Method Article

Integração da Extração de Fase Sólida Miniaturizada e Detecção de LC-MS / MS de 3-Nitrotirosina em Urina Humana para Aplicações Clínicas

DOI:

10.3791/55778

⸱

July 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Pharmasan Labs, Inc., 2NeuroScience, Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Foi desenvolvido um método de espectrometria de massa em tandem de cromatografia líquida seletiva e sensível (LC-MS / MS) acoplado com uma extração de fase sólida eficiente em uma microplaca de 96 poços de troca de catiões (MCX) de modo misto para a medição de 3-nitrotirosina livre ( 3-NT) em urina humana com alto débito, que é adequado para aplicações clínicas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A 3-nitrotirosina livre (3-NT) foi amplamente utilizada como um possível biomarcador para o estresse oxidativo. Aumento dos níveis de 3-NT foram relatados em uma ampla variedade de condições patológicas. No entanto, os métodos existentes não possuem a sensibilidade e / ou a especificidade necessárias para medir o nível endógeno baixo de 3-NT de forma confiável e são demasiado pesados ​​para aplicações clínicas. Por isso, a melhoria analítica é urgentemente necessária para quantificar com precisão os níveis de 3-NT e verificar o papel do 3-NT em condições patológicas. Este protocolo apresenta o desenvolvimento de uma nova cromatografia líquida de espectrometria de massa em tandem (LC-MS / MS), combinada com uma extração em fase sólida miniaturizada (SPE) para a medição rápida e precisa de 3-NT na urina humana como biomarcador não-invasivo Para o estresse oxidativo. A SPE usando uma placa de 96 poços marcadamente simplificou o processo combinando a limpeza de amostras e o enriquecimento de analitos sem etapas de derivação e evaporação tediosas, Reduzindo o consumo de solventes, eliminação de resíduos, risco de contaminação e tempo total de processamento. O emprego de acetato de amónio 25 mM (NH 4 OAc) a pH 9 como a solução de eluição SPE aumentou substancialmente a selectividade. A resposta do sinal de espectrometria de massa foi melhorada através do ajuste das transições de monitoramento de reação múltipla (MRM). O uso de 0,02% de HCOOH como aditivo em uma coluna de pentafluorofenilo (PFP) (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) melhorou a resposta do sinal outro 2,5 vezes e reduziu o tempo total de execução para 7 min. Foi alcançado um limite inferior de quantificação (LLOQ) de 10 pg / mL (0,044 nM), representando uma significativa melhora da sensibilidade em relação aos ensaios relatados. Este método simplificado, rápido, seletivo e sensível permite que duas placas de amostras de urina (n = 192) sejam processadas em um período de 24 h. Considerando o desempenho analítico marcadamente melhorado e a amostragem de urina não invasiva e econômica, o ensaio proposto é benéfico para clínicas pré-clínicas e clínicasEstudos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os efeitos do estresse oxidativo na apresentação clínica foram empurrados para a vanguarda nos últimos anos 1 . Um dos biomarcadores que estão sendo explorados é o 3-nitrotirosina (3-NT), um produto final estável formado quando as espécies reativas de nitrogênio (RNS) interagem com a tirosina, um precursor de neurotransmissor de catecolaminas. Enquanto 3-NT pode ter valor clínico como biomarcador para RNS in vivo, as mudanças substanciais das propriedades e funções da tirosina podem afetar negativamente as proteínas correspondentes e as funções celulares 1 , 2 . Pesquisas emergentes sugeriram que 3-NT pode desempenhar um papel importante em condições inflamatórias 3 , distúrbios neurodegenerativos 4 , 5 , doença cardiovascular 6 e diabetes 7 , bem como condições relacionadas ao estresse oxidativo. No entanto, estes obseAs explorações são baseadas em resultados de metodologias que não possuem sensibilidade e / ou seletividade 8 , 9 , 10 , 11 . Os enormes intervalos de concentração de 3-NT para as amostras biológicas previamente relatadas na literatura revelam que sérios problemas analíticos estão associados a esses ensaios e a melhoria técnica é necessária para quantificar com precisão os níveis de 3-NT e verificar seu papel na patologia dessas condições .

A quantificação de 3-NT livre em matrizes biológicas apresenta um desafio especial para o homem e instrumento 8 , 9 , 10 , 11 . Primeiro, o nível de traço do 3-NT endógeno exige uma detecção ultra-sensível; Em segundo lugar, a existência de numerosos análogos estruturalmente semelhantes, especialmente a tirosina, que está presente emGrande excesso, requer um alto grau de seletividade; Em terceiro lugar, a formação artefactual de 3-NT por nitratação de tirosina com nitrito e nitrito onipresente requer uma consideração especial durante a preparação da amostra para evitar a superestimação falsa de 3-NT.

