Method Article

Análise das Interações Proteína-Proteína e Co-localização entre Componentes das Juntas Abertas, Apertadas e Aderentes nas Glândulas Mamárias Murinas

DOI:

10.3791/55772

⸱

May 30th, 2017

 , 
1INRS, Institut Armand-Frappier, 2Biomed, UQAM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As junções intercelulares são requisitos para funções e desenvolvimento específicos do estágio da glândula mamária. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para o estudo das interações proteína-proteína (IPPs) e co-localização usando glândulas mamárias murinas. Estas técnicas permitem a investigação da dinâmica da associação física entre junções intercelulares em diferentes estádios de desenvolvimento.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As interações célula-célula desempenham um papel fundamental na preservação da integridade do tecido e da barreira entre os diferentes compartimentos da glândula mamária. Essas interações são fornecidas por proteínas juncionais que formam nexos entre células adjacentes. A mislocalização da proteína juncional e as associações físicas reduzidas com seus parceiros de ligação podem resultar na perda de função e, consequentemente, na disfunção orgânica. Assim, identificar a localização da proteína e as interações proteína-proteína (IPPs) em tecidos normais e relacionados à doença é essencial para encontrar novas evidências e mecanismos que conduzam à progressão de doenças ou alterações no estado de desenvolvimento. Este manuscrito apresenta um método de dois passos para avaliar PPIs nas glândulas mamárias murinas. Na seção de protocolo 1, é descrito um método para realizar co-imunofluorescência (co-IF) utilizando anticorpos criados contra as proteínas de interesse, seguido por anticorpos secundários marcados com fluoroquemas. Embora co-IF tudoOws para a demonstração da proximidade das proteínas, permite estudar suas interações físicas. Portanto, um protocolo detalhado para co-imunoprecipitação (co-IP) é fornecido na seção de protocolo 2. Esse método é usado para determinar as interações físicas entre proteínas, sem confirmar se essas interações são diretas ou indiretas. Nos últimos anos, as técnicas de co-IF e co-IP demonstraram que certos componentes das junções intercelulares co-localizam e interagem juntos, criando nexos juncionais dependentes do estágio que variam durante o desenvolvimento das glândulas mamárias.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O crescimento e desenvolvimento das glândulas mamárias ocorre principalmente após o nascimento. Este órgão se remodela constantemente ao longo da vida reprodutiva de um mamífero 1 . O epitélio da glândula mamária adulta é constituído por uma camada interna de células epiteliais luminal e uma camada externa de células basais, composta principalmente de células mioepiteliais, cercadas por uma membrana basal 2 . Para uma boa revisão sobre a estrutura e desenvolvimento da glândula mamária, o leitor pode se referir ao Sternlicht 1 . As interações célula-célula através das juntas gap (GJ), tight (TJ) e adherens (AJ) são necessárias para o desenvolvimento e função normal da glândula 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Os principais componentes dessas junções na glândula mamária murina são Cx26, Cx30, Cx32 e Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 e -7 eZO-1 (TJ); E E-caderina, P-caderina e β-catenina (AJ) 7 , 8 . Os níveis de expressão dessas diferentes proteínas juncionais variam de maneira dependente do estágio durante o desenvolvimento da glândula mamária, sugerindo requisitos diferenciais de interação célula-célula 9 . GJ, TJ e AJ estão ligados estruturalmente e funcionalmente e ligam outras proteínas estruturais ou reguladoras aos locais vizinhos de células adjacentes, criando assim um nexo juncional 10 . A composição do nexo juncional pode impactar a ponte com o citoesqueleto subjacente, bem como a permeabilidade e a estabilidade do nexo e, conseqüentemente, influenciar a função da glândula 8 , 9 , 10 , 11 . Os componentes das junções intercelulares que residem em nexos de junção ou interagem uns com os outros em difOs estádios de desenvolvimento do desenvolvimento da glândula mamária foram recentemente analisados ​​utilizando co-imunofluorescência (co-IF) e co-imunoprecipitação (co-IP) 9 . Enquanto outras técnicas permitem a avaliação da associação funcional entre proteínas, esses métodos não são apresentados neste manuscrito.

