Artigo de método

Preparação em média Drosophila Extractos de embrião para experiências proteômicas

DOI:

10.3791/55804

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30 de maio de 2017

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1Biology Department, University of Massachusetts Boston, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego

Neste artigo

Resumo

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O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem direta e econômica para a coleta de embriões de Drosophila em escala média (0,5-1 g) e a preparação de extratos de proteínas que podem ser utilizados em aplicações proteômicas a jusante, como a purificação por afinidade - espectrometria de massa (AP-MS ).

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A análise das interações proteína-proteína (IPPs) tornou-se uma abordagem indispensável para estudar processos e mecanismos biológicos, como sinalização celular, desenvolvimento de organismos e doenças. Muitas vezes, é desejável obter informações PPI usando material in vivo , para obter a visão mais natural e imparcial das redes de interação. A mosca da fruta Drosophila melanogaster é uma excelente plataforma para estudar PPIs in vivo e se presta a abordagens diretas para isolar material para experiências bioquímicas. Em particular, os embriões de moscas da fruta representam um tipo conveniente de tecido para estudar PPIs, devido à facilidade de colecionar animais neste estágio de desenvolvimento e ao fato de que a maioria das proteínas são expressas em embriogênese, proporcionando assim um ambiente relevante para revelar a maior parte dos PPIs. Aqui apresentamos um protocolo para a coleta de embriões de Drosophila em escala média (0,5-1 g), o que é uma quantidade ideal para uma ampla gama deAplicações proteômicas, incluindo a análise de PPIs por purificação por afinidade - espectrometria de massa (AP-MS). Nós descrevemos nossos projetos para gaiolas de 1 L e 5 L para coleções de embriões que podem ser facilmente e economicamente instaladas em qualquer laboratório. Nós também fornecemos um protocolo geral para a coleta de embriões e extração de proteínas para gerar lisados ​​que podem ser usados ​​diretamente em aplicações a jusante, como AP-MS. Nosso objetivo é fornecer um meio acessível para todos os pesquisadores para realizar as análises de PPIs in vivo .

Introdução

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As telas genéticas e, mais recentemente, as abordagens genômicas revolucionaram o estudo das funções biológicas. No entanto, a informação celular importante é codificada em proteínas e seu conjunto de parceiros interagindo. Enquanto as telas modificadoras genéticas tradicionais podem identificar componentes de via limitante de taxa e recuperar interações indiretas, a força das abordagens proteômicas reside na sua capacidade de identificar redes de interação imediata completa de proteínas de interesse. A proteômica é, portanto, um método ortogonal valioso para estudar sistemas biológicos e complementa genômica, transcriptômica e telas genéticas tradicionais. A purificação por afinidade - espectrometria de massa (AP-MS) provou ser uma abordagem poderosa para estudar interações proteína-proteína (IPPs) em seu ambiente nativo em células e tecidos 1 , 2 . Este método permite a identificação de interações diretas ou indiretas em desenvolvimento específicoEm estágios ou contextos de tecido, e foi usado com sucesso para identificar múltiplos IPIs novos em uma variedade de caminhos de desenvolvimento (revisados ​​na referência 1 ). Apesar do sucesso incontestável dos estudos PPI, a maioria deles foi realizada em células cultivadas, nas quais as proteínas de interesse "isca" foram sobre-expressadas. Existem dois problemas com o estudo de PPIs em cultura de células: primeiro, uma linha celular específica pode não fornecer um complemento completo de interações devido à falta de expressão de certas proteínas. Em segundo lugar, uma alta sobreexpressão geralmente empregada em tais análises pode levar a artefatos como o erro de administração de proteínas ou a identificação de interações falso-positivas.

Ambas estas limitações podem ser superadas através da análise de IPP in vivo . Um passo limitante em tais experiências é a disponibilidade do material de partida para a purificação de complexos de proteínas. Drosophila melanogaster tem sido usado como modelo para análise funcionalSis, e recentemente também mostrou ser um excelente sistema para estudar PPIs in vivo . A embriogênese de Drosophila representa um tipo de tecido particularmente atraente para estudar PPIs, porque os embriões podem ser facilmente coletados em grandes quantidades, e também porque a maioria dos genes (> 88%) são expressos ao longo da embriogênese, proporcionando assim um ambiente rico e in vivo para detectar informações relevantes PPIs 3 .

