Seção de mamíferos mamários completos para identificação de lesões

Resumo

Desenvolvemos um método para remover, processar, cortar e manchar com sucesso, para avaliação histopatológica, tecido mamário que inicialmente havia sido fixado em slides como montagens inteiras. Este método pode promover a coleta e avaliação de montantes inteiros de glândula mamária em estudos de diretrizes de testes reprodutivos e de desenvolvimento.

Resumo

O desenvolvimento normal da glândula mamária pode ser alterado pela exposição a substâncias tóxicas ambientais e produtos farmacêuticos, exposição excessiva a hormonas e alterações genéticas. As montagens inteiras da glândula mamária são um método barato para capturar a progressão das alterações morfológicas que podem surgir após a exposição. No entanto, na vida posterior, quando as anormalidades são mais propensas a desenvolver, a única dependência deste método pode nem sempre fornecer informações suficientes para fazer um diagnóstico adequado da anormalidade. Historicamente, em estudos de diretrizes de teste químico, uma única glândula mamária é removida na necropsia e preparada como uma seção mantida com hematoxilina e eosina (H & E). A incorporação de coleta e análise de mamíferos contralaterais inteiros diminui a probabilidade de uma avaliação falso-negativa. A avaliação de todo o suporte é limitada pela presença de uma ou duas glândulas mamárias inteiras em um slide e, em alguns casos, as anormalidades observadas em todo o suporte não sãoT uniformemente representado na seção H & E. O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo para a conversão de montagens completas mamárias revestidas em seções manchadas de H & E para que as lesões que de outra forma tenham sido perdidas ou que sejam difíceis de diagnosticar possam ser identificadas. Aqui, detalhamos um método para produzir uma seção de H & E integrada em parafina de alta qualidade de uma glândula mamária que inicialmente foi preparada como uma montagem total. Em comparação com um tecido que foi intencionalmente preparado para seção de H & E, todo o suporte requer preparação adicional para remoção e processamento de tecido. No entanto, este método é considerado barato, uma vez que requer reagentes de laboratório comuns e pouco tempo adicional. Como resultado, este método pode fornecer informações inestimáveis ​​sobre como as exposições químicas e ambientais alteram o desenvolvimento mamário normal, bem como exibir mudanças que ocorrem devido a modificações genéticas.

Introdução

O mountis completo mamário é um método útil e barato implementado em muitos estudos de ratos e ratos para entender o desenvolvimento anormal e induzido quimicamente. Em geral, uma glândula mamária coletada em vários estágios durante o desenvolvimento de roedores ( ou seja, adolescência, puberdade, gestação média e tardia e fase de involução) mostrará mudanças morfológicas na arquitetura celular e celular influenciada por fatores paracrinos, endócrinos e autocrinos ¹ . No rato envelhecido, as porções epiteliais e estromadas da glândula tornam-se cada vez mais densas, o que dificulta a medição de parâmetros morfológicos em um monte inteiro. Assim, é prática comum coletar uma glândula para avaliação histológica para identificar mudanças em um nível microscópico. Ambos os processos são especialmente úteis em estudos envolvendo exposição química ( ou seja, ambiental ou farmacêutico) ou para examinar as alterações morfológicas acompanhadas de alterações genéticasAções.

Técnicas e capacidades para usar a glândula mamária na avaliação de risco continuam a evoluir. Embora a preparação de montagem total seja rotineira e padronizada, as modificações na seção continuam ^{2 , 3} . Muitos grupos de pesquisa de diferentes origens ( ie, academia, governo e indústria) adaptaram as seções coronal / longitudinal do tecido mamário como um método preferido, enquanto alguns laboratórios ainda usam cortes transversais através da pele ⁴ . O último método resulta em uma representação desordenada da epiderme (pele), em vez do tecido de interesse: o epitélio da glândula mamária ² . As seções coronais ou longitudinais são mais úteis para caracterizar o tecido normal ⁵ e melhoram muito a detecção de anormalidades e lesões devido ao aumento da área de superfície e ao número de estruturas presentes. No geral, isso faz com que todo o mundoNão é um método adequado para a avaliação histopatológica comparativa da glândula mamária ^{1 , 2} . Quer usando um ratinho ou um rato, a recuperação e a conservação do 4 ^e 5 ^de gânglios inguinais é altamente recomendada para a comparação do conjunto de montagem para uma secção contralateral H & E.