Como as proteínas apenas atuam sozinhas para funcionar, o estudo das interações proteína-proteína (IPPs), como transduções de sinais e cascatas bioquímicas, é essencial para muitos pesquisadores e pode fornecer informações significativas sobre a função das proteínas. A co-IF e a análise microscópica ajudam a avaliar algumas proteínas que compartilham o mesmo espaço subcelular. No entanto, o número de alvos é limitado pelos anticorpos, que devem ser criados em diferentes animais e pelo acesso a um microscópio confocal equipado com diferentes lasers de comprimento de onda e um detector espectral para multiplexação. O Co-IP confirma ou revela interações físicas de alta afinidade entreEen duas ou mais proteínas que residem dentro de um complexo protéico. Apesar do desenvolvimento de novas técnicas, como a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) 12 e o ensaio de ligação de proximidade (PLA) 13 , que pode detectar simultaneamente a localização e as interações de proteínas, o co-IP continua sendo uma técnica apropriada e acessível para estudar interações entre Proteínas endógenas.

O método passo-a-passo descrito neste manuscrito facilitará o estudo da localização da proteína e PPIs e apontará armadilhas para evitar ao estudar PPIs endógenos nas glândulas mamárias. A metodologia começa com a apresentação dos diferentes procedimentos de preservação dos tecidos necessários para cada técnica. A Parte 1 apresenta como estudar a co-localização de proteínas em três etapas: i) o corte das glândulas mamárias, ii) a rotulagem dupla ou tripla de diferentes proteínas usando a técnica co-IF, e iii) a imagem deLocalização de proteínas. A Parte 2 mostra como precipitar uma proteína endógena e identificar suas proteínas que interagem em três etapas: i) preparação do lisado, ii) imunoprecipitação indireta da proteína e iii) identificação do parceiro de ligação por SDS-PAGE e Western blot. Cada passo deste protocolo é otimizado para os tecidos das glândulas mamárias de roedores e gera resultados de alta qualidade, específicos e reprodutíveis. Este protocolo também pode ser usado como ponto de partida para estudos de PPI em outros tecidos ou linhas celulares.

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Protocol

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Todos os protocolos de animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados de Animais da Universidade (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canadá).

