Determinação da Frequência Inibitória Óptima para Células Cânceras Utilizando Campos de Tratamento Tumoral (TTFields)

Resumo

Tumorais Tratar Campos (TTFields) são uma modalidade de tratamento anti-tumoral eficaz entregue através da aplicação contínua, não-invasivo de baixa intensidade, de frequência intermédia, alternando os campos eléctricos. TTFields aplicação de linhas de células utilizando um sistema in vitro de aplicação TTFields permite a determinação da frequência óptima que conduz à maior redução nas contagens de células.

Resumo

Os Campos de Tratamento Tumoral (TTFields) são uma modalidade de tratamento eficaz administrada através da aplicação contínua e não invasiva de campos eléctricos alternados de baixa intensidade (1-3 V / cm) na gama de frequências de várias centenas de kHz. O estudo de TTFields em cultura de tecidos é realizado utilizando o sistema de aplicação TTFields in vitro , que permite a aplicação de campos elétricos de freqüências e intensidades variáveis ​​a placas de Petri cerâmicas com uma constante dielétrica elevada (Ɛ> 5.000). Linhas celulares cancerosas colocadas em lamínulas no fundo das placas de Petri cerâmicas são submetidas a TTFields fornecidos em duas direcções ortogonais a várias frequências para facilitar os testes de resultados de tratamento, tais como contagens de células e ensaios clonogénicos. Os resultados apresentados neste relatório demonstram que a frequência óptima dos TTFields com respeito à contagem de células e ensaios clonogénicos é de 200 kHz para ambas as células de ovário e glioma.

Introdução

Campos tratamento de tumores (TTFields) são uma modalidade anti-mitótico para o tratamento de glioblastoma multiforme e potencialmente outros tipos de cancro. Os campos são distribuídos através da aplicação contínua de baixa intensidade (1-3 V / cm), de frequência intermédia (100-500 kHz), alternando campos eléctricos para a região do tumor ^{1, 2.} TTFields aplicação in vitro e in vivo foi demonstrado que inibem tanto o crescimento de várias linhas de células cancerosas e a progress dos tumores em vários modelos de tumores animais ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.} Ensaios clínicos e estudos-piloto randomizados maiores em pacientes com tumores sólidos, incluindo o glioblastoma e o cancro do pulmão de células não pequenas, têm demonstavaliaram a segurança e a eficácia da aplicação contínua TTFields ^{8, 9, 10.} A eficácia dos TTFields verificou-se ser: (1) dependente de frequência, com frequências óptimas específicas que conduzem à maior redução nas contagens de células de linhas celulares de diferentes origens ^{1, 2, 4, 5, 6, 7;} (2) intensidade-dependente, com um limiar mínimo para a actividade em cerca de 1 V / cm e as intensidades mais potentes superiores ^{1, 2, 7, 11} do campo eléctrico; (3) aumenta quando a duração do tratamento foi mais ^5; e (4) superior quando 2 TTFields direccionais foram aplicados perpendicularmente a cada other, em comparação com os campos eléctricos aplicados a partir de uma única direcção ^1. Com base nas conclusões acima, TTFields pode ser aplicada a pacientes durante longos períodos, utilizando 2 conjuntos de matrizes de transdutores localizados sobre a pele do paciente para maximizar as intensidades do campo eléctrico no leito tumoral ^{12, 13.}

O estudo dos efeitos de TTFields sobre as células cancerosas in vitro actualmente proporciona a única forma de determinar a frequência óptima para se aplicar a um tipo específico de tumor. Teste para a frequência óptima exige um dispositivo que permite a aplicação de diferentes frequências na faixa de 100-500 kHz e a intensidade de até 3 V / cm de raiz quadrada média (RMS) à cultura de células. Como aplicação TTFields produz calor, o sistema de aplicação requer a capacidade para dissipar o calor excessivo, mantendo um controlo apertado sobre a temperatura.

