Preparação em média<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embrião para experiências proteômicas

Resumo

O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem direta e econômica para a coleta de embriões de Drosophila em escala média (0,5-1 g) e a preparação de extratos de proteínas que podem ser utilizados em aplicações proteômicas a jusante, como a purificação por afinidade - espectrometria de massa (AP-MS ).

Resumo

A análise das interações proteína-proteína (IPPs) tornou-se uma abordagem indispensável para estudar processos e mecanismos biológicos, como sinalização celular, desenvolvimento de organismos e doenças. Muitas vezes, é desejável obter informações PPI usando material in vivo , para obter a visão mais natural e imparcial das redes de interação. A mosca da fruta Drosophila melanogaster é uma excelente plataforma para estudar PPIs in vivo e se presta a abordagens diretas para isolar material para experiências bioquímicas. Em particular, os embriões de moscas da fruta representam um tipo conveniente de tecido para estudar PPIs, devido à facilidade de colecionar animais neste estágio de desenvolvimento e ao fato de que a maioria das proteínas são expressas em embriogênese, proporcionando assim um ambiente relevante para revelar a maior parte dos PPIs. Aqui apresentamos um protocolo para a coleta de embriões de Drosophila em escala média (0,5-1 g), o que é uma quantidade ideal para uma ampla gama deAplicações proteômicas, incluindo a análise de PPIs por purificação por afinidade - espectrometria de massa (AP-MS). Nós descrevemos nossos projetos para gaiolas de 1 L e 5 L para coleções de embriões que podem ser facilmente e economicamente instaladas em qualquer laboratório. Nós também fornecemos um protocolo geral para a coleta de embriões e extração de proteínas para gerar lisados ​​que podem ser usados ​​diretamente em aplicações a jusante, como AP-MS. Nosso objetivo é fornecer um meio acessível para todos os pesquisadores para realizar as análises de PPIs in vivo .

Introdução

As telas genéticas e, mais recentemente, as abordagens genômicas revolucionaram o estudo das funções biológicas. No entanto, a informação celular importante é codificada em proteínas e seu conjunto de parceiros interagindo. Enquanto as telas modificadoras genéticas tradicionais podem identificar componentes de via limitante de taxa e recuperar interações indiretas, a força das abordagens proteômicas reside na sua capacidade de identificar redes de interação imediata completa de proteínas de interesse. A proteômica é, portanto, um método ortogonal valioso para estudar sistemas biológicos e complementa genômica, transcriptômica e telas genéticas tradicionais. A purific....

Protocolo

1. Preparação de gaiolas de mosca de 5 L (para montar placas de 15 cm)

1. Obtenha os materiais necessários: recipiente de 5 litros (4.7-L) com tampa ( Figura 1A ), malha de nylon e uma lâmina de barbear.
2. Marque um círculo de 12 cm de diâmetro e corte um orifício na parte inferior do recipiente usando a lâmina de barbear ( Figura 1B ). Corte um orifício de 15 cm de diâmetro na tampa ( Figura 1C ).
3. Corte a malha de nylon em 25 x 25 cm quadrados.
4. Coloque a malha sobre a borda superior do recipiente e pressione com a tampa (

Resultados

Para ilustrar o uso deste protocolo em um experimento de purificação de complexo proteico, geramos uma linha de mosca viável homozigoto, braço-EGFP-ERK , que expressa a cinase regulada por sinal extracelular Drosophila marcada com EGFP (ERK , codificada pelo gene enrolado ) sob o controle De um promotor de armadillo ( braço ) omnipresente expresso ^{18 , 19} . O promotor.......

Discussão

O protocolo apresentado aqui é um procedimento simples e geral para a criação de gaiolas de população de Drosophila a escala média e a produção de extratos de proteínas de células inteiras de embriões. Os extratos resultantes podem ser utilizados em uma variedade de aplicações a jusante, tais como purificação de complexos de proteínas em resinas de afinidade. É fundamental realizar as etapas de extração no gelo e usar uma forte inibição da protease, para minimizar a degradação das proteínas. Conforme descrito, .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Recipiente Multi Mix Natural Leaktite 5-Qt. (Pacote de 3)	Home Depot	209330	Para fazer gaiolas de 5-L.
Tampa Multi Mix Natural Leaktite 5-Qt. (Pacote de 3)	Home Depot	209320	Diâmetro 8.37 in. Tampas para gaiolas de 5 L.
Placas de Petri da marca Fisher com tampa transparente, 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	Material: Poliestireno. Para ser usado com gaiolas de 1 L.
Placas de Petri da marca Fisher com tampa transparente, 150 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875714	Material: Poliestireno. Para ser usado com gaiolas de 5 L.
Placas de Petri da marca Fisher com tampa transparente, 60 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A	Material: Poliestireno. Usado durante a descorionação embrionária.
Malha de nylon Sefar NITEX	Sefar	03-180/44	180 mícrons, 44% de área aberta, usada para gaiolas de mosca.
Milwaukee 3 pol. Serra Copo para Trator de Furo com Arbor	Home Depot	49-56-9670	Ferramenta de corte de 3 polegadas para fazer gaiolas de 1-L.
Frascos PMP de Boca Larga e Lados Retos Nalgene com Fecho de Parafuso de Polipropileno Branco	Fisher Scientific	11-823-33	Para fazer gaiolas de 1-L. Gato Thermo Scientific # 21171000. Podem ser utilizados recipientes alternativos de 1 L.
Fermento Seco Ativo Red Star, bolsa de 2 libras	Red Star		pode ser adquirido de Amazon.com ou outros fornecedores.
Concentrado de Suco de Maçã 100% Congelado			pode ser comprado em uma mercearia. Tem que dizer "100% suco de maçã" na lata.
O 4-hidroxibenzoato de metila	Acros Organics	também AC126965000	conhecido como metilparabeno ou Tegosept. Usado como conservante em placas AJ.
IGEPAL CA-630 para biologia molecular, 100 ml	Sigma	I8896	usado para preparar tampão de lise.
Unidades de Filtro Descartáveis Estéreis de Fluxo Rápido Nalgene com Membrana CN	Fisher Scientific	09-740-2A	0.2 μ m tamanho dos poros. Usado para filtrar o buffer de lise 5x. Gato Thermo Scientific # 1260020.
CO-RO ROCHE inibidor de protease completo Cocktail	Sigma	11697498001	frasco de 20 comprimidos. Usado para inibição de protease em tampão de lise.
Filtros de seringa SFCA Corning	Fisher Scientific	09-754-21	Membrana SFCA, diâmetro 26 mm, tamanho do poro 0,45 μm. Usado para filtrar amostras de extrato final.
BD  Seringas Descartáveis Luer-Lok sem Agulhas	Fisher Scientific	14-823-2A	para filtrar amostras de extrato final. BD cat # 309604.
Alvejante	Clorox		usado para descorionação de embriões a 50% (vol/vol) em água, pode ser adquirido em qualquer supermercado. É importante usar a marca Clorox, pois outras marcas podem resultar em descorionação incompleta ou podem ser tóxicas para embriões.
Placas de Rede Corning Costar Fisher	Scientific	07-200-213	recipientes de malha para coleções de embriões. 74 μ Tamanho de malha de M, 6 poços.
Moedores de Tecidos Wheaton Dounce, capacidade 15 ml	Homogeneizador Fisher Scientific	06-435B	para embriões, com pilões soltos e apertados. Gato Wheaton # 357544.