1. Identificando Co-localização de Proteína

  1. Do tecido para lâminas microscópicas
    NOTA: Os tecidos e as seções devem ser manuseados em gelo seco.
    1. Impeça as glândulas mamárias de um animal (para uma descrição completa deste procedimento, consulte Plante et al. ) 14 .
    2. Incorporar o tecido excisado no meio de congelação / montagem em gelo seco. Adicione meio suficiente para cobrir a glândula. Quando o meio é solidificado, transfira os tecidos para um congelador a -80 ° C para uso posterior 9 .
    3. Usando um cryomicrotome ajustado em ≤ -35 ​​° C, corte os tecidos em secções de 7-10 μm de espessura e coloque-os em lâminas de microscópio.
      NOTA: Quando possível, coloque duas seções em cada slide; A seção esquerda será usada como umControle negativo para verificar a especificidade dos anticorpos e a autofluorescência do tecido, enquanto o lado direito será rotulado com os anticorpos.
    4. Mantenha as secções a -80 ° C para uso posterior.
  2. Co-IF coloração
    1. Recupere as lâminas microscópicas apropriadas do congelador e conserte imediatamente as secções imergindo-as em formaldeído 4% durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT).
    2. Em seguida, mergulhe os slides em solução salina tamponada com fosfato (PBS) à RT. Deixe os slides em PBS na RT até prosseguir para o próximo passo.
    3. Circule cada seção do slide usando uma barreira hidrofóbica comercialmente disponível ou uma caneta de laboratório repelente de água (veja a Tabela de Materiais ). Tenha cuidado para não tocar o tecido. Adicione imediatamente gotas de PBS ao tecido e coloque o slide em uma câmara de histologia úmida pelo restante do procedimento.
      NOTA: As secções de tecido devem permanecer hidratadas. AlternativaUse uma caixa com uma tampa e coloque toalhas de papel molhadas na parte inferior.
    4. Bloqueie cada seção de tecido com 100-200 μL de albumina de soro bovino a 3% (BSA) - solução salina tamponada com Tris (TBS) -0,1% de polissorbato 20 (ver Tabela de Materiais ) durante 30 min à TA. Enquanto as amostras estão bloqueando, prepare as soluções de anticorpos primário e secundário diluindo os anticorpos em TBS-0.1% polissorbato 20.
      NOTA: A concentração requerida para o anticorpo é fornecida pelo fabricante; Veja a Tabela de Materiais e as Figuras 1 e 2 para exemplos, bem como Dianati et al. 9 . Embora não seja necessário trabalhar no escuro ao usar a maioria dos anticorpos conjugados com fluoróforos, evite expor as soluções de anticorpos ou os tecidos coloridos a luz intensa e brilhante.
    5. Remova a solução de bloqueio por aspiração e incube as seções em 100-200 μL do anticorpo primário diluído durante 60 min à TA. AlternativelIn, incubar com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C.
    6. Remova a solução de anticorpo primário por aspiração e lave as secções com 250-500 μL de TBS-0,1% de polissorbato 20 durante 5 min. Remova a solução de lavagem por aspiração e repita a lavagem duas vezes.
    7. Remova a solução de lavagem por aspiração e incube as secções com 100-200 μL do anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado durante 60 min à TA.
    8. Remova a solução de anticorpo secundário por aspiração e lave as secções com 250-500 μL de TBS-0,1% de polissorbato 20 durante 5 min. Remova a solução de lavagem e repita duas vezes.
    9. Repita o passo 2.5-2.8 utilizando a combinação apropriada de anticorpos primários e secundários para a (s) proteína (s) subsequente (s) de interesse.
    10. Remova a solução de lavagem por aspiração e realize a coloração dos núcleos incubando a seção com 100-200 μL de 1 mg / mL de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) em TBS-0,1% de polissorbato 20 durante 5 min aRT.
    11. Remova a solução DAPI por aspiração e monte as lâminas usando um meio de montagem solúvel em água e não fluorescente (veja a Tabela de Materiais ) e lamínulas. Prossiga um slide de cada vez.
      NOTA: Incubar a mancha do núcleo por mais de 5 min não alterará a intensidade da coloração. Alternativamente, remova a solução DAPI em todos os slides e incuba os tecidos em PBS enquanto monta as lâminas.
    12. Coloque as lâminas plana em uma geladeira de 4 ° C por pelo menos 8 h. Proceda à imagem microscópica de fluorescência (ver Figuras 1 e 2 ).
  3. Imagem microscópica
    1. Visualize os anticorpos secundários conjugados com fluoróforos usando um microscópio confocal equipado com os vários lasers necessários para excitar os fluoróforos em seus comprimentos de onda específicos.
      Nota: Para poder visualizar canais e alvéolos, sugere-se um objetivo 40X com uma abertura numérica de 0,95. Um exemploE da configuração específica é fornecida na Figura 1 .
    2. Verifique a localização de cada proteína individualmente, digitalizando a imagem um comprimento de onda no momento.
      Nota: Nesta fase, é importante analisar criticamente a localização das proteínas juncionais. Para poder formar nexos de junção, estas proteínas devem ser localizadas na membrana plasmática.
    3. Determine a co-localização das proteínas pela fusão das imagens digitalizadas com os lasers nos diferentes comprimentos de onda.
      Nota: A co-localização das proteínas pode ser visualizada pela mudança de cor resultante da emissão de dois ou mais fluoróforos no mesmo local e pode ser medida usando o software apropriado ( Figuras 1 e 2 , veja também a Referência 9).

2. Estudando PPIs

NOTA: As glândulas mamárias abdominais devem ser usadas para estudar IPP, pois as glândulas torácicas estão em estreita associação com o peitoralMúsculos. Esqueça as glândulas mamárias (para uma descrição completa deste procedimento, consulte Plante et al .) 14 e mantenha-os a -80 ° C para uso posterior.