Vários dispositivos were desenvolvidos ao longo dos anos para permitir a aplicação TTFields a culturas de células ^{1, 2, 5, 14, 15, 16.} Em todos estes dispositivos, os eléctrodos usados foram isolados, a fim de evitar as ressalvas envolvidas com a utilização de eléctrodos condutores, tais como a troca de electrões na superfície do eléctrodo e a libertação de iões metálicos tóxicos para o meio de ^um. A principal diferença entre os vários sistemas de aplicação TTFields testados é do tipo de isolamento do eléctrodo utilizado, quer com eléctrodos feitos de fios de metal isolados com uma película fina de isolador ^{2, 14, 15, 16} ou com um material de alta dieléctrica constante (por exemplo, magnésio chumbo titanat niobato de chumboe (PMN-PT)) ^6. Embora os eléctrodos fios isolados oferecem uma solução relativamente simples e de baixo custo para aplicação TTFields, eles são muitas vezes limitados pela alta tensão necessária para atingir eficazes intensidades de campo eléctrico superior ao limiar de 1 V / cm e pela superfície disponível para o plaqueamento de células, medida que a distância entre os eléctrodos é relativamente pequena. Sistemas baseados em eletrodos isolados usando um material de alta dielétrico-constante requerem capacidades de design e fabricação especiais, mas eles não precisam de alta tensão e pode oferecer uma área maior para o crescimento celular entre os eletrodos.

O sistema in vitro de aplicação TTFields utilizado neste trabalho pertence a esta última classe de sistemas, com a unidade do núcleo ser uma placa de Petri (TTFields prato, ver Figura 1) composto de alta-dieléctrica constante de cerâmica (isto é, PMN-PT). Dois pares de eléctrodos são impressos perpendicularmente sobre a parede externasl de um prato TTFields para permitir a aplicação de campos eléctricos a partir de 2 direcções. Os eléctrodos são ligados a um gerador de forma de onda sinusoidal e um amplificador, que permitem a aplicação TTFields na gama de 50-500 kHz. De modo a se dissipar o calor excessivo, os pratos TTFields são mantidos dentro de uma incubadora refrigerada, com a temperatura do meio-controle realizados utilizando a monitorização constante da temperatura do prato e ajustes para a voltagem aplicada pelo sistema. Na prática, a configuração da incubadora para uma temperatura mais baixa iria conduzir a maiores intensidades de campo eléctrico, tal como o sistema aumenta a tensão até que a temperatura alvo no interior do prato é conseguido. A diferença entre a temperatura dentro do prato e a temperatura da incubadora pode levar a alguma evaporação, dependendo dos gradientes de temperatura; Assim, o meio de cultura deve ser substituído a cada 24 h para manter as condições de crescimento adequados.

O protocolo abaixodescreve o procedimento experimental para optimizar a aplicação de frequências TTFields para as células cancerosas de modo a que uma redução máxima no número de células e uma redução no potencial das células sobreviventes para formarem colónias são alcançados.

Protocolo

1. Em TTFields Application System Vitro - Placa de Base de Dados de Manutenção e louça

1. Lavar pratos e tampas prato em água corrente. Em seguida, enxagua-se com água desionizada e seca ao ar, virada para baixo.
2. Se um agente quimioterapêutico / droga foi adicionado aos pratos numa experiência antes, encher cada prato com uma solução detergente luz 5% e deixar durante a noite.
   1. Lavam-se as placas cuidadosamente com água da torneira corrente, para evitar quaisquer vestígios de detergente no interior do prato. Lavar os pratos e prato de cobre com água deionizada e rosto seco ar-down.
3. Insira os pratos limpos e secos, com suas capas em sacos de esterilização. Selar e colocar os sacos em autoclave, com os pratos virados para baixo. Autoclave durante 30 minutos a não superior a 121 ° C.
4. Defina a autoclave em um programa de seca, em parte, abrir a porta da autoclave, e secar os pratos para 30 min.
5. Limpar a placa de base com um pano ligeiramente humedecido com 70% de etanol.

