Artigo de método

Desenvolvimento de corpos de embrióide livres de soro derivado de HiPSC para a interrogação de culturas de células estaminais 3-D usando ensaios relevantes para o fisiologismo

DOI:

10.3791/55799

⸱

20 de julho de 2017

 ,  , 
1The Hussman Institute for Autism

Neste artigo

Resumo

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Aqui, relatamos um protocolo para desenvolver um sistema tridimensional (3-D) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) chamado corpo embrionóide sem soro (SFEB). Este modelo 3-D pode ser usado como uma cultura de fatia organotípica para modelar o desenvolvimento cortical humano e para a interrogação fisiológica do desenvolvimento de circuitos neurais.

Resumo

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Embora uma série de modelos de doenças in vitro tenham sido desenvolvidos usando o HiPSCs, uma limitação é que esses sistemas bidimensionais (2-D) podem não representar a complexidade subjacente citocárdica e funcional dos indivíduos afetados portadores de variantes de doença suspeitas. Os modelos 2-D convencionais permanecem representações incompletas de estruturas semelhantes a in vivo e não capturam adequadamente a complexidade do cérebro. Assim, há uma necessidade emergente de mais modelos baseados em HiPSC 3-D, que podem melhor recapitular as interações e funções celulares observadas em um sistema in vivo .

Aqui, relatamos um protocolo para desenvolver um sistema 3-D a partir de hiPSCs indiferenciados com base no corpo embrionóide sem soro (SFEB). Este modelo 3-D espelha aspectos de um neocórtex ventralizado em desenvolvimento e permite estudos sobre funções integrantes de células neurais vivas e tecido intacto, como migração, conectividade, comunicação e tapeteUração. Especificamente, demonstramos que os SFEBs que usam nosso protocolo podem ser interrogados usando ensaios baseados em células fisiologicamente relevantes e de alto conteúdo, tais como imagens de cálcio e gravações de matrizes múltiplas (MEA) sem criosecção. No caso das gravações MEA, demonstramos que os SFEBs aumentam tanto a atividade do ponto como a atividade de explosão no nível da rede durante o cultivo a longo prazo. Este protocolo SFEB fornece um sistema robusto e escalável para o estudo do desenvolvimento da formação da rede em um modelo 3-D que captura aspectos do desenvolvimento cortical inicial.

Introdução

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Já relatamos um sistema modelo 3-D, gerado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs), que recapitulam alguns aspectos do desenvolvimento inicial da rede cortical 1 . Este modelo 3-D, um corpo embrionário isento de soro (SFEB), melhora os modelos 2 , 3 de agregação simples anteriores de agregação. Um corpo crescente de trabalho revela que estruturas tridimensionais, como nossas SFEBs, aspectos aproximados do desenvolvimento neural comumente observados in vivo e em um ponto de tempo anterior ao observado nos modelos hipsc 2-dimensional (2-D) / monoc....

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Protocolo

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1. Geração de células progenitoras neuronais

  1. Manter o HiPSCs derivados de fibroblastos e PBMCs em placas de 6 poços em uma camada celular de alimentador embrionário de mouse irradiado (MEF) em meio iPSC humano suplementado com pequenas moléculas (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: A manutenção diária é uma versão modificada dos procedimentos relatados anteriormente 1 , 16 .
    1. Placa 6 x 10 5 MEFs em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 6 poços em 300 μL / meio recomendado para recomendação (seguindo o protocolo do fabricante).
    2. Após 48 h, sub....

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Resultados

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Os SFEB crescidos usando nossa técnica produziram tecido com características morfológicas que se assemelham a uma zona subventricular cortical desenvolvida inicialmente repleta de extensos neurônios Tuj1-positivos, bem como progenitores neurais ( Figura 3A ). Numerosas rosetas corticais em desenvolvimento foram observadas nas camadas externas e camadas internas do SFEB ( Figura 3B ). A borda externa do SFEB se assemelha a uma pl.......