  1. Preparação de lisado
    1. Coloque papel de pesagem e 2 mL de tubos de microcentrífuga em gelo seco para pré-esfriar antes de prosseguir com os próximos passos.
    2. Pegue o tecido da glândula mamária a partir de -80 ° C e mantenha-os em gelo seco.
    3. Pesar os tecidos nos papéis de pesagem pré-refrigerados e depois transferir o tecido para tubos de microcentrífuga de 2 mL (pega em gelo seco). Use entre 50 e 100 mg de tecido por amostra. Mantenha o tecido em gelo seco até o passo 2.1.5.
    4. Prepare a quantidade necessária de tampão de lise detergente triplo suplementado com NaF, NaVO 3 e inibidor de protease / fosfatase, conforme indicado na Tabela de Materiais , utilizando as seguintes fórmulas. Ratos: tampão necessário (μL) = peso do tecido do mouse (mg) x 3; Rato: necessárioTampão (μL) = peso do tecido do rato (mg) x 5.
    5. Adicione a quantidade necessária de tampão de lise gelada (calculado no passo 2.1.4) ao tubo de 2 mL contendo o tecido.
      NOTA: Nas etapas 2.1.5-2.1.6, avance com um único tubo por vez.
    6. Homogeneizar o tecido por 30-40 s usando homogeneização contínua em um moedor de tecido; Sempre mantenha o tubo no gelo. Ajuste o homogeneizador de tecido em velocidade média e mova suavemente o moedor para cima e para baixo dentro do tubo.
    7. Repita os passos 1.6 e 1.7 com os outros tubos.
    8. Incubar os lisados ​​no gelo durante 10 a 30 minutos.
    9. Centrifugue os tubos a 170 xg durante 10 min a 4 ° C.
    10. Enquanto isso, identifique 6-10 tubos de microcentrífuga (0.6 mL) para cada amostra e mantenha-os em gelo.
    11. Assim que a centrifugação for feita, verifique os tubos. Certifique-se de que eles contêm uma camada superior de lisados ​​gordos, límpidos, amarelos a rosa (dependendo do estágio de desenvolvimento) e uma pelota.
    12. Crie um buraco na camada lipídicaUsando uma ponta de pipeta de 200 μL para acessar a fase líquida. Mude a ponta e cole o lisado sem perturbar o sedimento ou aspirar a camada lipídica. Alíquota o lisado em tubos pré-rotulados em gelo (passo 2.1.11) e guarde-os a -80 ° C.
    13. Use uma alíquota para quantificar a concentração de proteína usando um kit disponível comercialmente disponível (veja a Tabela de Materiais ).
  2. Imunoprecipitação indireta
    1. No gelo, descongelar duas alíquotas do total de lisados ​​de glândula mamária preparados anteriormente.
      NOTA: Uma alíquota será usada para o IP da proteína alvo, enquanto a outra servirá como controle negativo.
    2. Coletar 500-1,000 μg do lisado e diluí-lo em PBS para atingir um volume final de 200 μL em cada tubo de 1,5 mL.
      NOTA: A quantidade de lisado a ser usado depende da abundância da proteína de interesse e da eficiência do anticorpo (veja a Figura 3 para umaN exemplo, bem como a tabela de materiais ). Para otimizar para cada alvo, devem ser utilizadas diferentes quantidades de lisado ( isto é, 500, 750 e 1000 μg) e anticorpo ( isto é, 5, 10 e 20 μg). Prossiga com as seguintes etapas (2.2.3-2.3.7.4).
    3. Adicione o anticorpo contra o antígeno de interesse para o primeiro tubo de lisado e mantenha-o no gelo.
      NOTA: A quantidade necessária geralmente é sugerida na folha de instruções fornecida por cada empresa (consulte a Tabela de Materiais ).
    4. No segundo tubo, prepare um controle negativo adicionando a mesma concentração de controle de isotipo IgG como o anticorpo usado no passo 2.2.3.
    5. Incubar os tubos durante a noite a 4 ° C em um misturador de rolos de tubo a baixa velocidade.
    6. No dia seguinte, adicione 50 μL de pérolas magnéticas a novos tubos de 1,5 mL para pré-lavagem.
      1. Selecione as pérolas magnéticas Protein A ou Protein G com base na afinidade relativa do anticorpo.
      2. É importante evitar o uso de grânulos agregados; Misture suavemente a suspensão do talão até que seja novamente suspenso antes de adicioná-lo aos tubos.