Setup 2. Experiment

Nota: Todos os equipamentos e materiais utilizados neste protocolo são descritos na Lista de Materiais. Todos os passos a seguir devem ser realizadas dentro de uma câmara de fluxo laminar, enquanto as condições estéreis são mantidas.

1. Prepare limpas e estéreis TTFields pratos e tampas, tal como descrito na secção 1. Limpar a placa de base com um pano ligeiramente humedecido com 70% de etanol.
2. Instalar os pratos TTFields com as tampas para a placa de base ao pressionar para baixo suavemente sobre o prato e girando no sentido horário por cerca de 5 mm até a borda do prato as fechaduras para as três pinos sobre a placa de base. Coloque uma lamela de 22 mm estéreis (plástico ou vidro tratado) na parte inferior de cada prato.
3. Preparar a suspensão de células em meio de crescimento completo (meio de Dulbecco modificado de Eagle para U-87 MG e F98; meio RPMI para A2780 e OVCAR-3, suplementado, tal como descrito em Lista de Materiais).
   NOTA: O cell concentrações dependem da duração tipos de células e experimento, o crescimento de células confluentes a 90% 80% não deverá ser excedido pelo fim da experiência.
   CUIDADO: linhas de células humanas podem representar um perigo biológico e devem ser manuseados com as medidas de segurança adequadas.
4. Colocar 200 mL da suspensão de células (normalmente 5.000-20.000 células em 200 uL de uma 72-h experimento, dependendo do tempo de duplicao) como uma gota de água no centro de cada lamela e cobrir com as tampas de prato.
5. Incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO ₂ até que as células aderir; uma incubação durante a noite é possível nesta fase.
6. Aspirar os fluidos a partir da gota, utilizando uma pipeta de 200 ou de 1.000 mL.
7. Gentilmente pipeta 2 mL de meio de crescimento completo para encher cada prato. Utilizar uma ponta estéril de pipeta e suavemente toque nas arestas lamela para libertar as bolhas de ar capturadas ocasionalmente sob a lâmina.
8. Cobrir os pratos com as suas tampas e coloque-inside numa incubadora de _CO2 a 37 ° C, até o início do tratamento TTFields.

3. Aplicação TTFields

1. Transferir as placas de base com os pratos TTFields ligados a um refrigerado incubadora de CO _2.
   NOTA: In vitro aplicação TTFields irá gerar calor; por conseguinte, numa incubadora refrigerada é necessária para compensar o aquecimento dos pratos. TTFields mais elevadas intensidades irá produzir mais calor e requer menor incubadora temperatura ambiente (ver Tabela 1). Clinicamente intensidades TTFields relevantes são obtidos quando a temperatura da incubadora para aplicação TTFields é na gama de 18-30 ° C.
2. Ligar o conector do cabo fêmea plana à placa de base. Desligue o gerador TTFields diante.
3. Inicie os TTFields em software sistema de aplicação vitro e selecionar as configurações da experiência.
   1. Definir uma nova experiência. Digite o nome do experiment eo proprietário experiência na interface de usuário do software na tela do computador. Ajustar a frequência e a temperatura alvo para cada placa de prato ou de base.
4. Inicie a aplicação TTFields usando o software.
5. Verifique se todos os pratos estão conectados corretamente e aparecem em azul luz no monitor. Se um prato é circundada com um quadro vermelho (o que significa que ela não está devidamente ligado), pressionando-a suavemente e rodar lentamente para trás e para a frente até que os contactos sejam restaurados e o prato aparece luz azul.
6. Deixar os TTFields no sistema de aplicação in vitro em execução por até 24 horas.
7. Se o experimento atinge o seu ponto final, interromper a experiência, clicando no botão EXPERIÊNCIA END no software e avance para o passo 5. Se não, clique no experimento PAUSA.
8. Desconectar o conector do cabo plano da placa de base. Remover a placa de base com os pratos da incubadora para uma câmara de fluxo laminar.
9. Substituir o meio em toda pratoCada 24 h e devolver a placa de base à incubadora refrigerada. Conecte a placa de base ao gerador usando o cabo plano. Continue a experiência clicando no botão CONTINUAR.