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Discussão

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O protocolo descrito aqui fornece as condições para diferenciar uma fonte hiPSC em uma estrutura 3-D que recapitula um estágio inicial de desenvolvimento do córtex frontal. Este procedimento produz estruturas que podem ser interrogadas para eletrofisiologia, ao mesmo tempo que são passíveis de microscopia. A morfologia final do SFEB se assemelha à das culturas de fatia de cérebro organotípica e permite uma imagem confocal detalhada de alta qualidade. Este protocolo pode gerar com sucesso SFEBs de ambos os hiPSCs de célu.......

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Divulgações

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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Agradecemos a Elizabeth Benevides pela revisão do artigo. Agradecemos aos Drs. John Hussman e Gene Blatt para suas discussões e comentários úteis.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
SFEB Meios de Cultura de Células de Diferenciação Neuronal. Reagentes. Componentes 
STEMdiff Meio de Indução Neural (hiPSC Media)STEMCELL Technologies0-5835250 mL
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)GlobalStemGSM-2001
NomeEmpresa  Número de catálogoComentários
DM1 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax líquido, 1:1Invitrogen10565018385 mL
Knockout Serum ReplacementInvitrogen10828028 20% 100 mL
Pen/StrepInvitrogen151401225 mL
de Glutamax 200 mMInvitrogen350500615 mL
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais 10 mM (100x),Invitrogenlíquido 111400505 mL
de 2-mercaptoetanol (1.000x),Invitrogen21985023900 μ L
NomeEmpresa  Número de catálogoComentários
DM2 Componentes de mídia
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax líquido, 1:1Invitrogen10565018500 mL
Glutamax 200 mMInvitrogen350500615 mL
Pen/StrepInvitrogen151401225 mL
N-2 Suplemento (100x), líquidoInvitrogen1750204810 mL
NomeEmpresa  Número de catálogoComentários
DM3 Componentes de mídia
NEUROBASAL Medium (1x), líquidoInvitrogen21103049500 mL
B-27 Suplemento Minus Vitamin A (50x), líquidoInvitrogen1258701010 mL
Glutamax 200 mMInvitrogen350500615 mL
Pen/StrepInvitrogen151401225 mL
NomeEmpresa  Número de CatálogoComentários
Small Molecules
TiazovivinStemgent04-00172 μ M
SB431542Stemgent04-0010-101:1.000 (10 μ M)
DorsomorfinaStemgent04-00241 μ M
LDN-193189Stemgent04-0074-10250 nM
Y27632 (ROCKi)Stemgent04-0012-1010 μ M
NomeEmpresa  Número de CatálogoComentários
Recombinant Protiens
DKK-1Peprotech120-30200 ng/mL
NomeEmpresa  Número de catálogoComentários
Componentes/Materiais
cultura de células 0,4 μ M, 30mm de diâmetroMillicellPICM0RG50
Fibroblastos embrionários de camundongoGlobalStemGSC-6301G
96 poços V fundo c/ TampasEvergreen222-8031-01V
StemPro Accutase Reagente de Dissociação de CélulasThermoFisherA1110501
TritonX-100ThermoFisher85111
Fosfato Tampolado Salino (PBS)ThermoFisher10010023500 mL
Soro de Burro NormalJackson Labs017-000-121
Leibovitz's L-15 MédioThermoFisher11415114500 mL
DRAQ5 (Marcador Nuclear)ThermoFisher65-0880-96
Placas MEAAxion BiosystemsM768-GL1-30Pt200
6 poços fundo planoFalcon353046
NomeEmpresa  Número de catálogoComentários<
strong>Anticorpo
NestinMilliporeMAB5326
Brn-2Protein tech14596-1-AP
VGLUT1Sistemas sinápticos135 303
Pax6abcamab5790
Calretininaabcamab702
Calbindinaabcamab11426
CoupTFIIR& D SystemsPPH714700
Nkx 2.1abcamab12650
Tuj1abcamab41489
ReelinMilliporeMAB5364
Tbr1MilliporeMAB2261
NFHDakoM0762
líquido Inserções de

Referências

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  1. Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
  2. Eiraku, M., et al.

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