Microcristalografia de Cristais de Proteína e<em&gt; Em Cellulo</em&gt; Difração

Resumo

Um protocolo é apresentado para cristalografia de raios X usando microcristais de proteína. São comparados dois exemplos de análise de microcristos criados em vivo após purificação ou em celulósio .

Resumo

O advento de linhas de luz de microfoco de alta qualidade em muitas instalações de sincrotrona permitiu a análise de rotina de cristais menores que 10 μm em sua maior dimensão, o que representava um desafio. Apresentamos dois fluxos de trabalho alternativos para a determinação da estrutura de microcristais de proteínas por cristalografia de raios X com foco particular em cristais crescidos in vivo . Os microcristais são extraídos de células por sonicação e purificados por centrifugação diferencial, ou analisados em celulo após classificação celular por citometria de fluxo de células que contêm cristais. Opcionalmente, os cristais purificados ou as células que contêm cristais são embebidos em soluções de átomos pesados ​​para a fase experimental. Essas amostras são então preparadas para experiências de difracção de maneira similar por aplicação em um suporte micromesh e refrigeração instantânea em nitrogênio líquido. Nós descrevemos e comparamos brevemente experiências de difracção em série de microcristais isolados e cristal-Contendo células usando uma linha de luz de sincrotron microfocus para produzir conjuntos de dados adequados para faseamento, modelagem e refinamento.

Esses fluxos de trabalho são exemplificados com cristais do poliedro Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) produzido por infecção de células de insetos com um baculovírus recombinante. Neste estudo de caso, a análise do cellulo é mais eficiente do que a análise de cristais purificados e produz uma estrutura em ~ 8 dias da expressão ao refinamento.

Introdução

O uso de cristalografia de raios-X para a determinação de estruturas de alta resolução de macromoléculas biológicas experimentou uma progressão constante ao longo das duas últimas décadas. A crescente aceitação da cristalografia de raios-X por pesquisadores não especializados exemplifica a democratização desta abordagem em muitos campos das ciências da vida ¹ .

Historicamente, os cristais com dimensões abaixo de ~ 10 μm foram considerados desafiadores, se não inutilizáveis, para a determinação da estrutura. A crescente disponibilidade de linhas de feixe de microfoco dedicadas em fontes de radiação sincrotrona em to....

Protocolo

Nota: a cristalização in vivo tem sido relatada em muitos organismos, incluindo bactérias, leveduras, plantas, insetos e mamíferos (revisado na referência ²¹ ). A cristalização de proteínas recombinantes também foi conseguida no laboratório usando transfecção transitória de células de mamíferos e infecção por baculovírus de células de insetos. O protocolo a seguir foi desenvolvido utilizando o gene de poliedrina Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) clonado em um baculovírus recombinante sob o promotor de poliedrina de baculovírus, gerado de acordo com instruções na referência ²² . Assim, embora es....

Resultados

Uma visão geral de ambos os métodos alternativos para a determinação da estrutura utilizando microcristais in vivo é apresentada ( Figura 1 ). Os poliedros podem ser facilmente purificados por sonicação e centrifugação. Devido à sua densidade, eles formam uma camada na parte inferior do tubo por baixo de uma camada de detritos que podem ser removidos por pipetagem ( Figura 3a e 3b ). A amostra é então s.......

Discussão

Este protocolo fornece duas abordagens para analisar os microcristais com o objetivo de facilitar a análise de cristais muito pequenos que teriam sido ignorados no passado.

Passos críticos para a purificação de microcristal
O protocolo apresentado foi otimizado usando o poliedrino Bombyx mori CPV1 expresso em células Sf9 como um modelo de sistema. No entanto, os microcristais in vivo apresentam uma grande variabilidade na resistência mecânica. Por ex.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células Sf9	Life Technologies
SF900-SFM meio de cultura de células	Life Technologies
1 L frasco de cultura de células	Thermofisher Scientific
Incubadora de agitação para cultura de células de insetos	Eppendorf
tubos cônicos de 50 mL	Falcon
Centrifuge com baldes giratórios para 50 mL tubos	Eppendorf
Sonicator equipado com uma sonda de 19 mm	MSE Soniprep 150
Lâminas de vidro	Hemacitômetro Hampton Research
	Sigma-Aldrich
Iodeto de propídio	Thermofisher Scientific
BD Influx classificador de células	BD Biosciences
Hampton Heavy atom screens Hampton	Research
Microcentrifuge	Eppendorf
Micromesh	Mitigen		700/25 malhas oferecem uma superfície maior. Malhas indexadas podem ser adquiridas para estudos sistemáticos.
Pavio de papel	Mitigen		O tamanho do pavio de papel pode ser variado para um fluxo ideal. Isso dependerá em grande parte da natureza dos cristais e do crioprotetor usado.
Etilenoglicol	Sigma-Aldrich
Trypan blue	Life Technologies
MX2 linha de luz microfoco	Síncrotron		Uma lista de linhas de luz microfoco disponíveis pode ser encontrada em Boudes et al. (2014) Reflexões sobre as muitas facetas da microcristalografia de proteínas . Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793– 1806, doi:10.1071/CH14455.

australiano