Este trabalho demonstra uma nova abordagem para avaliar a proliferação, diferenciação e potencial de formação de vasos de células-tronco endoteliais vasculares (VESCs) através do transplante de almofada de gordura mamária, seguido de preparação de tecido total para a observação microscópica. Também é apresentada uma estratégia de rastreamento de linhagem para investigar o comportamento de VESC in vivo .
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células endoteliais (ECs) são os blocos fundamentais da arquitetura vascular e medem o crescimento vascular e a remodelação para assegurar o desenvolvimento adequado dos vasos e a homeostase. No entanto, os estudos sobre a hierarquia da linhagem endotelial permanecem evasivos devido à falta de ferramentas para obter acesso, bem como para avaliar diretamente seu comportamento in vivo . Para resolver esta deficiência, um novo modelo de tecido para estudar angiogênese usando a almofada de gordura mamária foi desenvolvido. A glândula mamária desenvolve-se principalmente nos estádios pós-natais, incluindo a puberdade e a gravidez, durante os quais a proliferação robusta do epitélio é acompanhada de uma vasta remodelação vascular. As almofadas de gordura mamárias fornecem estímulos angiogênicos espaciais, matriciais e ricos do epitélio mamário em crescimento. Além disso, as almofadas de gordura mamária estão localizadas fora da cavidade peritoneal, tornando-os um local de enxerto facilmente acessível para avaliar o potencial angiogênico de células exógenas. Este trabalho também descreve uma eficiênciaAbordagem de rastreamento nt usando ratos repórter fluorescentes para rotular especificamente a população alvo de células-tronco endoteliais vasculares (VESCs) in vivo . Este método de rastreamento de linhagem, acoplado com o microscópio subseqüente de todo o tecido, permite a visualização direta de células direcionadas e seus descendentes, através das quais a capacidade de proliferação pode ser quantificada e o compromisso de diferenciação pode ser mapeado pelo destino. Usando esses métodos, uma população de receptores de proteína Bipotente (Procr) expressando VESCs recentemente foi identificada em sistemas vasculares múltiplos. Procr + VESCs, dando origem a novas ECs e pericítas, contribuem ativamente para a angiogênese durante o desenvolvimento, homeostase e reparação de lesões. No geral, este manuscrito descreve um novo transplante de almofadas de gordura mamária e técnicas de rastreamento de linhagem in vivo que podem ser usadas para avaliar as propriedades das células-tronco dos VESCs.
Introdução
Durante o desenvolvimento e a homeostase, o crescimento vascular e a remodelação ocorrem fielmente de acordo com o crescimento e reparo de órgãos. A angiogênese descreve a geração de novos vasos a partir de vasos sanguíneos pré-existentes e é considerada uma força importante que medeia essas mudanças vasculares dinâmicas. Cada vaso sanguíneo é revestido internamente com uma camada de células endoteliais (ECs), e eles parecem ser o fundamento da arquitetura do vaso. Durante muito tempo, o mecanismo através do qual o pool da CE é reabastecido durante a homeostase permaneceu obscuro, e os argumentos foram levantados sobre se o turnover vascular é o resultado da prolifer....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Bioquímica e Biologia Celular de Xangai, Academia Chinesa de Ciências, sob o protocolo aprovado SIBCB-NAF-15-002-S335-003.
1. Isolamento de VESCs da glândula mamária do mouse
- Colheita de glandes mamárias e digestão de tecidos.
- Use ratos repórteres virgens maduros Actin-GFP de 8 semanas de idade, com pesos entre 20 e 25 g, como doadores de tecidos.
Nota: As células originadas pelo doador podem ser facilmente rastreadas pela expressão GFP. - Prepare um meio base de digestão de t....