4. Amostras de controlo

Nota: Cultivar células de controlo em condições semelhantes às células tratadas com TTFields, excluindo a aplicação de TTFields.

1. Amostras de controlo de placas com a mesma suspensão e sobre uma superfície similar utilizada para placas de amostras tratadas com TTFields.
2. Colocar os pratos de controlo num incubador de CO ₂ a 37 ° C.
3. Substituir o meio na louça a cada 24 h para combinar com o TTFields tratados condições médio prato.

5. Experiência Final

1. Depois de clicar em END EXPERIMENT, aguarde até que o software recupere todos os registros do sistema e salve os registros no computador.
2. Use o botão REPORTS para revisar a temperatura, corrente e registro de resistência fDe cada placa de base para verificar se todos os pratos foram tratados de acordo com o plano experimental.
   NOTA: Todos os relatórios e logs são salvos no computador após o término da experiência e podem ser revisados ​​a qualquer momento.
3. Desligue o gerador TTFields.
4. Desligue o cabo plano da placa de base e retire da incubadora.
5. Para remover um prato de cerâmica, pressione para baixo e gire o prato no sentido anti-horário para desbloqueá-lo da placa de base.
6. Leve os pratos em um armário de fluxo laminar e remova as lâminas de forma asséptica. Transfira-os para placas de Petri estéreis contendo meio fresco ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) para inspeção e avaliação adicionais.

6. Avaliação do efeito de TTFields

NOTA: Os efeitos de TTFields podem ser determinados de várias maneiras. Utilizar um ou mais dos seguintes métodos para comparar células tratadas com células de controlo não tratadas:

1. Contagem de células
   1. Remover o meio / PBS a partir de cada prato contendo lamela.
   2. Adicionar 0,5 mL de 0,25% de tripsina / EDTA a cada placa e incubar durante até 10 minutos (isto é, até as células se começarem a destacar da superfície da lamela) a 37 ° C em uma incubadora de CO _2.
   3. Adicionar 0,5 ml de meio de crescimento completo para neutralizar a tripsina e re-suspender as células pipetando suavemente para cima e para baixo.
   4. Contar as células utilizando qualquer técnica padrão de contagem de células que é compatível com a contagem baixas concentrações de células (isto é, cerca de 20.000 células / mL).
2. ensaio clonogénico
   1. Placa um número semelhante de células (100-500 células por placa) de cada prato para placas de Petri esterilizadas, novos ou placas de 6 cavidades contendo 2 mL de meio de crescimento completo e fresco.
   2. Incubar numa incubadora de _CO2 a 37 ° C durante 1-3 semanas (dependendo das propriedades de cada linha celular) até as colónias compostas por 50 ~ células são formadas. Avaliar a célulanúmero por colônia por microscopia de luz.
   3. Remover o meio e enxaguar com PBS.
   4. Remover o PBS e adicionar metanol arrefecido em gelo (1 ml). Incubar a -20 ° C durante 10 minutos ou mais.
   5. Remover o metanol.
   6. Adicionar solução de violeta de cristal (0,1% w / v em 25% v / v de metanol em água) e incubar durante 20 min.
      CUIDADO: Cristal violeta é um carcinógeno potencial; usar luvas ao trabalhar com cristal violeta.
   7. Remover o violeta cristal, lavar 3 vezes com água desionizada, e seca ao ar.
   8. Contar as colónias formadas em cada prato.