Entre uma grande variedade de metodologias empregadas para medir 3-NT, MS / MS foi considerado o método padrão-ouro devido à sua sensibilidade e seletividade superiores 11 , 12 , 13 , 14 . O MS / MS acoplado com cromatografia gasosa (GC) oferece a melhor sensibilidade, no entanto, as etapas de derivação de amostra indispensáveis ​​são muito tediosas e demoradas para serem eficientes para a utilidade clínica 15 , 16 . O LC-MS / MS não requer uma derivação de amostra complexa, tornando-se a opção mais promissora. No entanto, há vários obstáculos a serem superados, como o seA nitidez dos métodos de LC-MS / MS relatados na literatura precisa melhorar para a medição de 3-NT 7 , 17 , 18 e o tempo de resposta relativamente longo deve ser encurtado para aplicações de alto débito 12 , 13 , 17 , 19 .

Além disso, ao considerar aplicações clínicas, a matriz biológica utilizada desempenha um papel significativo. Deve ser fácil e barato obter e não invasivo, se possível 20 , 21 , 22 . O plasma, a amostra tradicionalmente utilizada na literatura, não é uma matriz clinicamente desejável, pelo que foi buscada uma metodologia que utilize urina que não seja invasiva e custo-efetiva.

Várias tentativas de desenvolver relAs metodologias de LC-MS / MS específicas e específicas foram feitas usando a urina 9 , 10 , 11 . No entanto, eles ficaram completamente menos seletivos, confiáveis ​​ou eficientes para uso clínico. A eficácia da SPE predominante utilizando o cartucho de fase reversa tradicional (tipo C18) como limpeza de amostra para a análise de 3-NT foi questionada e uma SPE seqüencial de troca de catiões forte (SCX) e fase inversa C18-OH foi proposta 6 , 7 , 19 . Um método recentemente desenvolvido de LC-MS / MS utilizou um processo de purificação em múltiplos passos de C18 SPE manual, cromatografia líquida preparativa de alta pressão (HPLC) e SPE online para análise de 3-NT 23 . Embora este método tenha sido suficientemente sensível para fins clínicos, com um LLOQ de 0,041 nM, o processo de limpeza foi intensivo e tedioso e requiVermelho 3 mL de urina, limitando sua viabilidade para alto débito. Um polímero de impressão molecular foi empregado como soro de SPE para melhorar a eficiência do processo de limpeza 14 , mas o LLOQ resultante (0,7 μg / mL) não foi suficientemente baixo para espécimes clínicos. Outro método requeru LC-MS / MS bidimensional (2D) e cromatografia de imunoafinidade para limpeza de amostras para atingir um limite de detecção (LOD) de 0,022 nM 24 . Embora todos esses métodos tenham feito avanços na avaliação do 3-NT, nenhum deles alcançou a sensibilidade, confiabilidade e eficiência necessárias para aplicações clínicas.

Para investigar a patologia do 3-NT livre e seu papel como biomarcador do estresse oxidativo em contextos clínicos, desenvolvemos uma metodologia simples, eficiente, precisa e precisa, possibilitando aplicações clínicas de alto rendimento 25 . Um extrato de catião em modo misto miniaturizadoHange (MCX) foi implementada uma microplaca de extração de 96 poços para obter uma limpeza simples e eficaz da amostra e o enriquecimento de 3-NT em uma única extração, ignorando as desvantagens observadas nos métodos existentes que requerem derivação, evaporação e 2D-LC. A cromatografia líquida com 0,02% de HCOOH como aditivo em fase móvel ofereceu uma resposta de sinal melhorada com um tempo de ciclo rápido. A selectividade foi ainda melhorado através da aplicação de uma solução de eluição leve NH4OAc por eluição selectiva do 3-NT, e utilização de transição MRM para ambos um grupo 3-NT e do padrão interno (IS). O efeito de matriz foi compensada pela utilização de uma quantidade reduzida de um isotópica preferido 13 marcado com C é para quantificação. Com o advento desta metodologia, pesquisadores e clínicos poderão verificar o papel do 3-NT em condições clínicas e explorar ainda mais o impacto do estresse oxidativo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os estudos envolvendo amostras de urina humana foram realizados aderência ao procedimento aprovado pelo Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB).

1. Coleta de amostras de urina e determinação de creatinina (Cr)

  1. Coletar 5 mL das amostras de urina da manhã seguinte após ca. 10 h durante o jejum durante a noite em um tubo de transporte de 5 mL A contendo 250 μL de HCl 3 N como conservante e armazene a -20 ° C até o uso.
  2. Descongelamento e vórtice 5 mL de urina de transporte Um tubo e centrífuga em uma centrífuga ( eg Sorvall) (2297 xg, 10 min).
  3. Alíquota 1 mL de urina duas vezes a partir do tubo de transporte de 5 mL A.
  4. Determine Cr por um método de creatinina urinária 26 .