- Use ratos repórteres virgens maduros Actin-GFP de 8 semanas de idade, com pesos entre 20 e 25 g, como doadores de tecidos.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Isolamento mamário VESCs:
Para isolar a população endotelial para o subsequente teste de transplante, as glândulas mamárias de camundongo virgem (8 semanas de idade) foram colhidas como material doador. As células endoteliais foram isoladas utilizando uma técnica de classificação de células baseada em anticorpos. Lotes representativos da análise FACS da população VESC em ratinhos C57BL / 6 glândula mamaria de 8 semanas de idade E.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Os ensaios de angiogênese representam uma boa abordagem experimental para estudar a dinâmica vascular. A vasculatura da retina do mouse, que se desenvolve pós-natal, provou ser um modelo atraente para estudar angiogênese 12 . Apesar de ser relativamente acessível, a manipulação real dentro do retículo vascular é bastante difícil. Até agora, o transplante in vivo melhor descrito foi o ensaio de plugue, que encerra células dentro de uma massa de matriz de membrana basal e implantamentos ci.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (31530045 e 31371500 a YAZ, 31401245 a QCY), o Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2014CB964800), a Academia Chinesa de Ciências (XDB19000000 a YAZ) e os chineses Sociedade de Biologia Celular (Early Career Fellowship to QCY).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina-Etileno Diamina Ácido Tetracético(EDTA) (1x) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0,05% Tripsina |
| 0,22 µ m Unidade de Filtro | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0,22 e micro; m Filtro |
| 2-Metilbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µ Filtro de Células m | BD FAL | 352350 | 70 µ O microscópio da adesão do filtro da pilha de m |
| desliza | o vidro de CITOGLAS | 188105 | o |
| Anti-rato CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | para o uso do analusis de FACS em 1 µ g / mL |
| Anti-mouse CD201 Biotina | eBioscience | 13-2012-82 | para uso de analuse FACS em 2,5 e micro; g / mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cianina 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | para uso em FACS analusis em 1 e micro; g / mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Albumina de soro bovino | Sigma | 100190332 | Centrífuga BSA |
| Eppendorf | 5810R | Centrífuga | |
| Colagenase tipo 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Microscopia confocal | Leica | sp8 | Confocal |
| Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Burro anti-Rato Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Anticorpo secundário, use a 0,5 µ g/mL |
| Fórceps Dumont | WPI | 500342 | Froceps |
| Fórceps Dumont - Pontas Micro-Blunted | FST | 11253-20 | Fórceps |
| Fetal Bovino | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Coquetel de linhagem sanguínea para análise FACS, use a 25 µ L por teste |
| Glicerol | Sigma | G6279 | Glicerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 de Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matriz (fator de crescimento reduzido) | BD | 356231 | Matrigel |
| Linhagem de camundongo (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Cepa de camundongo (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Cepa de camundongo (BALB/c nu) | SLAC | BALB/c nude | Camundongos nus |
| Paraformaldeído | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilina Estreptomicina | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | /Strep |
| Fosfato Tampolado Solução Salina (pH7.2) 1x | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| Reagente antidesvanecimento ProLong Gold | Life Technologies | P36934 | Montagem Média |
| Rato anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | para análise de montagem total, anti-VE-Caderina / Cdh5 antibdy para junção endotelial apertada, use a 2,5 µ g/mL |
| Rato anti CD31-biotina | BD Biosciences | 553371 | para analuse de montagem total, anticorpo anti-CD31/PECAM1 para molécula de adesão da superfície endotelial, uso em 10 µ g/mL |
| tampão de lise de glóbulos vermelhos | Sigma | R7767-100ML | Tampão de lise de glóbulos vermelhos |
| Reto/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Tesoura fina |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | para uso de análise FACS em 0,5 µ g/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Seda Trançada Revestida com Cera (Tamanho 5-0 USP (1 Métrico), 18 polegadas (45 cm) PRETO em Agulha C-1) | Sutura COVIDIEN | S1173 | |
| Scaplels descartáveis estéreis | Swann Morton | # 10 | Bisturi |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | solução anti-séptica |
Referências
- Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