Quando usado em combinação, a seção H & E e a montagem total fornecem uma conta precisa das mudanças celulares e morfológicas induzidas pela exposição ambiental. Isto é especialmente verdadeiro em certas cepas de roedores nas quais o modelo possui uma baixa susceptibilidade à formação de tumor ou um tumor não é visivelmente visível. Em algumas circunstâncias, a obtenção do tecido necessário nem sempre é possível usando ambas as técnicas ( ou seja, quantidade de tecido insuficiente, recursos ou resultados experimentais inesperados). No nosso caso, observaram-se anormalidades no conjunto total mamário, enquanto o histopathoOs achados lógicos na glândula contrárea H & E foram na sua maioria normais. A discrepância esmagadora entre as glândulas contralaterais nos levou a desenvolver um procedimento econômico e eficiente para identificar as anormalidades em toda a montagem. Utilizando um procedimento de processamento e incorporação modificado, foram preparadas secções coloridas com H & E de alta qualidade a partir de montagens inteiras integradas em parafina. Imaginamos que este protocolo se torne uma poderosa ferramenta de detecção para efeitos de exposição química, aumentando as comparações entre laboratórios.

Protocolo

Todos os animais utilizados e procedimentos para este estudo foram aprovados pelo NIEHS Laboratory Animal

Comitê de Atendimento e Uso e conduzido em uma Associação de Avaliação e Credenciamento de

Instalação especializada em laboratório veterinário.

1. Preparação Mammary Whole-mount ^{2 , 3 , 6 , 7}

1. Remova as glândulas mamárias inguinais de um lado de um mouse fêmea não gravida de CD-1, conforme descrito na referência ³ , e coloque-as em um slide eletrostático.
2. Cubra a glândula com papel ou filme antiaderente e coloque outro slide no topo. Adicione pressão ( isto é, pesos de água) ao slide para espalhar a glândula para fora, de modo que a glândula fique presa ao slide para fixação.
3. Submergir as lâminas no fixador ( por exemplo, 100% de etanol, clorofórmio e ácido acético glacial numa proporção de 6: 3: 1)Durante a noite a temperatura ambiente.
4. Remova as glândulas do fixador e lave-se em etanol por 15 a 30 minutos. Após a lavagem de 30 minutos, mude gradualmente para a água, despejando 1/3 do etanol e adicionando água. Deixe a lavagem ficar por cerca de 5 minutos cada vez e repita com a adição de água 3 vezes.
5. Mancha ( por exemplo, solução de alumínio de carmim) durante 12-24 h.
   NOTA: Tecidos mais espessos exigirão tempos de coloração mais longos. Consulte a referência ³ para detalhes da coloração.
6. Despeje a mancha após o tempo alocado e lave as lâminas na água por 30 s. Desidratar os tecidos lavando as lâminas em etanol a 70% durante 15 minutos, seguido de uma lavagem de 15 min em etanol a 95% e uma lavagem final em etanol a 100% durante 20 min.
7. Limpe a gordura dos tecidos colocando-os em xileno por um mínimo de 24 h, ou mais, se o tecido for grosso, de modo que todas as áreas opacas ou brancas sejam removidas.
8. Remova o tecido do xileno e adicione rapidamente mMeio de montagem no slide para evitar a desidratação do tecido; Coloque uma lamínula no topo. Deixe o slide secar durante pelo menos 48 h.
9. Avalie todo o tecido montado para anormalidades, conforme descrito em ² .
   NOTA: Quando as lesões são detectadas em montagens inteiras e a seção é necessária para estabelecer sua identidade, as seguintes etapas devem ser seguidas.