Tradicionalmente, estudos bioquímicos em moscas utilizaram coleções de embriões de grande escala (100-150 g), como as necessárias para a purificação de lisados ​​funcionais de transcrição 4 , 5 . Estudos anteriores de AP-MS em Drosophila também precisavam de grandes quantidades de embriões (5-10 g), porque dependiam de uma abordagem de purificação em duas etapas, como a purificação por afinidade em tandem (TAP), com a perda associada de material em cada etapa 6 . Amoun grandeO material inicial exigiu a criação de coleções de embriões em grandes gaiolas de população, que podem ser caras (quando compradas comercialmente) e demoradas para manter e limpar 7 , 8 , 9 .

Avanços recentes no desenvolvimento de abordagens de purificação de afinidade de passo único, bem como a crescente sensibilidade dos espectrômetros de massa, reduziram a quantidade necessária de material de partida por uma ordem de grandeza. Usando tags como o péptido de ligação à estreptavidina (SBP) ou a proteína fluorescente verde (GFP) e a partir de menos de 1 g de embriões, é possível isolar as quantidades de proteína de isca e componentes interagentes que seriam suficientes para identificação por Espectrometria de massa 10 , 11 .

O objetivo do protocolo aqui apresentado é ajudar os pesquisadores a superarEu uma barreira percebida para análise bioquímica de IPPs in vivo . Para esse fim, fornecemos um procedimento simples e barato para coletar embriões de Drosophila em escala média (0,5-1 g), seguido de preparação de um passo de extratos de proteínas de células inteiras que são adequados para posterior análise por AP-MS ou outras abordagens . Nosso método baseia-se no uso de gaiolas de população feitas sob medida de 1 -L ou 5-L que podem ser facilmente produzidas por qualquer laboratório. Além disso, as condições de extração apresentadas aqui foram validadas em vários estudos, tanto em células cultivadas como in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

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Protocolo

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1. Preparação de gaiolas de mosca de 5 L (para montar placas de 15 cm)

  1. Obtenha os materiais necessários: recipiente de 5 litros (4.7-L) com tampa ( Figura 1A ), malha de nylon e uma lâmina de barbear.
  2. Marque um círculo de 12 cm de diâmetro e corte um orifício na parte inferior do recipiente usando a lâmina de barbear ( Figura 1B ). Corte um orifício de 15 cm de diâmetro na tampa ( Figura 1C ).
  3. Corte a malha de nylon em 25 x 25 cm quadrados.
  4. Coloque a malha sobre a borda superior do recipiente e pressione com a tampa ( Figura 1C ). Verifique se a malha está apertada ea tampa não está inclinada. A gaiola está pronta para ser povoada com moscas (ver passo 5.3).

2. Preparação de 1 L de gaiolas de mosca (para colocar placas de 10 cm)

  1. Obtenha os materiais necessários: uma broca elétrica, uma ferramenta de corte de 3 polegadas (76 mm) ( Figura 1E e FFigura 1F), um frasco de plástico de 1 L de lado direito com tampa, malha de nylon, lâmina de barbear, papel de lixa, óculos de proteção e luvas de trabalho.
  2. Corte os orifícios de 3 polegadas (76 mm) na parte inferior e a tampa do recipiente de plástico ( Figura 1G ), com a tampa firmemente presa no recipiente durante a perfuração. Posicione a ferramenta de corte no centro do círculo ao começar a fazer um furo.
    Cuidado: use estampas de proteção para os olhos e trabalho durante este passo.
  3. Suavizar as bordas dos furos com uma lâmina de barbear e lixa.
  4. Corte a malha de nylon em 18 x 18 cm quadrados.
  5. Coloque a malha sobre a borda superior da jarra e aperte apertando a tampa ( Figura 1G ). Verifique se a malha está apertada ea tampa não está inclinada. A gaiola está pronta para ser povoada com moscas (ver passo 5.3).

