Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica não-invasiva para a amostragem de líquido imperturbado mucosa das vias aéreas superiores. Ele pode ser usado para realizar a quantificação dos níveis na vivo de mediadores de proteína, tais como citocinas e quimiocinas, em indivíduos de todas as idades.

Resumo

Este protocolo descreve a amostragem não-invasiva de fluido de mucosa das vias aéreas superiores não perturbadas. Ele também detalha o procedimento de extracção utilizado antes da análise dos mediadores imunes em eluídos fluidos para o estudo da via aérea tópica imune assinatura, sem a necessidade de procedimentos de estimulação (frequentemente usados por outras técnicas). O fluido de mucosa é amostrado em uma tira de papel de filtro colocado na parte anterior do corneto e esquerdo por 2 min de absorção inferior. Analitos são eluídos dos papéis de filtro, e os eluídos extraídos à base de proteínas são analisados por um imunoensaio baseado em eletroquimioluminescência, permitindo a quantificação de alta sensibilidade de analitos de baixo e de alto nível na mesma amostra. Medimos os níveis na vivo de 20 mediadores imunes pré-selecionadas relacionados com imunológico específico sinalização de caminhos na mucosa das vias aéreas superiores, mas a técnica não está limitada a esse painel específico ou local de amostragem. A técnica foi primeiramente implementada em crianças de 7 anos desde os estudos prospectivos de Copenhaga sobre asma em coorte de₂₀₀₀ (COPSAC₂₀₀₀) de infância com rinite alérgica. Posteriormente foi usado no COPSAC₂₀₁₀ nascimento coorte longitudinal, amostrada em 1 mês, 2 anos e 6 anos de idade e em instâncias de sintomas respiratórios agudos. Estamos com sucesso obtidas e analisadas amostras de 620 (89%) de 700 crianças de 1 mês de idade; algumas amostras estavam abaixo do limite de detecção do ensaio (relatado como a mediana (intervalo inter-quartil (IQR)). O número de amostras abaixo do limite de detecção (ou seja, de 0 até o ponto de ajuste para o limite inferior de detecção) para cada mediador foi 29 (7.25-119,5). Esta técnica permite a quantificação do vivo em vias aéreas da mucosa imune perfil desde o nascimento, pode ser aplicada no sentido longitudinal e pode ser aplicada a estudos sobre o efeito da genética e exposições ambientais iniciais de vida, fisiopatologia, endotyping e monitoramento de doenças respiratórias e desenvolvimento e avaliação de novas terapêuticas.

Introdução

O fluido da mucosa do nariz torna-se a parte líquida do sistema superior-das vias respiratórias. Consiste de uma matriz complexa de mediadores derivado a interação entre o epitélio e as células imunitárias que compõem a primeira linha de defesa contra a invasão de microorganismos. A mucosa nasal é facilmente acessível, e há uma forte relação funcional e imunológica entre o nariz e os brônquios¹. Este compartimento é de especial interesse em relação às doenças das vias respiratórias que são comuns na infância, como asma e rinite alérgica, mas também a uma gama de outras doenças respiratórias mais prevalentes mais tarde na vida.

Aqui, descrevemos a implementação de um método para amostra intacta da mucosa revestimento fluido da cavidade nasal usando uma técnica não-invasiva, baseada em papel de filtro, bem como um procedimento de extração subsequente, usada para eluir analitos baseados em proteína dos papéis de filtro antes da sua quantificação. Esta técnica por exemplo, pode ser usada para obter na vivo assinaturas imunes de indivíduos saudáveis e indivíduos com várias doenças respiratórias. Além disso, é possível examinar as exposições de importância para uma assinatura específica imune e avaliar se é um preditor ou mediador do desenvolvimento posterior da doença.

Fluido de mucosa anteriormente tiver sido obtido por lavagem nasal², que muitas vezes é precedida por um teste de desafio nasal, onde um alérgeno é introduzido em níveis elevados para estimular uma resposta inflamatória^3,4. No entanto, a técnica de lavagem nasal não é viável em crianças pequenas e introduz um factor de diluição desconhecido, que confunde os resultados, como o mediador diluído níveis podem cair abaixo do limite de detecção do ensaio⁵. Além disso, devido ao fator de diluição desconhecido, as analito medida respostas dos testes desafio nasal não são comparáveis entre indivíduos, limitando assim a utilidade da técnica de lavagem nasal em uma coorte de configuração. Finalmente, desafio de alérgeno só é aplicável em indivíduos sensibilizados e outros desafios, como o desafio de histamina, não são fisiologicamente relevantes, potencialmente causando um efeito de teto na liberação de mediador. Estes problemas são contornados na técnica apresentada em papel de filtro para recolha de fluidos de mucosa, onde a individual secreção de fluidos e níveis de analito são apenas fatores que influenciam a variação inter-individual.

