Patógeno de origem alimentar rastreio usando Nanosensor Magneto-fluorescente: Rápida detecção de Escherichia Coli O157: H7

Summary

O objetivo geral do presente protocolo é para sintetizar nanosensors funcional para o portátil, econômica, e rápida detecção de direcionado especificamente bactérias patogênicas através de uma combinação de relaxação magnética e as modalidades de emissão de fluorescência.

Abstract

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 tem sido associada a ambos de origem hídrica e doenças transmitidas por alimentos e continua a ser uma ameaça, apesar dos métodos de seleção de alimentos e de água usada atualmente. Enquanto os métodos de detecção bacteriana convencional, tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e ensaios imunoenzimático (ELISA) especificamente podem detectar contaminantes patogênicos, eles exigem preparação da amostra extensa e longos períodos de espera. Além disso, estas práticas exigem instrumentos de laboratório sofisticado e configurações e devem ser executadas por profissionais treinados. Neste documento, propõe-se um protocolo para uma técnica de diagnóstica mais simples que apresenta uma combinação única de parâmetros magnéticos e fluorescentes em uma plataforma baseada em nanopartículas. O nanosensors de magneto-fluorescente Multiparamétrico proposto (MFnS) pode detectar a contaminação de Escherichia coli O157: H7 com tão pouco quanto 1 unidade formadoras presente em solução dentro de menos de 1 h. Além disso, a capacidade de MFnS permanecem altamente funcional em meios complexos tais como leite e água do lago foi verificada. Ensaios de especificidade adicionais também foram utilizados para demonstrar a capacidade de MFnS para detectar somente as bactérias do alvo específico, mesmo na presença de espécies bacterianas semelhantes. O emparelhamento de modalidades magnéticas e fluorescentes permite a detecção e quantificação de contaminação do patógeno em uma ampla gama de concentrações, exibindo seu alto desempenho em ambos deteção de contaminação e tarde-estágio inicial. A eficácia, acessibilidade e portabilidade dos MFnS torná-los um candidato ideal para o rastreio de point-of-care para bactérias contaminantes em uma ampla gama de configurações, de reservatórios aquáticos para alimentos embalados comercialmente.

Introduction

A ocorrência persistente de contaminação bacteriana em ambos produzidos comercialmente alimentos e fontes de água criou uma necessidade de plataformas de diagnósticos cada vez mais rápidas e específicas. ^{1 , 2} alguns dos contaminantes bacterianos mais comuns responsáveis pela contaminação de alimentos e água são dos gêneros Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus e Escherichia. ^{3 , 4} a contaminação bacteriana por esses patógenos frequentemente resulta em sintomas como diarreia, cólera, gastroenterite e febre. ⁴ contaminação das fontes de água, muitas vezes tem efeitos adversos e drásticos em comunidades sem acesso a água filtrada suficientemente, e contaminação de alimentos tem levado a um grande número de doenças e esforços de recuperação do produto. ^{5 , 6}

A fim de reduzir a ocorrência de doenças causadas por contaminação bacteriana, tem havido uma série de esforços para desenvolver métodos pelos quais água e alimentos podem ser eficientemente verificados antes da venda ou consumo. ³ técnicas como a PCR,^1,7,8,9,10 ELISA,^11,(mediada por loop de amplificação isotérmica de¹² LÂMPADA),^13,14 entre outros,^{15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24} recentemente tem sido usado para detecção de vários patógenos. Comparado ao tradicional bacteriana, métodos de cultivo, estas técnicas são muito mais eficientes em relação à especificidade e tempo. No entanto, estas técnicas ainda lutam com falsos positivos e negativos, procedimentos complexos e custo. ^{1 , 3 , 25} ... é por essa razão que Multiparamétrico magneto-fluorescente nanosensors (MFnS) propõem-se como um método alternativo para a deteção bacteriana.

Estes nanosensors com exclusividade par juntos relaxação magnética e modalidades fluorescentes, permitindo uma plataforma dual-deteção rápida e exata. Usando Escherichia coli O157: H7 como um contaminante de amostra, é demonstrada a capacidade de MFnS para detectar tão pouco quanto 1 CFU em poucos minutos. Específicas do patógeno anticorpos são usados para aumentar a especificidade, e a combinação de modalidades magnéticas e fluorescentes permite a detecção e quantificação de contaminantes bacterianos em ambas as gamas de alta e baixa --contaminação. ¹⁶ no caso de contaminação bacteriana, o nanosensors vai enxame à volta as bactérias devido as habilidades alvos dos anticorpos específicos do patógeno. A ligação entre a nanosensors magnética e bactérias limita a interação entre o núcleo de ferro magnético e os prótons de água circundante. Isto causa um aumento nos tempos de relaxamento T2, como registrado por uma relaxometer magnética. Como a concentração de bactérias na solução aumenta, os nanosensors se dispersar com o aumento do número de bactérias, resultando em valores mais baixos de T2. Por outro lado, a emissão de fluorescência aumentará em proporção com a concentração de bactérias, devido ao aumento do número de nanosensors diretamente ligado ao patógeno. Centrifugação das amostras e o isolamento da pelota bacteriana, só irão conservar as nanopartículas diretamente conectadas com as bactérias, removendo qualquer nanosensors flutuante e correlacionando diretamente a emissão de fluorescência com o número de bactérias presentes na solução. Uma representação esquemática deste mecanismo é representada na Figura 1.