3. Preparação de pratos de suco de maçã (AJ)

  1. Adicione 19 g de ágar e 1 L de 18,2 MΩ · cm de água em um balão de 2 L.Adicione uma barra de agitação e misture brevemente.
  2. Autoclave durante 30 min. Enquanto isso, descongelar 100% de concentrado de suco de maçã a partir de estoque congelado e preparar 10 mL de solução de 4-hidroxibenzoato de metilo a 10% (peso / volume) em etanol.
  3. Após o autoclave, comece a misturar o ágar em uma placa de agitação e adicione 80 ml de concentrado de suco de maçã 100% e 10 ml de solução de 4-hidroxibenzoato de metilo a 10% (peso / volume) no balão. Deixe esfriar à temperatura ambiente com mistura constante.
  4. Despeje as placas de Petri de 15 cm (para gaiolas de 5 L) ou placas de Petri de 10 cm (para gaiolas de 1 L) de modo que o nível de agar em cada prato tenha aproximadamente 5 mm de espessura. Deixe-o solidificar à temperatura ambiente e envolva em sacos plásticos. As placas AJ podem ser armazenadas a 4 ° C durante duas semanas.
    Nota: Os pratos de Petri podem ser lavados e reutilizados.
  5. Prepare pasta de levedura molhada: despeje um pouco de fermento seco ativo em um recipiente de 100 mL com uma tampa que permita uma mistura fácil e adicione água em pequenas quantidades enquanto mexa, para obter uma mistura grossa, mas completamente misturadacolar. Armazenar a 4 ° C por até 2 semanas.

4. Preparação de Reagentes de Lise

  1. Preparar 5x tampão de lise: 250 mM Tris pH 7,5, 25% de glicerol, 1% de octilfenoxi poli (etilenoxi) etanol (IGEPAL CA-630), 7,5 mM de MgCl2, 625 mM de NaCl, 125 mM de NaF, 5 mM de Na 3 VO 4 .
    1. Para fazer 200 mL: dissolver completamente 1 g de NaF em pó e 184 mg de Na3 VO4 em pó em 71 mL de água com agitação constante. Adicionar 50 mL de Tris 1 M pH 7,5, 2 mL de IGEPAL a 100%, 1,5 mL de MgCl2 1 M e 25 mL de NaCl 5 M. Em seguida, adicione 50 mL de glicerol (adicione o último) e continue mexendo durante 1 h.
    2. Filtra-esterilize usando unidades de filtro de 250 mL. Este passo pode ser lento, mas a filtragem da solução é importante para remover partículas insolúveis. Alíquota por 10 mL em tubos de 50 mL e armazene a -80 ° C.
  2. Prepare a solução de ditiotreitol 1 M (DTT) em água. Armazenar a -20 ° C em alíquotas de 1 mL.
  3. Obter proteComprimidos de cocktail de inibidores de tecidos com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Armazenar a 4 ° C.
  4. Obtenha 10 mL de seringas e filtros de seringas: 26 mm de diâmetro, membrana de acetato de celulose livre de surfactante (SFCA), tamanho de poro de 0,45 μm.

