Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

Summary

A microinjecção de oócitos de rato é comumente utilizada tanto para a transgênese clássica ( ou seja, a integração aleatória de transgenes) e a segmentação de genes mediada por CRISPR. Este protocolo analisa os últimos desenvolvimentos em microinjeção, com ênfase particular no controle de qualidade e estratégias de genotipagem.

Abstract

O uso de camundongos geneticamente modificados tem contribuído significativamente para estudos em processos fisiológicos e patológicos in vivo . A injeção pronuclear de construções de expressão de DNA em oócitos fertilizados continua a ser a técnica mais utilizada para gerar camundongos transgênicos para superexpressão. Com a introdução da tecnologia CRISPR para segmentação gênica, a injeção pronuclear em oócitos fertilizados foi estendida à geração de camundongos knockout e knockin. Este trabalho descreve a preparação de DNA para injeção e a geração de guias CRISPR para segmentação gênica, com especial ênfase no controle de qualidade. Os procedimentos de genotipagem necessários para a identificação de potenciais fundadores são críticos. Estratégias inovadoras de genotipagem que aproveitam as capacidades de "multiplexação" do CRISPR são aqui apresentadas. Os procedimentos cirúrgicos também são delineados. Juntos, as etapas do protocolo permitirão a geração de genCamundongos eticamente modificados e para o estabelecimento subseqüente de colônias de ratos para uma infinidade de campos de pesquisa, incluindo imunologia, neurociência, câncer, fisiologia, desenvolvimento e outros.

Introduction

Os modelos animais, tanto em vertebrados quanto em invertebrados, têm sido fundamentais para examinar a fisiopatologia das condições humanas, como a doença de Alzheimer ^{1 , 2} . Eles também são ferramentas inestimáveis ​​para procurar modificadores de doenças e, em última instância, desenvolver novas estratégias de tratamento na esperança de uma cura. Embora cada modelo tenha limitações intrínsecas, o uso de animais como modelos sistêmicos inteiros é vital para a pesquisa biomédica. Isso ocorre porque o ambiente fisiológico metabólico e complexo não pode ser totalmente simulado na cultura de tecidos.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética e Cuidados Animais da Universidade de Nova Gales do Sul.

1. Preparação do Transgene (Integração Aleatória)

1. Eletroforese analítica em gel de agarose.
   1. Digite o plasmídeo para acelerar o transgene usando enzimas apropriadas (incubação de 1 hora) ou enzimas de rápida digestão (15 a 30 min de incubação) em um termociclador seguindo as recomendações do fabricante (veja a Figura 2A e sua legenda).
   2. Juntar um gel de agarose de ácido tris-acetato-etilenodiaminotetraacetico a 1% (TEA), corado com 0,5-1,0 μg / mL de....

Results

Abaixo, descrevem-se os fluxos de trabalho para microinjecção no caso de integração aleatória e orientação de genes mediada por CRISPR ( Figura 1 ).

Figura 1: Fluxo de trabalho típico para a geração de ratos modificados genéticamente. Para a integração aleatória, o transgene purificado é injetado.......

Discussion

Passos críticos dentro do protocolo

A geração de camundongos geneticamente modificados é conhecida por ser tecnicamente desafiadora. No entanto, o protocolo apresentado aqui é um método otimizado e simplificado que permite dominar e solucionar a técnica em tempo recorde. Há duas etapas necessárias para a conclusão bem-sucedida da técnica. Primeiro, a síntese de modelos de DNA linear (para a síntese de sgRNAs) pode ser conseguida sem cloreto de magnésio (MgCl2). No entanto, é altamente recomenda.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipeta 0,1-2,5 μ L	Eppendorf	4920000016
Micropipeta 2 - 20 μ L	Eppendorf	4920000040
Micropipeta 20 - 200 μ L	Eppendorf	4920000067
Micropipeta 100 - 1.000 μ L	Eppendorf	4920000083
Marcador de peso molecular	Bioline	BIO-33025	HyperLadder 1 kb
Marcador de peso molecular	Bioline	BIO-33056	HyperLadder 100 bp
Agarose		Bioline BIO-41025
EDTA buffer	Sigma-Aldrich	93296	10x - Diluir para 1x
brometo de etídio	Thermo Fisher Scientific	15585011
SYBR Safe gel stain	Invitrogen	S33102
Kit de extração de gel	Qiagen	28706
Kit de purificação PCR (Qiaquick)	Qiagen	28106
(Manifold)	Promega	A7231
Tampão de microinjeção sem nuclease	Millipore	MR-095-10F
	Millipore	UFC30GV00
Cas9 mRNA	Sigma-Aldrich	CAS9MRNA
plasmídeo expressor CRISPR (px330)	Addgene	42230
Água livre de nuclease	Sigma-Aldrich	W4502
Phusion polimerase	New England Biolabs	M0530L
T7 Kit de RNA rápido de alto rendimento	New England Biolabs	E2050S
Colunas de rotação de purificação de RNA (NucAway)	Thermo Fisher Scientific	AM10070
ssOligos	Sigma-Aldrich	OLIGO STANDARD
Plasmídeo doador	Thermo Fisher Scientific	GeneArt
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
KSOMaa meio de cultura de embriões	Zenith Biotech	ZEKS-100
Óleo mineral	Zenith Biotech	ZSCO-100
M2 Médio	Sigma-Aldrich	M7167
Citocalasina B	Sigma-Aldrich	C6762
Bocal	Sigma-Aldrich	A5177
Microcapilares de vidro	Sutter Instrument	BF100-78-10
Proteinase K	Applichem	A3830.0100
Dumont # 5 fórceps	Ferramentas de Belas Ciências	91150-20
Tesoura de íris	Ferramentas de Belas Ciências	91460-11
Grampo de vaso	Fine Science Tools	18374-43
Clipes de ferida	Ferramentas de Belas Ciências	12040-01
Aplicador de clipes	Ferramentas de Belas Ciências	12018-12
Micro-tesouras	Ferramentas de Belas Ciências	15000-03
Fina Cauterizer		18000-00
Suturas cirúrgicas não absorvíveis (Ethilon 3-0)	Ethicon	1691H
5% CO2 incubadora	MG Scientific	Galaxy 14S
Espectrofotômetro	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000c
Termociclador	Eppendorf	6321 000.515
Configuração de eletroforese	BioRad	1640300
Transiluminador UV	BioRad	1708110EDU
Termociclador	Eppendorf	6334000069
Microscópio estereoscópico	Olympus	SZX7
Microscópio invertido	Olympus	IX71
2x Micromanipuladores	Eppendorf	5188000.012
Oócitos manipulador	Eppendorf	5176000.025
Microinjetor (Femtojet)	Eppendorf	5247000.013
Camundongos C57BL/6J cepa	Australian BioResources	C57BL/6JAusb