2. Preparação de Amostras de Padrão, IS e Controle de Qualidade (QC)

  1. Preparar uma solução de reserva de 3-NT a 100 μg / mL em água com 0,01% de fase móvel de HCOOH A (MA) e armazenar a -20 ° C.
  2. FaçoUma solução padrão de trabalho 3-NT a uma concentração de 100 ng / mL, diluindo a solução de reserva de 3 μg de 100 μg / mL com MA.
  3. Gerar padrões que variam de 5 a 2500 pg / mL por diluição do padrão de trabalho de 100 ng / mL com urina em branco acidificada 0,15 M HCl livre de 3-NT, juntamente com amostras vazias em branco e em branco duplo.
  4. Prepare uma solução-mãe de IS 13 C 9 -3-NT a 100 μg / mL em água com MA e guarde a -20 ° C.
  5. Faça uma solução de trabalho de IS a 500 pg / mL por diluição da solução de reserva de 100 μg / mL de 13 C 9 -3-NT IS com MA.
  6. Estabelecer cinco níveis de amostras de QC que cobrem os níveis LLOQ, baixo, médio e alto ( isto é , 10, 25, 100, 500 e 1.250 pg / mL), por diluição do padrão de trabalho 3-NT na urina vazada acidificada.

3. Procedimento de extração de fase sólida

  1. Amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras de amostras
  2. Adicione amostras de urina, padrões e QC sampLes (250 μL cada) para 32 poços de uma placa de coleta de 96 mL de 2 ml.
  3. Introduza a solução de trabalho de 500 pg / mL IS (50 μL) em cada poço, exceto o exemplo de amostra dupla em branco. Adicione 0,01% de HCOOH (50 μL) ao poço de amostra em branco dupla.
  4. Adicionar água LC-MS / MS com 0,1% de HCOOH (250 μL).
  5. Misture a mistura acima com uma pipeta de 8 canais três vezes.
  6. Cubra a placa até carregar SPE.
  7. Coloque uma placa de extração de MCX de 96 poços e um reservatório de coleta em um processador de pressão positiva.
  8. Condicione a placa de extração com MeOH (200 μL) fluindo através do sorvente.
  9. Equilibre-se fluindo água com 2% de HCOOH (200 μL) através do sorvente.
  10. Carregue cuidadosamente o volume de cada uma das amostras pré-misturadas na placa de extração pré-condicionada com uma pipeta de 8 canais.
  11. Ajuste a pressão positiva baixa ( por exemplo , 3 psi) no processador de pressão positiva para permitir que a mistura flua.Abra o sorvente lentamente, ajuste a pressão, se necessário.
  12. Lave os poços fluindo água com 2% de HCOOH (200 μL) através do sorvente.
  13. Lave os poços através do fluxo de metanol (200 μL) através do sorvente.
  14. Lave os poços através da água corrente (200 μL) através do sorvente.
  15. Secar os poços completamente com ajuste de pressão positiva alta ( por exemplo , 40 psi) no processador de pressão positiva.
  16. Substitua o reservatório por uma placa de coleta limpa de 2 ml de 96 poços.
  17. Aplique 25 mM de NH4OAc a pH 9 (50 μL) para eluir o analito retido e IS da placa de extração.
  18. Pipetar água LC-MS com 5% de HCOOH (50 μL) para neutralizar o eluído.
  19. Misture com a pipeta de 8 canais três vezes e envie para a estação LC-MS / MS para análise.

4. Análise LC-MS / MS

  1. Medir com precisão 2.000 mL de água LC-MS com um cilindro graduado e transferi-lo para uma garrafa de 2 L.
  2. PIpette 200 μL de HCOOH puro no frasco acima contendo água LC-MS.
  3. Misture bem e rotule como fase móvel A (MA). Incluir iniciais, data de preparação e data de validade.
  4. Pegue uma garrafa de 2 litros de metanol LC-MS e rotular como fase móvel B (MB) com data de início e data de validade.
  5. Ajuste a temperatura do auto-amostragem para 4 ° C.
  6. Coloque a placa de recolha com amostras preparadas no auto-amostrador.
  7. Coloque uma coluna PFP (150 mm x 2.1 mm id, 3 μm) e coluna de guarda no forno.
  8. Ajuste a temperatura do forno para 30 ° C.
  9. Equilibre 10 min usando o método de aquisição com a eluição com gradiente LC como mostrado na Tabela 1 .
Tempo (min) Módulo Eventos Parâmetro
0 Bombas Pump B Conc. 5
0,5 Bombas Pump B Conc. 20
1 Bombas Pump B Conc. 50
3 Bombas Pump B Conc. 80
4 Bombas Pump B Conc. 90
4.01 Bombas Pump B Conc. 95
5.5 Bombas Pump B Conc. 95
5.6 Bombas Pump B Conc. 5
7 Controlador Pare

Tabela 1: condições de eluição do gradiente de cromatografia líquida

  1. Crie uma lista de lote incluindoPadrões, QC e amostras de urina.
  2. Comece o lote por injeção das amostras preparadas (12 μL).