5. Coleção de embriões de mosca

  1. Amplifique as linhas de moscas transgênicas que transportam a proteína marcada de interesse em garrafas (aproximadamente 100 moscas por garrafa) e transfira as garrafas a cada 2 dias, até 25-30 garrafas serem acumuladas para cada linha de mosca. Amplifique o estoque de controle ( por exemplo, a linha yw ) de forma semelhante .
  2. As placas de AJ quente à temperatura ambiente (cerca de 1-2 h, podem ser feitas durante a noite). Usando um dedo enluvado, espalhe uma pasta de fermento molhada no centro das placas AJ, para fazer uma aprox. Círculo de 6 cm para uma placa de 15 cm e um círculo de 4 cm para uma placa de 10 cm.
  3. Anestesiar as moscas com um fluxo de dióxido de carbono usando uma configuração padrão do estágio Drosophila e transferir paraAs gaiolas (aproximadamente 15 garrafas de moscas bem cultivadas por gaiola de 5 L, 5 garrafas por gaiola de 1 L).
    1. Cubra o fundo da gaiola com placas AJ preparadas a partir do passo 5.2 e coloque a placa AJ na gaiola usando duas tiras de fita ( Figuras 1D e 1H ). É útil dobrar as pontas da fita que passam sobre a placa para fácil descamação ao trocar as placas.
    2. Depois que as moscas se recuperam da anestesia, mantenha as gaiolas com as placas na parte inferior e engate na parte superior.
      Nota: É importante esperar até que as moscas se recuperem completamente, pois, de outra forma, ficarão com a placa AJ e a pasta de levedura.
    3. No final do experimento, para preparar a gaiola para limpeza, coloque a gaiola no congelador por várias horas. Empurrar a malha na água por algumas horas facilitará a limpeza.
  4. Incube as gaiolas com moscas à temperatura ambiente por 2-3 dias e mude as placas de AJ duas vezes ao dia. Para mudar as placas, vire a gaiola de cabeça para baixo,Retire a fita do prato, mas segure o prato na gaiola, toque a gaiola toda suavemente no banco e troque rapidamente a placa velha para uma nova, tentando não permitir que as moscas escapem.
    Nota: as moscas precisam se ajustar à gaiola e estabelecerão o melhor início no dia 3. Eles continuarão a cair no nível máximo por cerca de 4-5 dias. Duas gaiolas de 5 L na capacidade de colocação superior podem produzir até 1 g de embriões em uma coleta durante a noite. Use gaiolas de 1 L para experiências em pequena escala.
  5. Permitir que as moscas lançem embriões em placas AJ frescas durante a noite (aproximadamente 16 h), ou para qualquer outro período de tempo desejado.
  6. Na manhã seguinte, marque e pesa recipientes de malha para coleta de embriões, um por cada linha de mosca usada.
  7. Preparar 1x tampão de lise, usando reagentes da seção 4 (Nota: o tampão de lise 1x listo para usar deve ser preparado imediatamente antes da extração): adicionar 40 mL de água a 10 mL de tampão de lise concentrado 5x (armazenado a -80 ° C) Em um tubo de 50 mL.
    1. Adicionar 50 μL de 1 MDTT até uma concentração final de 1 mM, misture bem e separe-se em dois tubos de 50 mL, 25 mL em cada um. Para um dos tubos, adicione um comprimido de inibidor de protease e gire a 4 ° C durante 30 min. Enquanto o comprimido está se dissolvendo, coletar e desenganar embriões (passos 5.8 a 6.6). Certifique-se de que o comprimido tenha sido completamente dissolvido e mantenha o tampão no gelo.
      Nota: O segundo tubo de 1x buffer com DTT pode ser armazenado a -80 ° C e só exigirá a adição do comprimido antes do próximo experimento. 25 mL de tampão de lise são suficientes para até 2 amostras, levando em consideração lavagens subseqüentes durante etapas de purificação de proteína.
  8. Marque as placas AJ nas gaiolas com os genótipos das linhas de moscas usadas e troque as placas para as frescas.
    Nota: O excesso de pasta de fermento pode ser raspado da placa neste passo. Os embriões podem ser envelhecidos nos pratos a 25 ° C ou temperatura ambiente para obter a janela desejada de tempo de desenvolvimento.
  9. Adicione água suficiente tO cobre cada placa AJ. Desliga suavemente os embriões da placa com um pincel macio (cabeça plana de aproximadamente 10 mm de largura funciona bem para placas grandes). Despeje os embriões no recipiente de malha previamente pesado e marcado e drene o excesso de água.
    1. Se necessário, execute um segundo enxaguamento e escovação da placa para remover todos os embriões. Combine os embriões da (s) placa (s) adicional (s) para a mesma linha da mosca no mesmo recipiente de malha.
  10. Bloqueie brevemente a malha em toalhas de papel para remover o excesso de água.