Durante o procedimento de extração, analitos são eluídos dos papéis de filtro após a adição de volumes idênticos de buffer para todas as amostras. Isso favorece semelhante ex vivo diluição das amostras. Uma solução tampão de solução salina isotônica baseada em albumina é usado para a etapa de extração; permite a extração de mediadores à base de proteínas e estabiliza as proteínas para limitar a desnaturação durante o congelamento subsequente de proteínas eluted antes da quantificação. Para evitar a degradação proteica durante a fase de extração, um coquetel de inibidores de protease é adicionado para o buffer de extração.

A implementação de técnicas que permitem a quantificação do intacta, na vivo-mediadores imunes gerados em locais da mucosa é de extrema importância. Primeiro, o site da mucosa torna-se o maior órgão imunológico no corpo. Em segundo lugar, a localização nasal é o principal local de exposição no ar e está firmemente conectada ao compartimento imunológicas respiratórias dos pulmões¹. Em terceiro lugar, a possibilidade de levantamento deste órgão importante com uma técnica não-invasiva abre a possibilidade de fornecer uma infinidade de informações sobre o eixo importante interação micróbio imune em relação à saúde e doença nas vias aéreas. Em quarto lugar, existem muitas outras possíveis aplicações desta técnica, tais como estudar alterações imunológicas locais em experimentações randomized, controladas de drogas e micronutrientes.

Inicialmente implementamos a técnica nos estudos prospectivos Copenhague sobre asma em coorte de₂₀₀₀ (COPSAC₂₀₀₀) de infância, onde determinamos o perfil imunológico do fluido em crianças de 7 anos de idade com rinite alérgica versus controles saudáveis¹³mucosa. Posteriormente, com êxito aplicamos esta técnica à coorte longitudinal de₂₀₁₀ COPSAC e imune perfis das vias respiratórias avaliados em 1 mês, 2 anos e 6 anos de idade e em instâncias de sintomas respiratórios agudos. Resultados de neonatos a 1 mês de idade demonstraram importantes associações entre a assinatura imune e a exposição ambiental do início da vida^{7,8,9,10,11,12}.

Protocolo

Os estudos foram conduzidos em conformidade com os princípios orientadores da declaração de Helsinque. Aprovação do Comitê de ética para Copenhaga (KF 01-289/96 para COPSAC₂₀₀₀ ) e H-B-2008-093 para COPSAC₂₀₁₀e Agência Dinamarquesa de proteção de dados foram obtidas, e foi obtido consentimento escrito de ambos os pais de cada assunto antes de inscrição.

1. experimental Setup

1. Use folhas de papel de filtro (folhas de poliéster-hidroxilados fibrosas, consulte a Tabela de materiais)^6,7.
   1. Corte em tiras de 3 x 15 mm em tamanho para uma criança de 1 mês de idade e em forma de L para crianças mais velhas e adultos (5 x 20 x 10 mm (braço curto da L)).
2. Inserir um pedaço de papel de filtro em cada narina da criança usando fórceps. Coloque o papel de filtro na parte anterior do corneto inferior (aproximadamente 1 cm dentro da narina para neonatos e 1,5 cm para todas as outras idades).
   1. Coloque recém-nascidos em uma cama e dar-lhes água com açúcar para o conforto.
      Nota: Para crianças de todas as outras idades, a amostragem é realizada mais facilmente com o sujeito sentado em uma cadeira.
   2. Para crianças mais velhas, inserir o longo braço do papel de filtro em forma de L em cada narina.
3. Aplica um grampo do nariz ao redor das narinas para minimizar o desconforto e evitar a perda acidental do papel filtro.
4. Remova os papéis de filtro depois de 2 min de absorção.
5. Coloque os papéis de filtro em tubos etiquetados e congelá-los imediatamente a-80 ° C.
6. Tome nota de quaisquer sintomas de infecção das vias respiratórias, mostrado pela criança no dia de amostragem.
7. Grave qualquer espirro, choro persistente ou epistaxe que ocorre durante a 2 min da amostragem.