5. Processo de identificação, integração e dados de picos

  1. Controle a aquisição e processamento de dados usando o software.
  2. Identifique e integre os picos de 3-NT e IS para todas as amostras.
  3. Estabeleça uma curva padrão com a faixa de 10-2,500 pg / mL para a quantificação 3-NT por regressão linear da relação da área de pico de 3-NT e IS versus a concentração nominal de 3-NT com um fator de ponderação de 1 / x.
  4. Quantifique todas as amostras usando a curva padrão.
  5. Determine se as amostras de QC caem no intervalo estabelecido.
  6. Converta as concentrações detectadas de amostras de urina em resultados finais na unidade de nM ou nmol / mmol Cr.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A Figura 1 ilustra que o 3-NT está completamente separado por cromatografia de outros análogos de tirosina estruturalmente semelhantes sob a condição de LC otimizada, o que elimina as interferências de co-eluição devido a estes compostos vastamente excessivos e conseqüentemente aumenta o grau de seletividade do ensaio. Além disso, a eluição com gradiente com 0,02% de HCOOH como aditivo em MA e metanol a um caudal de 0,45 mL / min permite a eluição rápida de ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As variações substanciais nas concentrações previamente relatadas na literatura para o 3-NT isento endógeno em amostras de urina humana revelam problemas metodológicos associados aos ensaios disponíveis 8 , 9 , 10 , 11 . A determinação precisa do baixo nível basal de 3-NT na urina humana continua a ser uma tarefa desafiadora que requer precauções especiais para a preparação da amostra e a anál...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores reconheceriam Scott Howard e Abigail Marinack para apoio geral e coordenação deste trabalho.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-Nitro-L-tirosinaSigmaN7389-5g
3-Nitro-L-tirosina-13C9Sigma652296-5.0mg
Massa Spec Gold UrineGolden West BiologicalsMSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well µ Placa de eluiçãoWaters186001830BA
Placa de coleta de 2 mL 96 poçosPhenomenex   AH0-7194
96 processador positivoWaters 
LC-MS Ultra CHROMASOLV metanol   Sigma14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV águaSigma14263-2L
Ácido fórmico para espectrometria de massaSigma94318-50ML-F
Solução de hidróxido de amônioSigma338818-1L
Ultra PFP colunas de propilRestek9179362
5500 Triple quadAB Sciex /Entre em contato com o fabricante para mais detalhes
UFLC-XRShimadzu /Entre em contato com a fabricação para mais detalhes
Integra 400 Plus Roche/Creatinina Urinária Jaffé Método Gen 2
Certificado LCMS Frasco de gargalo de rosca de 12 x 32 mm Waters600000751CV
Certificado LCGC Frasco de recuperação total de gargalo de rosca de 12 x 32 mmWaters186000384C
Tubo de transporte de 5 mLPhenixTT-3205
Tubo de centrífuga de 50 mLCrystalgen 23-2263
Tubo de centrífuga de 15 mLCrystalgen 23-2266
CentrífugaSartorius730391
 Beckman CoulterA46474
OHAUS balance   Kennedy Scales, inc.Misturador Vortex 735
Bernstead ThermolyneM16715
186005521Pipeta eletrônica eLine de microfuga

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
  2. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
  3. Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).
  4. Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association? J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).
  5. Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
  6. Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).
  7. Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).
  8. Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).
  9. Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).
  10. Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).
  11. Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).
  12. Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).
  13. Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).
  14. Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).
  15. Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).
  16. Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).
  17. Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).
  18. Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).
  19. Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).
  20. Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).
  21. Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).
  22. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
  23. Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).
  24. Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).
  25. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).
  26. Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. , Mannheim. Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html 2011-2011 (2011).
  27. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
  28. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3 Nitrotyrosine DetectionSolid Phase ExtractionLC MS MS AnalysisHuman Urine SamplesOxidative Stress BiomarkerMiniaturized SPE MethodAmmonium Acetate ElutionPFP Column ChromatographyMultiple Reaction MonitoringLower Limit Quantitation

Related Articles