    7. Coloque os tubos contendo as contas no suporte magnético e permita que as pérolas migrem para o ímã. Remova o buffer de armazenamento das contas usando uma pipeta de 200 μL.
    8. Lavar as esferas adicionando 500 μL de PBS-0,1% de polissorbato 20 e agitar os tubos vigorosamente durante 10 s.
    9. Coloque os tubos de volta no suporte magnético e permita que os grânulos migrem para o ímã.
    10. Remova o excesso de tampão de lavagem por pipetagem com uma pipeta de 200 μL.
    11. Adicionar o complexo de reação (anticorpo-lisado) do passo 2.2.5 às esferas e incubar durante 90 minutos à TA no misturador de rolos.
    12. Coloque os tubos no suporte magnético e permita que os grânulos migrem para o ímã. Usando uma pipeta de 200 μL, aspirar e descartar o lisado e colocar os tubos no gelo.
    13. Lave a contaS adicionando 500 μL de PBS, colocando os tubos no suporte magnético e removendo o líquido usando uma pipeta de 200 μL. Repita este passo de lavagem. Durante as etapas de lavagem, evite o vortex e mantenha as amostras no gelo.
    14. Lave as contas uma vez com PBS-0.1% de polissorbato 20 sem vortexar e descarte o último tampão de lavagem usando uma ponta de pipeta de 200 μL.
    15. Para eluir, adicione 20 μL de glicina ácida 0,2 M (pH = 2,5) aos tubos e agite-os durante 7 minutos no misturador de rolos.
    16. Centrifugar a alta velocidade por alguns segundos (rotação rápida) e coletar o sobrenadante em um tubo gelado fresco.
    17. Repita as etapas 2.2.14 e 2.2.15 para cada tubo.
      NOTA: O volume final será de 40 μL.
    18. Adicione 10 μL de tampão 4x Laemmli à amostra eluída de 40 μL do passo 2.2.16.
      NOTA: A cor ficará amarela devido ao pH ácido.
    19. Adicione imediatamente 1 M Tris (pH = 8), uma gota por vez, à amostra eluída do passo 2.2.18 até sua corFica azul. Prossiga para os próximos tubos.
    20. Ferver as amostras do passo 2.2.18 a 70-90 ° C durante 10 min. Proceda imediatamente à eletroforese em gel. Alternativamente, transfira as amostras para um congelador a -80 ° C até o carregamento.
  3. Aplicação a jusante: eletroforese em gel seguida de Western Blot
    1. Prepare a separação e o empilhamento de gel de acrilamida SDS-PAGE (1,5 mm de espessura) seguindo os procedimentos padrão 15 .
      NOTA: A escolha do gel (8-15% de acrilamida, gradiente: ver a Tabela de Materiais ) deve ser determinada com base no tamanho molecular da proteína a ser precipitada e dos potenciais parceiros de ligação a serem analisados. Essas proteínas devem ser resolvidas umas das outras para permitir a imunodetecção adequada.
    2. Destilar as amostras ligadas à imunoprecipitação (IP) (passo 2.2.20) no gelo.
    3. Prepare lisins proteicos das mesmas amostras (usado para o procedimento IP acima). Use 50Μg de lisado total e adicione o tampão de amostra 4X Laemmli. Cozinhe as amostras a 70-90 ° C por 5 min e coloque no gelo até o carregamento.
      NOTA: Estas amostras serão carregadas ao lado da amostra IP eluída para demonstrar a presença de proteínas precipitadas no lisado total.
    4. Carregar os lisados ​​preparados a partir do passo 2.3.3 e as amostras precipitadas do passo 2.2.20 lado a lado em um gel de acrilamida e executá-los em tampão de corrida (10x tampão corrente: 30,3 g de Tris, 144,1 g de glicina e 10 G de SDS em 1 L de água destilada) a 100 V por aproximadamente 95 min, ou até a borda das proteínas migratórias chegar ao fundo do gel.
    5. Transfira os géis para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF usando um protocolo padrão 9 , 15 .
    6. Bloqueie a membrana durante 1 h em um balancim em baixa velocidade em 5% de TTBS com leite seco (Tris 20 mM, NaCl 500 mM e polissorbato a 0,05% 20).
    7. Identifique se a precipitação foi sucObrigado.
