Immunolabeling métodos para analisar populações distintas de microtúbulos no cérebro em desenvolvimento zebrafish são descritos aqui, que são amplamente aplicáveis a outros tecidos. O primeiro protocolo descreve um método otimizado para immunolabeling estável e dinâmica de microtúbulos. O segundo protocolo fornece um método para a imagem e quantificar microtúbulos nascentes especificamente.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Uso de Immunolabeling para analisar os microtúbulos estáveis, dinâmicos e emergentes no embrião Zebrafish
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microtúbulos (MTs) são estruturas dinâmicas e frágeis que são desafiadores para imagem na vivo, particularmente em embriões de vertebrados. Immunolabeling métodos são descritos aqui para analisar populações distintas de MTs em tubo neural em desenvolvimento do embrião do zebrafish. Enquanto o foco estiver em tecido neural, esta metodologia é amplamente aplicável para outros tecidos. Os procedimentos são otimizados para cedo aos embriões de meados-somitogenesis-estágio (1 somite para 12 somitas), no entanto podem ser adaptadas a uma gama de outras fases com relativamente pequenos ajustes. O primeiro protocolo fornece um método para avaliar a distribuição espacial da MTs estáveis e dinâmicos e realizar uma análise quantitativa dessas populações com software de processamento de imagem. Essa abordagem complementa as ferramentas existentes para imagem microtubule dinâmica e distribuição em tempo real, usando linhas transgénicas ou expressão transiente de construções etiquetadas. Com efeito, tais ferramentas são muito úteis, porém eles não facilmente distinguir entre MTs dinâmicos e estáveis. A capacidade de imagem e analisar essas populações distintas do microtubule tem implicações importantes para os mecanismos de compreensão subjacente a polarização celular e morfogênese. O segundo protocolo descreve uma técnica para analisar especificamente o nascentes MTs. Isso é realizado através da captura as propriedades de crescimento de novo do MTs ao longo do tempo, seguindo microtubule despolimerização com a drogas nocodazole e um período de recuperação após o fracasso de drogas. Esta técnica ainda não tiver sido aplicada ao estudo da MTs em embriões de peixe-zebra, mas é um ensaio valioso para investigar a função no vivo das proteínas implicado na montagem de microtúbulos.
Introdução
Microtúbulos (MTs) são polímeros de α - e β-tubulina que reúne numa protofilamentos lineares, vários dos quais se combinam para formar um tubo oco1,2. MTs são estruturas polarizadas, com rápido crescimento além de extremidades e crescimento lento menos extremidades ancorados na centrossoma ou outros microtubule-organização centro (MTOC)3. De novo Formação de MT é iniciada pela nucleação no complexo anel γ-tubulina (γ-TURC), que fornece um modelo para montagem de MT4. Em qualquer determinada célula, duas populações de MTs distinguem-se a curva sobre a tax....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
declaração de ética: os procedimentos descritos abaixo siga a Universidade das orientações de cuidados com animais de Maryland, Baltimore County.
1. análise de estável e dinâmico MTs usando Immunolabeling (protocolo 1)
- dechorionation Manual de embriões antes da fixação
- obter recentemente gerou embriões derramando água em excesso do sistema e Então, coletar embriões restantes em uma placa de Petri de plástico (consulte a Tabela de materiais).
