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As modalidades de imagem óptica de alta resolução, como a tomografia de coerência óptica, microscopia confocal e microscopia multiphoton, têm inúmeros benefícios. No entanto, a resolução espacial diminui significativamente à medida que a profundidade da imagem aumenta. Isto é devido à natureza difusa do transporte de luz nos tecidos moles 1 , 2 . A integração de excitação óptica e detecção de ultra-som fornece uma solução para superar o desafio da imagem ótica de alta resolução em tecidos profundos. A microscopia fotoacústica (PAM) é uma modalidade que pode proporcionar imagens mais profundas do que outras modalidades de imagem óptica. Foi aplicado com sucesso em imagens estruturais, funcionais, moleculares e celulares in vivo 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , combinando o forte contraste de absorção óptica com a alta resolução espacial do ultra-som.
No PAM, um pulso laser curto irradia o tecido / amostra. A absorção de luz por cromóforos ( por exemplo, melanina, hemoglobina, água, etc. ) resulta em um aumento de temperatura, o que, por sua vez, resulta na produção de ondas de pressão sob a forma de ondas acústicas (ondas fotoacústicas). As ondas fotoacústicas geradas podem ser detectadas por um transdutor ultra-sônico de banda larga fora do limite do tecido. Utilizando fraca focagem acústica óptica e apertada, a imagem em tecido profundo pode ser alcançada em microscopia fotoacústica de resolução acústica (AR-PAM) 14 , 15 , 16 . Em AR-PAM, uma resolução lateral de 45 μm e uma profundidade de imagem de até 3 mm foram demonstradas 15 . Para resolver capilares únicos (~ 5 μm) acústicamente, são necessários transdutores ultra-sônicos que operam em freqüências centrais de 400 MHz. Em tais freqüências altas, a profundidade de penetração é inferior a 100 μm. O problema causado pela focagem acústica apertada pode ser resolvido usando focagem ótica apertada. A microscopia fotoacústica de resolução óptica (OR-PAM) é capaz de resolver capilares únicos, ou mesmo uma única célula 17 , e uma resolução lateral de 0,5 μm foi alcançada 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . O uso de um nanojet fotônico pode ajudar a alcançar uma resolução além da resolução de difração limitadaN 25 , 26 . Em OR-PAM, a profundidade de penetração é limitada devido à focagem leve e pode representar uma imagem até ~ 1,2 mm dentro do tecido biológico 23 . Portanto, AR-PAM pode imagem mais profunda, mas com uma resolução menor, e OR-PAM pode imagem com uma resolução muito alta, mas com profundidade de imagem limitada. A velocidade de imagem do sistema AR e OR-PAM depende principalmente da taxa de repetição de pulso da fonte laser 27 .
A combinação de AR-PAM e OR-PAM será de grande benefício para aplicativos que exigem uma imagem de alta resolução e imagem mais profunda. Pouco esforço foi feito para combinar esses sistemas juntos. Normalmente, dois scanners de imagem diferentes são usados para imagens, o que requer que a amostra seja movida entre os dois sistemas, dificultando assim a realização de imagens in vivo . No entanto, a imagem híbrida com AR e OR PAM permite a imagem com resoluções escaláveis aE profundidades. Em uma abordagem, um feixe de fibra óptica é usado para fornecer luz tanto para AR como para OR PAM. Nesta abordagem, são utilizados dois laser separados (um laser de alta energia a 570 nm para o AR e um laser de baixa energia e alta repetição a 532 nm para o OR), o que torna o sistema inconveniente e caro 28 . O comprimento de onda do laser OR-PAM é fixo, e muitos estudos, como a saturação de oxigênio, não são possíveis usando esse sistema combinado. Estudos comparativos entre AR e OR PAM também não são possíveis devido à diferença nos comprimentos de onda do laser entre o AR e o OR. Além disso, AR-PAM usa iluminação de campo brilhante; Portanto, sinais fortes fotoacústicos da superfície da pele limitam a qualidade da imagem. Por este motivo, o sistema não pode ser usado para muitas aplicações de bioimagem. Em outra abordagem para executar AR e OR PAM, o foco óptico e ultra-som é deslocado, o que torna o foco da luz e o foco ultra-sonográfico desalinhados. Assim, a qualidade da imagem não é otimizada 29. Usando esta técnica, o AR-PAM e o OR-PAM podem alcançar apenas resoluções de 139 μm e 21 μm, respectivamente, tornando-o um sistema de baixa resolução. Outra abordagem, que inclui a mudança da fibra óptica e das opticas colimantes, foi relatada para alternar entre AR e OR PAM, tornando o processo de alinhamento difícil 30 . Em todos estes casos, AR-PAM não usou iluminação de campo escuro. O uso da iluminação do campo escuro pode reduzir a geração de sinais fotoacústicos fortes da superfície da pele. Portanto, a imagem de tecido profundo pode ser realizada usando iluminação em forma de anel, pois a sensibilidade de detecção de sinais fotoacústicos profundos será maior que a de iluminação de campo brilhante.
Este trabalho relata um sistema de imagem AR e OR PAM (AR-OR-PAM) comutável, capaz tanto de imagem de alta resolução quanto de imagem de baixa resolução de tecido profundo da mesma amostra, usando o mesmo laser e scanner para ambos os sistemasEms. O desempenho do sistema AR-OR-PAM foi caracterizado pela determinação da resolução espacial e da profundidade da imagem usando experiências fantasmas. A imagem de vasculatura de sangue in vivo foi realizada em uma orelha de rato para demonstrar sua capacidade de imagem biológica.