      1. Sonda a membrana utilizando o primeiro anticorpo contra a proteína precipitada, diluída em 5% de TTBS de leite seco na concentração recomendada pelo fabricante, durante a noite a 4 ° C em uma plataforma de balanço com agitação lenta.
        NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter recomendações.
      2. No dia seguinte, lave a membrana 3 vezes por 5 min cada uma com TTBS em uma plataforma de balanço com alta agitação.
      3. Incube a membrana no anticorpo secundário apropriado conjugado com peroxidase de rábano (HRP), diluído em TTBS, durante 1 h na RT em uma plataforma de balanço com agitação lenta.
        NOTA: Alternativamente, um anticorpo secundário conjugado com um fluorochrome pode ser usado se um aparelho apropriado para detectar o sinal estiver disponível.
      4. Execute 3 a 6 lavagens, cada uma por 5 min, com TTBS em uma plataforma de balanço com alta agitação. Analisar o sinal do anticorpo secundário incubando a membrana com um comercialmenteSolução luminólica disponível (consulte a Tabela de Materiais ) e siga as instruções do fabricante. Detectar o sinal usando um sistema de imagem de quimioluminiscência (ver Tabela de Materiais ).
        NOTA: Para um protocolo detalhado sobre análise de transferência de Western, consulte a Referência 16.
    8. Para identificar as proteínas que interagem, execute as etapas 2.3.7.1-2.3.7.4 usando os anticorpos apropriados na mesma mancha.
      NOTA: Se as proteínas estão interagindo, os parceiros de ligação serão co-imunoprecipitados com a proteína alvo e, portanto, serão detectáveis ​​por Western Blot. O passo 2.3.8 pode ser repetido com mais anticorpos para determinar se outras proteínas residem no mesmo complexo de proteínas, desde que os pesos moleculares das proteínas diferem o suficiente para estar bem separados no gel e na membrana.
    9. Para confirmar que os parceiros de ligação identificados não são artefatos, o IP recíproco deve ser realizado.
      NOTA: isto é executado repetindoPassos 2.2.1-2.2.20 com o mesmo lisado, mas precipitando um dos parceiros de ligação identificados no passo 3.8. Em seguida, as etapas 3.1-3.8 são repetidas usando o anticorpo primário contra a primeira proteína de interesse.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para determinar se os componentes GJ, AJ e TJ podem interagir juntos na glândula mamária, os ensaios co-IF foram realizados pela primeira vez. Cx26, uma proteína GJ e β-Catenin, uma proteína AJ, foram sondados com anticorpos específicos e revelaram-se com anticorpos conjugados com mouse-647 (verde, pseudocolor) e cabra-568 (vermelho), respectivamente ( Figura 1B e C ) . Os dados mostraram que eles co-localizam na membrana celular das células epiteliais n...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As interações célula-célula através das junções são necessárias para o bom funcionamento e desenvolvimento de muitos órgãos, como a glândula mamária. Estudos demonstraram que as proteínas juncionais podem regular a função e a estabilidade uns dos outros e ativar a transdução do sinal ao se amarrar na membrana celular 10 . Os protocolos apresentados no manuscrito atual forneceram achados interessantes sobre expressão, localização e interação diferencial de proteínas juncionais durante o desenvolvi...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O IP é financiado por uma doação do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC nº 418233-2012); Um Fundo de Pesquisa do Québec-Saúde (FRQS), um prêmio de carreira da Fundação do Câncer do Quebec e uma doação Leader Founds da Fundação Canadense para Inovação. ED recebeu uma bolsa de estudos da Fondation universitaire Armand-Frappier.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Linhagem e estágio de camundongosSt. Constant, Quebec, CanadáC57BL / 6 Femals; dia de gravidez 18 (P18) e dia de lactação 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (estoque)1) Dissolver 80 g de NaCl (F.W.: 58,44), 2 g de KCl (F.W. 74,55), 26,8 g Na2HPO4· 7H2O (F.W. 268,07) e 2,4 g KH2PO4 (F.W.:136,09) em 800 mL de água destilada;