2. quantificação das vias aéreas imune-mediadores

1. Tome até 10 amostras aleatórias do freezer. Os números de identificação de registro. Mantenha as amostras no gelo durante todo o processo de trabalho.
2. Após o descongelamento no gelo, mergulhe os papéis de filtro (por assunto) de ambas as narinas em 300 µ l de preparada na hora do buffer (veja a Tabela de materiais) contendo um tablet completo protease inibidor (consulte a Tabela de materiais) por 25 mL de tampão.
   1. Ajuste o volume da reserva conforme o tamanho do papel filtro.
      1. Use 300 µ l de tampão para papéis de filtro 3 x 15 mm de tamanho.
      2. Se apenas um papel de filtro está disponível, use metade do volume de reserva (150 µ l).
3. Transferi as amostras para um agitador de placa (400 rpm) 5 min. Use um timer.
4. Transferir os papéis de filtro húmidos e buffer de ensaio para a Copa de um filtro de tubo de acetato de celulose (tamanho de poros de 0,22 µm) colocado dentro microcentrifuga tubo (ver a Tabela de materiais).
5. Centrifugar a 16.000 x g por 5 min em uma centrífuga de refrigeração (a 4 ° C) para obter o extrato nasal filtrado dentro do tubo.
6. Retire a taça e manter os tubos em gelo enquanto alíquotas do extrato nasal nos poços das placas de armazenamento de baixa proteína de ligação (consulte a Tabela de materiais).
7. Loja a-80 ° C até análise.
8. Determinar as concentrações de citocinas e quimiocinas nos extratos nasais usando um sistema de alta sensibilidade, com base em electrochemiluminesce matriz multiplexado (consulte a Tabela de materiais).
   Nota: Um ensaio de 2 citocina humana 10-plex T_H1/T_H, 9-plex chemokine ensaio e single-plex IL-17A, TGF-β1 e TSLP foram realizados aqui.
   1. Para os ensaios, incubar os extratos nasais durante a noite a 4 ° C. Realizar as medições pelo fabricante padrão protocolo (consulte a Tabela de materiais).
      Nota: Os imunoensaios (consulte a Tabela de materiais) geralmente têm uma alta gama dinâmica de medição que varia entre 1 & 10.000 pg/mL, mas pode ser para alguns ensaios, 100.000 pg/mL. Isto significa que todas as amostras podem ser executadas na mesma diluição, limitando assim a influência de diferentes diluições em indivíduos saudáveis e doentes, como é o caso em outros imunoensaios semelhantes. O limite inferior de detecção para todas as citocinas foi 1 pg/mL ou menos e para quimiocinas, variou entre 1 & 50 pg/mL. TSLP não era detectável em 98% das amostras em 1 mês de idade.

3. estatísticas

1. Log-transformar os dados antes da análise para obter resíduos normalmente distribuídos dos níveis de citocinas e chemokine.
2. Se as amostras são analisadas em mais de um lote, corrigi os dados de citocinas e chemokine para centrar batch-wise sobre os dados de log-transformadas.
   1. Incorpore a média global e o antitransformação log de para obter dados em unidades de medida do original.
      Nota: Para cada conjunto de análises feito, considere ajustar as variáveis que afetam o nível de citocinas e quimiocinas. Isto poderia ser influências maternas (por exemplo, o consumo de álcool e fumar durante a gravidez), aleitamento materno, eventos adversos durante a amostragem, irmãos, animais de estimação no lar, etc.

Resultados

Características basais dos perfis imunológicos das vias aéreas:
Dados completos sobre os níveis de mediador imunológico da mucosa das vias aéreas superiores com 1 mês de idade foram obtidos em 620 (89%) das 700 crianças inscritas na coorte COPSAC₂₀₁₀. Dez neonatos foram inscritos antes do estabelecimento da técnica e 19 não compareceram à visita de 1 mês. Além disso, 47 amostras foram excluídas porque foram extraídas e medidas em outro laboratório usado em ...

Discussão

Com a técnica apresentada aqui, éramos capazes de determinar na vivo superior-via aérea da mucosa imune perfil em crianças desde o início como 1 mês de idade, que não foi feito anteriormente. Observamos que a presença de bactérias específicas das vias respiratórias e picornaviruses^7,11, bem como outros pré e perinatais exposições, foram espelhadas no perfil imune dos recém-nascidos das vias respiratórias. Além disso, usamos esses dados de perfil imune da...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Folhas de poliéster hidroxilado fibroso	Accuwik Ultra	SPR0730	Papel de filtro
Milliplex Assay Buffer	Millipore	L-AB	Buffer
Placas de armazenamento de baixa ligação a proteínas	Placas	de CLS8161	Thermo Scientific
Inibidor de Protease	Roche	11873580001	Leitor de Coquetel Inibidor de Protease sem EDTA completo
de placas multi-spot	Mesoscale	NA	Sector imager 6000
Ensaios	mesoescala		10-plex e ensaio de quimiocina 9-plex, e IL-17A singleplex, TGF-β 1 e TSLP. Uma descrição pode ser encontrada online no www.mesoscale.com