Resultados

Resultados após a aplicação TTFields quando digitalizando diferentes frequências pode ser quantificado com base em diferentes ensaios, tais como a contagem de células, ensaios colorimétricos, ensaios clonogénicos, e exames sobre as alterações no número de células invasoras, utilizando uma câmara de Boyden colocado dentro de um especiais TTFields de alta parede prato de cultura de células. planeamento experimental cuidadoso com base nos tempos de duplicação de células predeterminadas irá permitir que as células a atingir o número máximo de eventos miticos durante a duração do tratamento, maximizando assim os resultados do tratamento.

A Figura 2 ilustra um resultado típico de verificação de frequência para uma contagem média de células (isto é, o número de células) e ensaio clonogénico de A2780 (ou seja, células de cancro do ovário humano; Figura 2A) ⁷ e F-98 (isto é, células de glioma de rato;Os resultados demonstram uma redução significativa nas contagens de células em todas as frequências aplicadas (Figura 2B) ¹ tratados com dois TTFields direccionais (gama de frequência: 100-500 kHz, RMS: 1,7 V / cm e temperatura da incubadora: 18 ° C) , Com a redução máxima a 200 kHz para todas as linhas celulares testadas (ANOVA de uma via com comparação múltipla) A frequência óptima que conduz à maior redução no potencial clonogénico foi a mesma para as células A2780 e F98 ( Figuras 2B e C ) O coeficiente de correlação de Pearson entre o número de células eo efeito clonogênico em cada freqüência foi 0,967 (p = 0,002) e 0,755 (p = 0,083) para A2780 e F98, respectivamente.

A Figura 3 demonstra um resultado de varrimento de frequência para a contagem média de células para OVCAR-3 ( ie, células de cancro do ovário humano, Figura 3A ) e U-87 MG (ou seja, células de glioma humano; A Figura 3B) de células tratadas com dois sentidos de TTFields em diferentes intensidades (RMS: 1,7, 1,3, e 1,0 V / cm, respectivamente, e temperatura da incubadora: 18 ° C, 24 ° C, e 28 ° C, respectivamente). Os resultados demonstram que, enquanto ainda há uma significativa redução na contagem de células OVCAR-3 após o tratamento com TTFields 1,3-V / cm (temperatura da incubadora: 24 ° C), o efeito é relativamente pequeno em comparação com os resultados obtidos quando as células foram tratadas com 1,7 V / cm (temperatura da incubadora: 18 ° C). células U-87 MG tratada com TTFields 1,0-V / cm (temperatura da incubadora: 28 ° C) também demonstram uma tendência similar na redução do número de células como quando tratada com 1,7 V / cm, mas o efeito não foi significativo em intensidades inferiores .

Figure 1. TTFields pratos foram instalados numa unidade de placa de base e ligado ao cabo de controlo TTFields plana. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Varrimentos de frequência para a determinação da frequência inibidora óptimas TTFields para células (A) A2780 e (B) F98. As células foram tratadas durante 72 h com TTFields de diferentes frequências (1,7 V / cm e 100-500 kHz). O efeito do tratamento TTFields foi estimada utilizando a contagem de células e ensaios clonogénicos. A seta indica a frequência óptima. Os resultados representam as médias ± SD com base em, pelo menos, 6 repetições para cada frequência testado. (C) Imagens representativas da s clonogénico urvival de células A2780 após o tratamento TTFields a várias frequências. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Varrimentos de frequência para a determinação da frequência inibidora óptimas TTFields para (A) OVCAR-3 e (B) U-87 MG de células. As células foram tratadas durante 72 h com TTFields de frequências diferentes (100-500 kHz) e intensidades (OVCAR-3: 1,3 e 1,7 V / cm; U-87 MG: 1,0 e 1,7 V / cm). O efeito do tratamento TTFields foi estimada utilizando contagens celulares. A seta indica a frequência óptima. Os resultados representam as médias ± SD com base em, pelo menos, 6 réplicas em cada frequência testado.Pg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Temperatura ambiente da incubadora	Intensidades TTFields esperadas
(° C)	(V / cm RMS)
18	1,62
19	1,55
20	1,48
21	1,41
22	1,33
23	1,26
24	1,19
25	1,12
26	1,04
27	0,97
28	0,9
29	0,83
30	0,76

Tabela 1. Temperatura ambiente da incubadora e intensidades TTFields esperadas dentro do prato TTFields.