6. Dechorionação de embriões

  1. Meio-encha uma placa de Petri de 6 cm com 50% de alvejante (vol / vol solução em água).
    Nota: veja comentários importantes sobre a marca de água de bleach na Tabela de Materiais e Reagentes.
    Cuidado: use luvas e evite lixiviar a roupa.
  2. Prepare 2 pratos maiores de Petri com água.
  3. Mergulhe o recipiente de malha com embriões em 50% de alvejantes durante 90 s. Toque a malha suavemente durante o incuAlgumas vezes para suspender os embriões na solução de alvejante.
  4. No final da incubação de 90 s, lave o recipiente de malha em cada um dos 2 pratos com água por aproximadamente 10 s.
  5. Enxague bem o recipiente de malha com 18,2 MΩ · cm de água usando o frasco de esguicho. Além disso, lave os lados e o exterior do recipiente de malha.
    Nota: Nenhum cheiro de cloro deve ser detectado após uma lavagem completa.
  6. Bloquear o recipiente de malha em toalhas de papel. Pesar o recipiente de malha com os embriões e subtrair o peso do recipiente vazio obtido no passo 5.6. Registre o peso resultante dos embriões. Uma boa quantidade de embriões a atingir é de 0,5 a 1 g.

7. Preparação do extrato de embrião

  1. Adicione 1 mL de tampão de lise com inibidores de protease (do passo 5.7) a um homogeneizador de vidro Dounce e mantenha-o no gelo. Transfira os embriões do recipiente de malha para o homogeneizador.
    Nota: Os embriões podem ser apanhados com uma extremidade planaEspátula metálica ou uma escova e transferida diretamente para o buffer. Execute todas as etapas nesta seção no gelo.
  2. Lavar os embriões restantes na malha com um tampão de lise adicional de 1 mL e adicionar ao material no homogeneizador. Deixe os embriões se estabelecerem no fundo do homogeneizador e aspirar cuidadosamente o sobrenadante.
  3. Adicione o tampão de lise com inibidores de protease (do passo 5.7) ao homogeneizador, visando 5-6 mL de tampão de lise por grama de embriões.
  4. Homogeneizar os embriões por 4-6 traços com um pilão solto.
    Nota: Durante os primeiros traços, haverá mais resistência. Tente mover o pilão em um movimento contínuo para evitar salpicos da solução.
  5. Homogeneizar os embriões por 8-10 golpes com um pilão apertado.
  6. Incube o homogeneizado no gelo durante 20 min.
  7. Transfira o homogeneizado para tubos de microcentrífuga e centrifugue a 4 ° C durante 15 minutos à velocidade máxima (aproximadamente 13.000 xg).
  8. AvoidiAs pastilhas e a camada lipídica muito superior, transferem os sobrenadantes para tubos de microcentrífuga frescos e centrifugam a 4 ° C durante 15 minutos à velocidade máxima (aproximadamente 13.000 xg).
  9. Elimine cuidadosamente os sobrenadantes com uma ponta de 1 mL e carregue em seringas refrigeradas com 10 mL com filtros de 0,45 μm (combine alíquotas da mesma amostra em uma seringa). Empurre toda a solução para um tubo de 15 mL marcado em gelo. O extrato pode ser usado imediatamente para experiências de purificação de proteínas subsequentes ou congelado instantaneamente em nitrogênio líquido e mantido a -80 ° C para uso futuro.
    Nota: é melhor congelar os extratos do que os embriões, porque durante a descongelação subsequente de embriões, as proteases podem se tornar ativadas e levar à degradação da proteína.

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Resultados

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Para ilustrar o uso deste protocolo em um experimento de purificação de complexo proteico, geramos uma linha de mosca viável homozigoto, braço-EGFP-ERK , que expressa a cinase regulada por sinal extracelular Drosophila marcada com EGFP (ERK , codificada pelo gene enrolado ) sob o controle De um promotor de armadillo ( braço ) omnipresente expresso 18 , 19 . O promotor...

