Métodos para a extração de endossimbiontes da mosca branca Bemisia tabaci

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar os endossimbionetas da mosca branca Bemisia tabaci através da dissecção e filtração. Após a amplificação, as amostras de DNA são adequadas para posterior seqüenciamento e estudo do mutualismo entre endosimbiontes e mosca branca.

Resumo

Os simbiontes bacterianos formam um relacionamento íntimo com seus hospedeiros e conferem vantagens aos hospedeiros na maioria dos casos. A informação genômica é fundamental para estudar as funções e a evolução dos simbiontes bacterianos em seu hospedeiro. Como a maioria dos simbiontes não pode ser cultivada in vitro , os métodos para isolar uma quantidade adequada de bactérias para o sequenciamento do genoma são muito importantes. Na mosca branca Bemisia tabaci , vários endossimbionos foram identificados e se prevê que sejam importantes no desenvolvimento e reprodução das pragas através de abordagens múltiplas. No entanto, o mecanismo subjacente às associações permanece em grande parte desconhecido. O obstáculo vem parcialmente do fato de que os endossimbicetos na mosca branca, principalmente retidos em bacteriócitos, são difíceis de separar das células hospedeiras. Aqui relatamos um protocolo passo-a-passo para a identificação, extração e purificação de endosimbiontes da mosca branca B. tabaci principalmente por dissectiSobre e filtração. As amostras de endossimbiontes preparadas por este método, apesar de ainda ser uma mistura de diferentes espécies de endosimbiontes, são adequadas para sequenciação subseqüente do genoma e análise das possíveis funções dos endossimbiontes em B. tabaci . Este método também pode ser usado para isolar endosimbionetas de outros insetos.

Introdução

As bactérias que formam uma relação simbiótica íntima com hospedeiros relativos são generalizadas nos artrópodes ¹ . Os endossimbiontes demonstraram afetar aspectos de hospedeiros, como o metabolismo nutricional, a reprodução, as respostas aos estresses ambientais ^{2 , 3 , 4} , etc. , em quase todos os estádios de desenvolvimento ⁵ . No entanto, o mecanismo subjacente às associações ainda é bastante desconhecido. A genômica é de prioridade e importância ao estudar as potenciais funções e papéis das bactérias. Algumas inf....

Protocolo

1. Criação de mosca branca e identificação de espécies criptípicas

1. Manter as espécies de moscas brancas em algodão Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) em gaiolas sob condições padrão de 27 ± 1 ° C, 70 ± 10% de umidade e 14 h de luz: 10 h de regime escuro.
2. Recolher uma mosca branca branca individual e homogeneizar em 30 μL de tampão de lise (Tris 10 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, 0,45% [wt / vol] Tween-20, 0,2% [wt / vol] de gelatina, 0,45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 g / mL Proteinase K).
3. Incubar o homogeneizado a 65 ° C durante 1 h e depois 100 ° C durante 10 min.
   NOTA: O tempo de incubação a 65 ° C pod....

Resultados

As espécies do Médio Oriente Ásia Menor 1 (MEAM1) do complexo B. tabaci foram tomadas como exemplo aqui para descrição. O algodão para a criação de moscas brancas e vários estádios de desenvolvimento de moscas brancas são mostrados na Figura 1, incluindo uma planta de algodão, mosca branca adulta e as ninfas ^{1ª, 2ª} e ^4ª instar da mosca branca (a ninfa do ^3º instar parece similar à ninfa do ^4º in.......

Discussão

Como os endossimbiontes dentro das moscas-brancas não podem ser cultivados in vitro, a dissecação e montagem de bacteriócitos é uma maneira eficaz de obter material genético suficiente de endossimbiontes. Antes da dissecação, as espécies de mosca-branca e endossimbiontes envolvidos devem ser explicitamente confirmadas. A mosca-branca B. tabaci é um complexo de espécies com mais de 35 espécies morfologicamente indistinguíveis e diferentes espécies crípticas podem conter diferentes endossimbiontes. Po.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Taq DNA polimerase	Takara	R001A	incluindo rTaq, 10× Kit de extração de DNA de gel tampão e dNTP
de sequenciamento de amostras de DNA	Qiagen
Micrótomo	Leica	EM UC7
Microscopia eletrônica de transmissão	Hitachi	H-7650 TEM
Microscópio estéreo	Zeiss	Stemi 2000-C
L microcarregador	Eppendorf	F2771951
Porta-filtro	Millipore	SX0001300
Filtro de membrana	Millipore	SMWP001300	5.0 μ m SMWP
REPLI-g UltraFast Mini Kit	Qiagen	150033	Kit de amlificação de DNA
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000
Qubit Fluorômetro	Thermo Fisher Scientific	Q33216
Sequenciador de Genoma	Illumina	Hiseq 2000