- Remover todos os restos de embriões de água e transferir o sistema para um novo prato cheio de médio de embrião (consulte a Tabel....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Análise de MTs estáveis e dinâmicos usando immunolabeling
No protocolo n º 1, a distribuição das subpopulações de MT durante o início (quilha neural) e os estágios finais (haste neural) do desenvolvimento do tubo neural são revelados, usando Glu-tubulina e Tyr-tubulina como marcadores para MTs estáveis e dinâmicos, respectivamente. MTs dinâmicas predominam o rombencéfalo na fase neural da quilha (4-5 somitas) (Figura 2
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Atualmente existem muitos métodos de imagem dinâmica de MT no início do desenvolvimento do zebrafish, variando de imagens ao vivo de moléculas marcou a immunolabeling de fixa tecido11,12,13,14. Embora MTs em uma única célula podem existir nos Estados dinâmicos ou estáveis, epitelização é um processo no qual o MTs são estabilizadas progressivamente ao longo do tempo. Usando marcadores para MTs e.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
O microscópio confocal foi comprado com fundos de o US National Science Foundation (NSF), grant #DBI-0722569. A pesquisa foi apoiada por os E.U. institutos de saúde nacional/Instituto Nacional de General Medical Ciências (NIH/NIGMS) concessão #GM085290 e E.U. departamento de defesa (DOD) grant #W81XWH-16-1-0466 atribuído a R.M. Brewster. E. Vital foi apoiada por uma concessão a UMBC do Howard Hughes Medical Institute, através da pre-faculdade e programa de educação científica de graduação, conceder #52008090. S.P. Brown foi apoiado por um departamento E.U. de educação GAANN Fellowship, uma bolsa de pós-graduação Meyerhoff financiado pela concessão de NIH/NIGMS, #GM055....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agarose | Usado para tratar petrídeos. Prepare agarose a 1% aquecendo uma solução de 1 grama de agarose por 100 ml de meio embrionário 1X em um micro-ondas até polimerizar. | ||
| Kpipes | Sigma | P7643 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2· 2H2O | Sigma | C5080 | |
| NP-40 | American Bioanalyticals | AB01424 | |
| EGTA | Sigma | E3889-25G | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-500G | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Fisher | BP1605 | |
| Triton-x | American Bioanalyticals | AB02025 | |
| montagem anti-desbotamento médio | Invitrogen | P10144 | |
| Camundongo anti-β-tubulina | Estudos de desenvolvimento Hybridoma Bank | E7 | 1/200 |
| Coelho anti-&gama;-tubulina | Genetex | GTX113286 | 1/500 |
| Coelho anti-&alfa;-tubulina | Genetex | GTX108784 | 1/1000 |
| Coelho anti-destirosinado-tubulina | Millipore | AB3201 | 1/200-1/1000* Titular o anticorpo com a primeira utilização do novo lote. |
| Coelho anti-tirosinado-tubulina | Millipore | ABT171 | 1/500 |
| Rato anti-centrino | Millipore | 04-1624 | 1/1000 |
| Cabra 488 anti-coelho | Thermofisher | A11008 | 1/500 |
| Cabra 594 anti-coelho | Thermofisher | A11012 | 1/500 |
| Cabra 594 anti-rato | Thermofisher | A11005 | 1/500 |
| Cabra 488 anti-rato | Thermofisher | A11001 | 1/500 |
| Vibratome | Vibratome | 1500 | |
| Fórceps | World Precision Instruments | 555227F | |
| Placa de Petri de 100 mm | Tratamento de células 229693 | ||
| Placa de Petri de 35 mm | Tratamento de células | 229638 Tubo | |
| falcão de 50 ml | Fisher | 14-432-22 | |
| Malha de nylon tecida 70 um | Amazon.com | B0043D1SZG | |
| Micropipeta | Gilson | F123602 | |
| Pipeta de vidro | Fisher | NC-999363-9 | |
| Selante de aquário | Amazon.com, por MarineLand | Selante de Silicone 1 oz (Tubo) | |
| Suporte de anel | Fisher | 14-675BO | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID | Cole-Parmer | WU-06417-21 | |
| Argila de modelagem | Amazon.com | Sargent Art 22-4000 | Qualquer argila de modelagem não tóxica à base de cera ou óleo será suficiente |
| Grampo | Fisher | 02-215-466 | |
| Seringa de 60ml | Fisher | 14-820-11 | |
| Meio embrionário (E3) | 34,8 g NaCl 1,6 g KCl 5,8 g CaCl2· 2H2O 9,78 g MgCl2· 6H2O Para preparar um caldo 60X, dissolva os ingredientes em H2O, até um volume final de 2 L. Ajuste o pH para 7,2 com NaOH. Autoclave. Para preparar o meio 1X, dilua 16,5 mL do estoque 60X para 1 L. | ||
| Solução | 50 ml TBS-NP-40 2,5 ml de soro de cabra normal 1 g BSA 625 µ l Triton-X | ||
| TBS-NP-40 (pH 7.6) | 155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40 | ||
| 2x MAB (pH6.4) | 160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2 | ||
| Software de processamento de imagem 3-D comercial | PerkinElmer | Volocity (V 6.2) | |
| Aquecedor de bloco seco | VWR | 12621-108 | Utilizado como placa quente para derreter agarose no Protocolo 1. |
| Microscópio de dissecação | Leica | MZ12 | |
| Microscópio confocal | Leica | SP5 | |
| Molde de incorporação plano | emsdiasum.com | BEEM 70904-01 | |
| Software de processamento de imagem de domínio público | NIH | ImageJ (V 1.5) | |
| * O sucesso varia de acordo com o número do lote |
Referências
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and de....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