2. Remoção do Monte Monográfico Mammary de um Slide de Vidro

1. Remova o lamínula e o meio de montagem submergindo o slide de montagem total mamária em um frasco de coloração de vidro cheio com xileno durante a noite.
   NOTA: Tecidos e lâminas mais espessas com solução de montagem excessiva podem exigir um tempo adicional para a remoção da lamínula.
2. Após a imersão durante a noite inicial, coloque as lâminas em xileno fresco e mergulhe durante 6 h. Execute um mergulho final em xileno fresco durante a noite.
   NOTA: O lamínula facilmente cairá do slide após o último mergulho.
3. Com agAmado mão, segure o slide e remova cuidadosamente a lamínula com um par de fórceps para garantir que ele seja removido de uma só peça.
   NOTA: No caso em que a lamínula ainda esteja ligada à corrediça de vidro, continue a imergir até que ela possa ser removida com pouco esforço.
4. Uma vez que o lamínula é removido, segure o slide perpendicularmente a uma placa de Petri de vidro contendo xileno, coloque cuidadosamente uma lâmina de barbear descartável e descarta e deslize a lâmina em um único movimento pelo escorregão.
5. Uma vez que o tecido é removido, submergir rapidamente a almofada mamária em uma placa de Petri de vidro cheia de xileno para garantir que o tecido não seque ao ar.
   NOTA: tenha cuidado com esta etapa. Todo o suporte é fino (≤ 1 mm) e frágil do processamento de xileno. Qualquer impressão ou lágrima pode mudar a morfologia do tecido e complicar as avaliações posteriores.

3. Processamento de tecidos

1. Uma vez que o tecido está na placa de Petri, transfira-o cuidadosamentePara uma cassete de histologia rotulada. Pegue a borda da almofada de gordura com fórceps com ponta dentada de nariz sem corte para minimizar os danos nos tecidos.
   1. Usando uma navalha, corte tecidos maiores (especialmente para ratos) pela metade e coloque-os em duas cassetes rotuladas separadas que acomodarão o tamanho do tecido. Coloque o tecido do lado direito para cima (use o nódulo linfático como referência). Certifique-se de que o tecido sem os linfonodos seja mantido na mesma posição vertical quando é transferido para a cassete.
2. Coloque a cassete em um recipiente de xileno até 2 h antes de colocá-lo no processador de tecido.
   NOTA: Recomenda-se processar as amostras no mesmo dia em que são colocadas na cassete. A remoção prolongada no xileno não foi testada.
3. Carregue o número máximo de cassetes no processador de tecido à mão.
4. Antes do início, programe todos os reagentes que serão usados ​​para este processo na lista de reagentes do processador. Para automatizar o movimentoDe uma estação para outra, use as opções do menu e crie um novo programa. Quando todas as etapas foram concluídas, selecione 'OK' para prosseguir.
   NOTA: O processador permitirá a revisão de todos os detalhes da estação antes de começar.
   1. Automatize o processador para embeber as cassetes em xileno durante 30 min a 37 ° C, seguido de uma segunda imersão em xileno fresco nas mesmas condições. Automatize o processador para remover as cassetes da solução de xileno e transfira os tecidos para a próxima estação contendo uma mistura 1: 1 de xileno: parafina fundida, ajustada a 60 ° C, durante 30 min.
      NOTA: O processador então transferirá as cassetes para uma nova câmara que contém parafina fundida durante 1 h. Após 1 h, as amostras serão automaticamente transferidas para uma nova câmara de parafina fundida fresca e serão processadas por mais 2 h. Ambas as etapas são realizadas a 60 ° C.
   2. O processador então transfere as cassetes para a estação que contém o parágrafo fundidoPor 1 h. Em seguida, as amostras são transferidas automaticamente para a estação final de parafina fundida fresca e processadas por mais 2 h. Ambas as etapas são realizadas a 60 ° C.