Discussão

TTFields são uma modalidade anti-tumor emergente baseado na aplicação contínua de campos eltricos alternados devidamente afinados ^{1, 2, 8, 9, 10, 17.} Maximizando a eficácia anti-tumoral é um resultado desejável para todas as modalidades de tratamento. Assim, "lutando" para cada por cento adicional de inibição do crescimento de células cancerosas podem ter um efeito significativo sobre o resultado clínico a longo prazo para os pacientes. Isto é devido à natureza contínua necessária de aplicação TTFields eo efeito cumulativo resultante. Maximizando a aplicação TTFields pode ser conseguido de várias maneiras: (1) aumentar a intensidade do campo eléctrico ^{1, 7,} (2) a duração do tratamento alongamento ^5, (3) encontrar o mais eficaz associaçno com outras modalidades de tratamento ^{18, 19,} e (4), que define a frequência óptima ^{1, 2, 4, 6, 7.} Maximizando a intensidade do campo eléctrico no local do tumor é conseguida através da optimização da localização das matrizes sobre a pele do paciente; isto permite a entrega da intensidade do campo máxima para o tumor com base na anatomia individual do paciente ^20. Alongamento duração do tratamento depende principalmente da adesão do paciente ao tratamento (por, pelo menos, 18 h por dia) ^17. Encontrar a combinação certa com outras terapias e determinar a frequência óptima depende fortemente de resultados in vitro, como não há marcadores validados para TTFields os resultados do tratamento são actualmente disponíveis. Neste trabalho, nós descrevemos o p experimentalPROCEDIMENTOS necessária para determinar a frequência óptima para TTFields linhas de células cancerosas usando o sistema in vitro de TTFields aplicação. Os métodos descritos aqui podem potencialmente ser utilizados para pesquisar a combinação de outras modalidades de tratamento do cancro (por exemplo, agentes de quimioterapia ou irradiação) com TTFields e para determinar a frequência óptima para administração TTFields para cada tratamento combinado específico.

De acordo com publicações anteriores, os resultados apresentados aqui demonstram que a frequência óptima para o tratamento de ambas as células de glioma e culas de cancro do ovário é de 200 kHz ^{1, 7.} Neste trabalho, nós demonstramos pela primeira vez que a frequência TTFields ideal para reduzir o potencial clonogénico está relacionado com a frequência que leva para o efeito citotóxico máximo. Os métodos utilizados neste trabalho para quantificar os efeitos de TTFields (ou seja, citotóxica e clonogénico) umre apenas duas das muitas possíveis ensaios de ponto final padrão para avaliar os resultados do tratamento. Testes adicionais resultado de tratamento incluem: (1) de fixação, coloração, e de montar as lamelas em que as células são plaqueadas sobre um microscópio para a visualização das estruturas intracelulares; (2) realizar ensaios de extractos de proteína e ARN, quer a partir dos próprios pratos TTFields ou depois de transferir a lamela a um novo prato descartável; e (3) trypsinizing células coradas para citometria de fluxo de análise.

planejamento experimental cuidadosa terá impacto sobre os resultados do tratamento após a entrega do TTFields. Os passos chave incluem a garantia de que a proliferação de células ao longo da experiência não conduz ao crescimento excessivo e utilizando a intensidade do campo eléctrico apropriado, como intensidades que são demasiado elevados quando aplicada a linhas de células sensíveis irão resultar em demasiado poucas células para os ensaios necessários para determinar a frequência óptima. Por outro lado, TTFields aplicadas em intensidades extremamente baixasEm linhas celulares menos sensíveis resultará em pequenos efeitos que podem ser mascarados por variação inerente. Os registros de tratamento devem ser examinados para obter informações valiosas sobre estabilidade de temperatura, correntes elétricas e resistência para cada prato durante todo o experimento. A substituição de pratos defeituosos no início do tratamento e a exclusão de dados de um prato que não satisfizesse os parâmetros de tratamento desejáveis ​​minimizarão a variabilidade entre repetições.