2) Ajustar o PH para 7,4;
3) Adicione água para atingir o volume final de 1 L.
TBS 10x (estoque)1) Dissolver 60,5 g de TRIS, 87,6 g de NaCl em 800 mL de água destilada;
2) Ajuste o pH para 7,5;
3) Adicione água até chegar ao volume final de 1 L.
Parte 1: Imunofluorescência
Meios de congelamentoVWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canadá95067-840Composto de seções congeladas VMR 
MicrotomeMississauga, ON, Canadá956640Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
LâminasC.L. Sturkey, Inc. Les Produits  Scientifiques  ESBE  St-Laurent, QC, CanadáBLM1001CLâminas revestidas a ouro de alto perfil
Caneta de PapanicolauCedarlane, Burlington, ON, Canadá8899Caneta Super PAP, Thermo Fisher
Scientific Lâminas microscópicasFisher Scientific, Burlington, ON, Canadá12-550-15Fisherbrand  Lâminas de microscópio Superfrost Plus
FormaldeídoBioShop Canada Inc, Burlington, ON, CanadáFOR201.1Forlmadehyde
(BSA)Santa Cruz Biotechnology, Inc, Califórnia, EUA
Solução3% BSA em TBS
Solução de lavagemTBS-Tween 20 0,1%
Polissorbato 20Oakville, ON, CanadáP 9416Tween 20, Sigma-Aldrich
Mídia de montagemCedarlane, Burlington, ON17984-25(EM)Fluoromount-G
Anticorpos primários e secundáriosSinalização celular, Beverly, MA, EUAVeja comentáriosE-Caderina (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Sinalização celular) com anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Sinalização celular 
Anticorpos primários e secundários Tecnologias de vida, Waltham, MA, EUA e Cell Signaling, Beverly, MA, EUAVeja os comentáriosClaudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) com IgG anti-coelho Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
Anticorpos primários e secundários Santa Cruz Biotechnology, Inc, Califórnia, EUA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canadá Ver comentáriosβ-Anticorpo Catenina (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) com anti-IgG de cabra (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Sonda Molecular (Fisher Scientific)
Anticorpos primários e secundários Tecnologias de vida, Waltham, MA, EUA e Cell Signaling, Beverly, MA, EUAVer ComentáriosConnexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) com IgG anti-mouse Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Coloração de núcleosFisher Scientific, Burlington, ON, CanadáD1306DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato) 1/1,000 in PBS
Microscópio fluorescenteNikon Canadá, Mississauga, On, CanadáLaser microscópico confocal Nikon A1R+ equipado com um detector espectral 
Software de análise de imagens IFNikon Canada, Mississauga, On, CanadaSoftware NIS-elements (versão 4)
Parte 2: Imunoprecipitação
Trim Detergente Tampão de lise (100  mL) pH=8,01) Misture 50 mM TRIS (F.W.: 121,14), 150  mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Azida de Sódio, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Desoxicolato de Sódio em 80 mL destilado H2O.
2) Ajuste o pH para 8.0 com HCl 6  N (~0,5  mL).
3) Ajuste o volume para 100  mL. Guarde na geladeira.
No dia da extração da proteína, use 1/100 NaVo3, 1/100 inibidor de protease/fosfatase e 1/25 NAF na quantidade calculada de tampão de lise de detergente triplo:
Solução de fluoreto de sódio (estoque) 1.25  M (F.W.: 41.98), Solução de Ortovanadato de Sódio (estoque) 1  M (F.W.: 183.9)
Inibidor de protease/fosfataseFisher Scientific, Burlington, ON78441Coquetel Halt Protease e Inibidor de Fosfatase, sem EDTA (100x)
Dosagem de proteínaThermo Scientific, Rockford, Illinois, EUA23225Kit de ensaio de proteína Pierce BCA 