4. Incorporação do tecido mamário processado

1. Coloque as cassetes no tanque de retenção de parafina de 58 ° C da estação de encaixe até estar pronto para incorporar o tecido no molde.
2. Remova a tampa da cassete para determinar o melhor tamanho do molde para o tecido. Certifique-se de que o molde é grande o suficiente para acomodar o tecido e deixar espaço suficiente para ter uma borda livre de tecido de parafina em torno do perímetro.
3. Adicione 3-4 mm de parafina fundida ao molde e oriente a superfície de montagem total mamária, que foi adjacente à parte inferior da lâmina de vidro e ao fundo da cassete, voltada para cima no molde.
4. Transfira o molde para uma placa de resfriamento e ajuste rapidamente o tecido conforme necessário para que seja paralelo ao molde bOttom.
   NOTA: Uma vez que a parafina endurece, o tecido será assegurado no lugar.
5. Usando pinças quentes, coloque a metade inferior da cassete na parte superior do molde; Pressione firmemente usando a pinça.
6. Adicione uma parafina em pó adicional ao molde em um movimento contínuo para cobrir toda a cassete. Mova o molde da placa quente para uma placa fria para completar o endurecimento do bloco.
7. Remova o bloco do molde quando a parafina se solidifica completamente para evitar rachaduras ou bolhas de ar.
   NOTA: Armazene os tecidos embebidos em parafina à temperatura ambiente até estar pronto para a seção.

5. Seção do tecido mamário embutido na parafina no microtome

1. Antes de seccionar, incubar os blocos de parafina a -20 ° C durante 1 h.
   NOTA: Haverá meio de montagem residual no bloco a partir do tecido de montagem total revestido original. A refrigeração do bloco melhora a seção de bloqueio e a fita adesiva.
2. Prepare o microfoneRotome, ligando o banho-maria, contendo água destilada fresca e ajuste a temperatura entre 42-45 ° C. Coloque uma lâmina fresca e de baixo perfil no microtomo e coloque-a a 4 μm.
   NOTA: A qualidade da seção é reduzida com secções maiores que 4 μm devido à presença de meio de montagem residual no tecido.
3. Insira o bloco no microtomo com a cera voltada para a lâmina e alinhada com o plano vertical. Em seguida, umedeça uma seção de gaze em água fria e coloque no bloco por vários minutos.
4. Corte o bloco girando a roda grande no sentido horário, em combinação com a roda avançada grossa, até obter uma face completa ou seção representativa do bloco.
   NOTA: O tecido é fino por causa da limpeza do xileno durante todo o processo de montagem. Alinhe o bloco corretamente com a lâmina para minimizar o número de cortes na obtenção de uma seção representativa.
5. Escolha a fitaSepare manualmente, coloque cuidadosamente a fita no banho-maria quente (45 ° C) (preparada antecipadamente), deixe as rugas do tecido se dissipar e flutuar com cuidado uma seção em uma lâmina de vidro limpa.
6. Coloque as lâminas na posição vertical sobre uma grade de secagem para remover o excesso de água. Incubar os slides em uma caixa deslizante ligeiramente aberta durante a noite a 37 ° C.

