Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica não-invasiva para a amostragem de líquido imperturbado mucosa das vias aéreas superiores. Ele pode ser usado para realizar a quantificação dos níveis na vivo de mediadores de proteína, tais como citocinas e quimiocinas, em indivíduos de todas as idades.

Resumo

Este protocolo descreve a amostragem não-invasiva de fluido de mucosa das vias aéreas superiores não perturbadas. Ele também detalha o procedimento de extracção utilizado antes da análise dos mediadores imunes em eluídos fluidos para o estudo da via aérea tópica imune assinatura, sem a necessidade de procedimentos de estimulação (frequentemente usados por outras técnicas). O fluido de mucosa é amostrado em uma tira de papel de filtro colocado na parte anterior do corneto e esquerdo por 2 min de absorção inferior. Analitos são eluídos dos papéis de filtro, e os eluídos extraídos à base de proteínas são analisados por um imunoensaio baseado em eletroquimioluminescência, permitindo a quantificação de alta sensibilidade de analitos de baixo e de alto nível na mesma amostra. Medimos os níveis na vivo de 20 mediadores imunes pré-selecionadas relacionados com imunológico específico sinalização de caminhos na mucosa das vias aéreas superiores, mas a técnica não está limitada a esse painel específico ou local de amostragem. A técnica foi primeiramente implementada em crianças de 7 anos desde os estudos prospectivos de Copenhaga sobre asma em coorte de₂₀₀₀ (COPSAC₂₀₀₀) de infância com rinite alérgica. Posteriormente foi usado no COPSAC₂₀₁₀ nascimento coorte longitudinal, amostrada em 1 mês, 2 anos e 6 anos de idade e em instâncias de sintomas respiratórios agudos. Estamos com sucesso obtidas e analisadas amostras de 620 (89%) de 700 crianças de 1 mês de idade; algumas amostras estavam abaixo do limite de detecção do ensaio (relatado como a mediana (intervalo inter-quartil (IQR)). O número de amostras abaixo do limite de detecção (ou seja, de 0 até o ponto de ajuste para o limite inferior de detecção) para cada mediador foi 29 (7.25-119,5). Esta técnica permite a quantificação do vivo em vias aéreas da mucosa imune perfil desde o nascimento, pode ser aplicada no sentido longitudinal e pode ser aplicada a estudos sobre o efeito da genética e exposições ambientais iniciais de vida, fisiopatologia, endotyping e monitoramento de doenças respiratórias e desenvolvimento e avaliação de novas terapêuticas.

Introdução

O fluido da mucosa do nariz torna-se a parte líquida do sistema superior-das vias respiratórias. Consiste de uma matriz complexa de mediadores derivado a interação entre o epitélio e as células imunitárias que compõem a primeira linha de defesa contra a invasão de microorganismos. A mucosa nasal é facilmente acessível, e há uma forte relação funcional e imunológica entre o nariz e os brônquios¹. Este compartimento é de especial interesse em relação às doenças das vias respiratórias que são comuns na infância, como asma e rinite alérgica, mas também a uma gama de outras doenças respiratórias mais prevalentes mais tarde na vida.

Protocolo

Os estudos foram conduzidos em conformidade com os princípios orientadores da declaração de Helsinque. Aprovação do Comitê de ética para Copenhaga (KF 01-289/96 para COPSAC₂₀₀₀ ) e H-B-2008-093 para COPSAC₂₀₁₀e Agência Dinamarquesa de proteção de dados foram obtidas, e foi obtido consentimento escrito de ambos os pais de cada assunto antes de inscrição.

1. experimental Setup

1. Use folhas de papel de filtro (folhas de poliéster-hidroxilados fibrosas, consulte a Tabela de materiais)^6,7.
   1. Corte em tiras de 3 x 15 mm em tamanho para uma criança de 1 ....

Resultados

Características Basais dos Perfis Imunológicos das Vias Aéreas:
Dados completos sobre os níveis de mediadores imunes da mucosa das vias aéreas superiores aos 1 mês de idade foram obtidos em 620 (89%) das 700 crianças inscritas na coorte COPSAC₂₀₁₀. Dez recém-nascidos foram inscritos antes que a técnica fosse estabelecida, e 19 não compareceram à consulta de 1 mês. Além disso, 47 amostras foram excluídas porque foram extraídas e medidas em outro laboratório .......

Discussão

Com a técnica apresentada aqui, éramos capazes de determinar na vivo superior-via aérea da mucosa imune perfil em crianças desde o início como 1 mês de idade, que não foi feito anteriormente. Observamos que a presença de bactérias específicas das vias respiratórias e picornaviruses^7,11, bem como outros pré e perinatais exposições, foram espelhadas no perfil imune dos recém-nascidos das vias respiratórias. Além disso, usamos esses dados de perfil imune da.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Folhas de poliéster hidroxilado fibroso	Accuwik Ultra	SPR0730	Papel de filtro
Milliplex Assay Buffer	Millipore	L-AB	Buffer
Placas de armazenamento de baixa ligação a proteínas	Placas	de CLS8161	Thermo Scientific
Inibidor de Protease	Roche	11873580001	Leitor de Coquetel Inibidor de Protease sem EDTA completo
de placas multi-spot	Mesoscale	NA	Sector imager 6000
Ensaios	mesoescala		10-plex e ensaio de quimiocina 9-plex, e IL-17A singleplex, TGF-β 1 e TSLP. Uma descrição pode ser encontrada online no www.mesoscale.com

Ensaio de citocina TH1/TH2 humana de