Triturador de tecidosFisher Scientific, Burlington, ONFTH-115Power 125, Modelo FTH-115
Grânulos magnéticos e suporteMillipore, Etobicoke, ON, CanadáPureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Solução de lavagem para IPPBS ou PBS-Tween20 0,1% dependendo da etapa
Anticorpos primários para imunoprecipitaçãoSinalização celular, Beverly, MA, EUAVer ComentáriosIgG Coelho (coelho (DA1E) mAb IgG Controle de isotipo (#3900s) (Sinalização celular) 0,5 µ L/200 e micro; L
Anticorpos primários para imunoprecipitaçãoSinalização celular, Beverly, MA, EUAVer comentáriosCamundongo IgG camundongo (G3A1) mAb IgG Controle de isotipo (#5415s) (Sinalização celular) 0,5 µ L/200 e micro; L
Anticorpos primários para imunoprecipitaçãoSigma-Aldrich, Oakville, ON, CanadáVer comentáriosConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4  µ L/200  µ L
Anticorpos primários para imunoprecipitaçãoSinalização celular, Beverly, MA, EUAVer comentáriosE-caderina (4A2) Camundongo mAb (#14472s) (Sinalização celular) 1 µ L/200 e micro; L
Tampão Laemmli BIO-RAD, Mississauga, Ontário, Canadá16107474x Tampão de Amostra Laemmli (Adicione β-mercaptoetanol seguindo recomendação do fabricante)
Glicina ácida Fisher Scientific, Burlington, ONPB381-50,2 M glicina; ajuste o pH = 2,5 com HCl 
Tris Fisher Scientific, Burlington, ONBP152-11 M (pH=8) 
Géis de acrilamida SDS-PAGE BIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá1610180 -5Soluções de Acrilamida FastCast Sem Manchas TGX (7.8%, 10%, 12%)
Buffer de corrida 10x BIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá1704272Tris 30.3  g/glicina 144.1  g /SDS 10  g em 1 L de membranas de água destilada
BIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá1704272membranas de PVDF, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Métodode transferência BIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá1704155Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry MilkSmucker Food of Canada Co, Markham, ON, CanadáLeite em pó desnatado instantâneo sem gordura,
solução de bloqueio de cravo para borrões5% leite em pó em TBS-Tween 20 0,1%
Soluções de lavagem para borrõesTBS-Tween 20 0,1%
Anticorpos primários e secundários para borrões (10  mL)Sigma-Aldrich, Oakville, Ontário e Abcam, Toronto, ON, CanadáVer comentáriosConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2.500 com Veriblot conjugado com HRP para anticorpo secundário IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canadá)
Anticorpos primários e secundários para blots (10  mL)Sinalização Celular, Beverly, MA, EUA e Abcam, Toronto, ON, CanadáVer comentáriosE-caderina (24E10) coelho mAb 1/1.000 (#3195s) (Sinalização celular) 1/1.000 com Veriblot conjugado com HRP para anticorpo secundário IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canadá)
Anticorpos primários e secundários para blots (10  mL)Tecnologias de vida, Waltham, MA, EUA e Abcam, Toronto, ON, CanadáVer comentáriosClaudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1.000 com Veriblot conjugado com HRP para anticorpo secundário IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canadá)
Anticorpos primários e secundários para blots (10  mL)Tecnologias de vida, Waltham, MA, EUA e Abcam, Toronto, ON, CanadáVer comentáriosClaudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1.000 com Veriblot conjugado com HRP para anticorpo secundário IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canadá)
Solução de luminol para detecção de sinal em borrõesBIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá1705061Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá1708280ChemiDoc MP imaging sistema
de análise de borrõesBIO-RAD, Mississauga, ON, CanadáSoftware ImageLab 5.2 
Albumina de soro bovino de bloqueio

References

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