6. Coloração Automática e Manual de H & E de Tecidos Mamários Secados

1. Antes da coloração, as lâminas são armazenadas à temperatura ambiente.
2. Para coloração automatizada, selecione H & E a partir das opções de mancha no menu principal. A desparafinação, a coloração e a desidratação estão todas concluídas no stainer automatizado. Use um suporte de montagem e uma lamínula para montar as seções.
3. Se estiver manchando manualmente as lâminas, desparafine as secções imergindo as lâminas no xileno durante 5 min. Transfira para xileno fresco e repita durante 5 min.
4. Rehydrate as lâminas por imersãoEm duas vezes em etanol a 100% durante 3 min cada, seguido de duas repetições em etanol fresco a 95% e duas lavagens separadas em tampão de lavagem 1X a 5 min cada.
5. Enxaguar as lâminas em água destilada.
6. Adicione as lâminas à hematoxilina por 1-2 minutos. Remova as lâminas e enxaguá-las com água corrente durante 5 min.
   NOTA: Filtre a hematoxilina antes de cada uso.
7. Coloque as lâminas em 1% de ácido acético glacial durante 30 s para promover a diferenciação de cores e depois enxaguar na água da torneira durante 1 min.
8. Adicione os slides a 1X PBS durante 30 s a 1 min para o azul as seções de tecido, seguido de um enxaguamento de 5 min na água da torneira e depois com 95% de álcool durante 15 a 20 s.
9. Contrapeso com solução de eosina durante 30 s a 1 min. Depois disso, desidrate as lâminas duas vezes em 95% de etanol fresco, seguido por duas repetições frescas em etanol a 100%. Execute cada lavagem por 5 min.
10. Limpe as lâminas em xileno, com duas mudanças em xileno por 5 minutos cada.
11. CoverslipA seção de tecido com meio de montagem e seca plana durante a noite à temperatura ambiente.

Resultados

Este método é eficaz para auxiliar nos diagnósticos que, de outra forma, poderiam ter sido perdidos se a seção contralateral original de H & E da almofada mamária não apresentasse alterações histológicas. No entanto, o resultado só será útil se for tomado cuidado durante a preparação inicial inicial, bem como durante a preparação do tecido para a avaliação histológica. A incorporação de parafina proporcionará proteção e ajudará a preservar o tecido para futuras secções.

Discussão

A montagem completa da glândula mamária é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para ilustrar o desenvolvimento mamário normal e as alterações morfológicas que podem surgir e persistir após a exposição a produtos químicos, incluindo os disruptores endócrinos. Quando uma montagem completa e a seção H & E do mesmo animal são avaliadas em conjunto, elas podem fornecer uma imagem instantânea precisa de alterações precoces, que podem avançar para um estado mais doente.

A capacidade de ob...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Xileno	Sigma-Aldrich	214736
Permount	Thermo Fisher Scientific	SP15-100	mídia de montagem para lamínula montagens inteiras e H& E seções
Processador automatizado Leica	Biosystems	Modelo # ST5020
HM 355S Micrótomo Automático	Thermo Fisher Scientific	905200
Parafina	Leica Biosystems	EM-400
Superfrost plus lâminas de microscópio	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	eletrostaticamente carregado
Fisher Finest 24x60x1	Thermo Fisher Scientific	12-548-5P	lamínulas
Varistain Gemini ES Coloração automática de lâminas	Thermo Fisher Scientific	A78000014
Sta-On	Leica Biosystems	3803107	adesivo líquido; usado em banho-maria no seccionamento
Hematoxilina Harris modificada 72711	Richard-Allan Scientific (parte da Thermo Scientific)	72711
Eosin	Leica Biosystems	3801600
Carbonato de lítio	SkyTech Laboratories	LCQ500
Ácido acético glacial	Thermo Fisher Scientific	A38-500	necessário no fixador de Carnoy
Clorofórmio	Macron Fine Chemicals	4440-04	necessário no fixador de Carnoy
100% Etanol	A Warner Graham Company	6505001050000	necessária no fixador e lâminas de lavagem de Carnoy
95% Etanol	The Warner Graham Company	6505011137320190
Carmine Alum	Sigma-Aldrich	C1022-25G
Sulfato de potássio de alumínio dodecahidratado, Sigma Ultra	Sigma-Aldrich	A7210-500G
Tampão de lavagem de automação, 20X	Biocare Medical	TWB945