Em resumo, os TTFields são uma modalidade de tratamento anticancerígeno emergente que já demonstrou eficácia e segurança em contextos clínicos ^{8 , 9 , 10} . O teste de TTFields numa configuração in vitro utilizando os protocolos aqui descritos pode permitir a optimização dos parâmetros de tratamento TTFields no contexto clínico e pode alargar a nossa compreensão do mecanismo de acção subjacente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema e software inovitro	Novocure	ITG1000 e IBP1000	Cada unidade contém 1 gerador TTFields, 1 placa de base, 8 pratos TTFields com tampas e 1 cabo plano.
Sacos de esterilização	Westfield medical	24882
Lâminas de cobertura de plástico	Thermo Scientific (NUNC)	174977	Pré tratadas e esterilizadas
Lâminas de cobertura de vidro	Thermo Scientific (Menzel-Glä ser)	CB00220RA1	Esterilizar se necessário
Dulbecco' s Águia modificada' s medium	Biological Industries (Israel)	01-055-1A	Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
RPMI 1640	Gibco	21875-034	Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Soro Fetal Bovino (FBS)	Indústrias Biológicas (Israel)	04-007-1A	Quente em 37 ° C banho-maria antes
do uso L-Glutamina 200 mM (100x)	Gibco	25030-029
Pen/Strep (10,000 U/mL Penicilina, 10,000 µ g/mL Estreptomicina)	Gibco	15140-122
Solução de Piruvato de Sódio 100 mM	Biological Industries (Israel)	03-042-1B
Tampão de hepes 1 M	Biological Industries (Israel)	03-025-1B
Solução de insulina de pâncreas bovino	Sigma-Aldrich	10516-5ML
0,25% Tripsina/EDTA	Biological Industries (Israel)	03-050-1B	Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Metanol	Merck	1.06009.2511	Resfrie a -20 ° C no freezer antes de usar
Cristal violeta	Sigma-Aldrich	120M1445	Nocivo. Prepare a solução violeta de cristal a 0,1% p / v em 25% de metanol e 75% de água.
Detergente leve	Alcononx	242985	Prepare a solução a 5% em água ou de acordo com as instruções do fabricante.
PBS	Biological Industries (Israel)	02-023-1A	Sem cálcio e magnésio
A2780	ECACC	93112519	Crescer em RPMI 1640 suplementado com FBS (10%), caneta/estreptococo (100  U/mL / 100  µ g/mL), piruvato de sódio (1  mM) e tampão Hepes (12  mM).
F98	ATCC	CRL-2397	Crescer em Dulbecco' s Águia modificada' s meio suplementado com FBS (10%), caneta/estreptococos (100  U/mL / 100  µ g/mL), piruvato de sódio (1  mM) e glutamina (2  mM).
Ovcar-3	ATCC	HTB-161	Cresce em RPMI 1640 suplementado com FBS (20%), caneta/estreptococo (100  U/mL / 100  µ g/mL), piruvato de sódio (1  mM), tampão Hepes (12  mM) e insulina (10  µ g/mL).
U-87 MG	ATCC	HTB-14	Crescer em Dulbecco ' s Águia modificada' s meio suplementado com FBS (10%), caneta/estreptococos (100  U/mL / 100  µ g/mL), piruvato de sódio (1 mM) e glutamina (2  mM).
incubadora de CO2	CARON	7404-10-3
Armário de fluxo laminar	ADS Laminair	Bio12 e VSM12