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Discussão

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O protocolo apresentado aqui é um procedimento simples e geral para a criação de gaiolas de população de Drosophila a escala média e a produção de extratos de proteínas de células inteiras de embriões. Os extratos resultantes podem ser utilizados em uma variedade de aplicações a jusante, tais como purificação de complexos de proteínas em resinas de afinidade. É fundamental realizar as etapas de extração no gelo e usar uma forte inibição da protease, para minimizar a degradação das proteínas. Conforme descrito, ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Os autores agradecem aos membros do laboratório da Veraksa por comentários úteis sobre o manuscrito e sugestões para melhorias no protocolo. O AV foi suportado pelas concessões NIH GM105813 e NS096402. LY foi apoiado pela Bolsa de Doutorado da Universidade de Massachusetts Boston Sanofi Genzyme.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Recipiente Multi Mix Natural Leaktite 5-Qt. (Pacote de 3)Home Depot209330Para fazer gaiolas de 5-L.
Tampa Multi Mix Natural Leaktite 5-Qt. (Pacote de 3)Home Depot209320Diâmetro 8.37 in. Tampas para gaiolas de 5 L.
Placas de Petri da marca Fisher com tampa transparente, 100 x 15 mmFisher ScientificFB0875712Material: Poliestireno. Para ser usado com gaiolas de 1 L.
Placas de Petri da marca Fisher com tampa transparente, 150 x 15 mmFisher ScientificFB0875714Material: Poliestireno. Para ser usado com gaiolas de 5 L.
Placas de Petri da marca Fisher com tampa transparente, 60 x 15 mmFisher ScientificFB0875713AMaterial: Poliestireno. Usado durante a descorionação embrionária.
Malha de nylon Sefar NITEXSefar03-180/44180 mícrons, 44% de área aberta, usada para gaiolas de mosca.
Milwaukee 3 pol. Serra Copo para Trator de Furo com ArborHome Depot49-56-9670Ferramenta de corte de 3 polegadas para fazer gaiolas de 1-L.
Frascos PMP de Boca Larga e Lados Retos Nalgene com Fecho de Parafuso de Polipropileno BrancoFisher Scientific11-823-33Para fazer gaiolas de 1-L. Gato Thermo Scientific # 21171000. Podem ser utilizados recipientes alternativos de 1 L.
Fermento Seco Ativo Red Star, bolsa de 2 librasRed Star pode ser adquirido de Amazon.com ou outros fornecedores.
Concentrado de Suco de Maçã 100% Congeladopode ser comprado em uma mercearia. Tem que dizer "100% suco de maçã" na lata.
O 4-hidroxibenzoato de metilaAcros Organicstambém AC126965000conhecido como metilparabeno ou Tegosept. Usado como conservante em placas AJ.
IGEPAL CA-630 para biologia molecular, 100 mlSigmaI8896usado para preparar tampão de lise.
Unidades de Filtro Descartáveis Estéreis de Fluxo Rápido Nalgene com Membrana CN Fisher Scientific09-740-2A0.2 μ m tamanho dos poros. Usado para filtrar o buffer de lise 5x. Gato Thermo Scientific # 1260020.
CO-RO ROCHE inibidor de protease completo CocktailSigma11697498001frasco de 20 comprimidos. Usado para inibição de protease em tampão de lise.
Filtros de seringa SFCA Corning Fisher Scientific09-754-21Membrana SFCA, diâmetro 26 mm, tamanho do poro 0,45 μm. Usado para filtrar amostras de extrato final.
BD  Seringas Descartáveis Luer-Lok sem AgulhasFisher Scientific14-823-2Apara filtrar amostras de extrato final. BD cat # 309604.
AlvejanteCloroxusado para descorionação de embriões a 50% (vol/vol) em água, pode ser adquirido em qualquer supermercado. É importante usar a marca Clorox, pois outras marcas podem resultar em descorionação incompleta ou podem ser tóxicas para embriões.
Placas de Rede Corning Costar FisherScientific07-200-213recipientes de malha para coleções de embriões. 74 μ Tamanho de malha de M, 6 poços.
Moedores de Tecidos Wheaton Dounce, capacidade 15 mlHomogeneizador Fisher Scientific06-435Bpara embriões, com pilões soltos e apertados. Gato Wheaton # 357544.

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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