para o tubo. Use uma espátula pré-refrigerada para recuperar todo o material da argamassa.
   1. Mantenha o tubo com a amostra em gelo seco para evitar a descongelação da amostra durante a transferência.
6. Calcule o peso líquido da amostra.
7. Limpe a argamassa e os pilões após cada amostra e descontaminar-os por autoclave ou aquecê-los a 200 ° C por 2 h.
8. Transfira a amostra em pó do tubo de centrífuga para o tubo de vidro de um homogeneizador por inversão.
9. Adicione buffe de ureia filtradaR (8 M de ureia, 2 M de tioureia, 4% p / v de CHAPS, 20 mM de Tris e 55 mM de ditiotreitol) no tubo de vidro, 200 μL de tampão de ureia por cada 10 mg de tecido em pó.
   NOTA: A amostra de pó residual deixada no tubo da centrífuga pode ser recuperada usando parte do volume calculado de tampão de ureia.
10. Homogeneizar a amostra usando um agitador equipado com uma argamassa de vidro de borosilicato e um pilão de politetrafluoroetileno (PTFE). Pressione lentamente o pilão na amostra com um movimento de torção (1.500 rpm) 10 vezes.
11. Recupere o sobrenadante e transfira-o para um tubo de centrífuga limpo de 1,7 mL. Mais uma vez extraie a amostra restante com tampão de uréia fresco, adicionando metade do volume utilizado durante a primeira extração.
12. Repita o passo 2.10.
13. Recupere o sobrenadante e combine-o com o sobrenadante do passo 2.11. Coloque o sobrenadante combinado em um rotator de tubo durante 30 min.
14. Centrifugue o tubo por 30 min a 13.000 xg e 4 ° C.
15. Recupere o sobrenadante eD mede a concentração de proteína usando o teste de proteína de Bradford, de acordo com as instruções do fabricante. Armazene a amostra a -80 ° C até o uso.

Results

A extração e dissolução de proteínas no tampão de ureia é diretamente compatível com métodos proteômicos baseados em isolectrofocus (eletroforese bidimensional (2-DE) ¹¹ e foco isoelétrico em fase líquida (IEF) ¹² ) e com imunotransferência após diluição no tampão Laemmli ¹³ Contendo um coquetel inibidor de protease ¹⁴ .

Para método...

Discussion

Um passo crítico deste protocolo é o uso de nitrogênio líquido para congelar a amostra e refrigerar o sistema de moagem. O uso de nitrogênio líquido evita a degradação biológica e permite o pulverização eficiente, mas requer treinamento específico para um manuseio seguro.

Neste protocolo apresenta um sistema de moagem para moagem de amostras porque pequenas amostras são difíceis de recuperar de argamassa e pilão padrão. Neste caso, pequenas amostras se espalham como um pó fino sobre a superf...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solução			0,9 % NaCl
Eurocollins A	SALF	30874046	Meio de transporte de órgãos equilibrados. Combine 400 mL de Eurocollins A com 100 mL de Eurocollins B para obter meio balanceado Eurocollins
Eurocollins B	SALF	30874022	meio de transporte de órgãos balanceados. Combine 400 mL de Eurocollins A com 100 mL de Eurocollins B para obter meio balanceado Eurocollins
Wisconsin	Bridge life	RM/N 4081	Meio de transporte de órgão balanceado
Biohazard fluxo vertical de ar	Burdinola		Classe A Classificação GMP
Frasco Dewar Thermo	Scientific	Nalgene 4150-1000
Sistema de criomoedor Diagnóstico	OPS	CG 08-01	Sistema de moagem contendo almofarizes, pilões e chave de fenda
			de aço inoxidável
Espátula
Bisturi estéril descartável	Medisafe	MS-10
Tesoura			Autoclavável
Picaretas			Autoclavável
Cortina estéril descartável	Mon& Tex	3.307.08
Solução esterilizante com álcool			álcool isopropílico 70%
Solução esterilizante com peróxido de hidrogénio	6% Micropipeta
Tubos de centrífuga de 15 mL VWR	international	9278
Tubos de centrífuga de 1,7 mL	VWR internacional	PIER90410
Tampão			8 M ureia, 2 M tioureia, 4% p/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Ditiotreitol
Uréia	Sigma aldrich	U6504-1KG	Para ser usado para tampão de ureia
Thiourea	Sigma aldrich	T8656	Para ser usado para tampão de ureia
CHAPS	Sigma aldrich	C3023-5GR	Para ser usado para tampão
de ureiaDithiotreitol	Sigma aldrich	D0632-5G	Para ser usado para tampão de ureia
Seringa 50 mL	PIC		Para ser usado para filtrar Tampão de ureia
0,22 µ m filtro	Millipore	SLGP033RB	Para ser usado para filtrar tampão de ureia
PFTE Pilão, 2 mL	Kartell	6302	Parte do homogeneizador Potter-Elvehjem
Argamassa de vidro borossilicato	Kartell	6102	Parte do homogeneizador Potter-Elvehjem
Agitador	VELP scientifica	Agitador DLH	Para ser usado para homogeneização por Potter-Elvehjem
Bradford Ensaio de proteína	Laboratórios Bio-Rad	5000006
Rotador de tubo	Pbi International	F205
Nitrogênio
Folha
			poliestireno
de gelo
Centrífuga
			Para centrifugação de tubos de centrífuga de 1,7 mL a 13.000 x g
Freezer -80° C
Autoclave
de equilíbrio
Luvas criogênicas para nitrogênio
Luvas
Ventilação forçada profissional e forno			Para esterilização
Coquetel de inibidor de protease	Sigma aldrich	P8340-5ML	100X solução
ProteoExtract Protein Precipitation Kit	Calbiochem	539180
RapiGest	Waters	186001861
Cytoscape	www.cytoscape.org	versão 2.7	Plataforma de software para análise de ontologia genética
BiNGO		http://apps.cytoscape.org/apps/bingo versão 3.0.3	Plugin para análise de ontologia gênica
Anticorpo AlphaB Crystallin/CRYAB	Novus Biologicals	NBP1-97494	Anticorpo monoclonal de camundongo contra CryAB
Anticorpo Septina-11	Novus Biologicals	NBP1-83824	Anticorpo policlonal de coelho contra septina-11
Anticorpo FHL1	Novus Biologicals	NBP-188745	Anticorpo policlonal de coelho contra FHL-1
Anticorpo Dermatopontina	Novus Biologicals	NB110-68135	Anticorpo policlonal de coelho contra dermatopontina
Cabra Anti camundongo IgG HRP	Sigma aldrich	A4416-0.5ML	Anticorpo secundário para immunoblotting
Cabra Anti coelho IgG HRP	Bio-Rad laboratórios	170-5046	Anticorpo secundário para immunoblotting