Esta plataforma de MFnS foi projetada com rastreio de point-of-care em mente, resultando em características de baixo custo e portátil. MFnS são estáveis à temperatura ambiente e só são necessários em concentrações muito baixas para detecção precisa de bactérias contaminantes. Além disso, após a síntese, o uso da MFnS é simples e não requer o uso de profissionais treinados no campo. Por último, esta plataforma de diagnóstica permite direcionamento altamente personalizável, proporcionando um meio pelo qual este uma plataforma pode ser usada para detectar agentes patogénicos de todos os tipos, em muitas configurações diferentes.

Protocol

1. síntese e Functionalization de multi paramétrico Magneto-fluorescente Nanosensors (MFnS).

1. Síntese de óxido de ferro superparamagnético nanopartículas (IONPs)
   1. para se preparar para a síntese IONP, preparar as seguintes 3 soluções: solução 1: FeCl ₃ (0,70 g) e FeCl ₂ H ₂ O (2 mL), 2 solução: NH ₄ OH (2,0 mL, 13,4 M) em H ₂ O (15 mL) e a solução 3: ácido poliacrílico (0,855 g) em H ₂ O (5 mL).
   2. Adicionar 90 µ l de ácido clorídrico de 2 M (HCl) à solução 1 e então misture com 2 solução enquanto num Vortex em 875 rpm. Em seguida, adicione solução 3. Continuar num Vortex de 60 min.
   3. Centrifugar por 20 min no 1.620 g. x de centrifugação o sobrenadante por 20 min em 2.880 g. x
   4. Purificar o sobrenadante final através de diálise. Adicionar o sobrenadante para um saco de diálise (MWCO 6 − 8 K) e coloque-o em um béquer contendo tamponado fosfato salino (PBS) (pH = 7,4) e barra de rotação. Deixe de molho por 12h, substituindo com buffer fresco a cada 2-3 h.
2. Conjugação de anticorpos de alvos de superfície de IONPs
   1. preparar as seguintes quatro soluções: solução a: 5 mg de 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida cloridrato (CED), em 250 µ l MES [2-(N- tampão de ácido etanesulfónico de Morpholinos)] (0,1 M, pH = 6,8), solução b: 3 mg de N-Hidroxisuccinimida (NHS) em 250 µ l de tampão MES (0,1 M, pH = 6,8), solução c: 5 µ g de IgG1, o mAb de Escherichia coli, em 225 µ l de tampão fosfato salino (PBS) (pH 7,4) e a solução d: 4 mL de IONP (5,0 mmol) em 1 mL de PBS (pH 7,4).
   2. Então imediatamente adicionar 2-(N-Morpholinos) ácido etanesulfónico (MES) do buffer para a solução A, adicionar solução-A solução d em pequenos incrementos, no prazo de 15 s, invertendo a solução após cada adição para a mistura.
   3. Imediatamente começam a adicionar solução B a solução D em pequenos incrementos ao longo de um período de três minutos. Mix, invertendo-se a solução após cada adição.
   4. Adicionar solução C solução em incrementos de 5 µ l, invertendo a solução após cada adição para a mistura.
   5. Permitir a reação continuar para 3h em temperatura ambiente e em seguida, continuar a incubação a 4 ° C durante a noite.
   6. Purificar as IONPs Ab-conjugado resultantes através de coluna magnética usando PBS (pH = 7,4, final [Fe] = 3,5 mmol) para remover quaisquer anticorpos unconjugated.
      1. Lavar a coluna magnética com PBS (1 mL). Unir a coluna para a placa magnética e adicionar a solução IONP.
      2. Lavar a coluna magnética com PBS (1 mL). Remova a coluna magnética da placa magnética. Adicionar PBS para a coluna e recolher a solução. Loja a 4 ° C
3. encapsulamento de 1,1 fluorescente ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ', 3 '-corante Tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI) para o revestimento (PAA) o ácido poliacrílico os conjugado anticorpo IONPs usando um método de difusão de solventes.
   1. De 4 mL dos IONPs, Adicionar gota a gota 2.0 μL de tintura de DiI (2 mmol) em 100 µ l de DMSO com mistura contínua a 1100 rpm.
   2. Dialize a solução resultante (MWCO 6-8 KDa, 12 h) contra PBS, criando uma solução final de MFnS com uma concentração final de ferro [Fe] = 2 mmol.
4. Caracterização de MFnS
   1. para análise espectrofotométrica, usar um leitor de placas para detectar encapsulado DiI tintura com emissão de fluorescência em 595 nM.
   Difusão dinâmica da luz
   1. de
   2. coloca uma amostra da solução de MFnS em um zetasizer para determinar o tamanho médio e carga de superfície da MFnS.
      Nota: Aqui, o tamanho médio e carga de superfície de MFnS funcionais foram encontrados para ser 77.09 nm e-22.3 mV, respectivamente.

2. Bactérias Culturing e preparação de solução estoque

1. bacteriana cultivo
   1. hidratar uma pelota liofilizada (Escherichia coli O157: H7) em 1 mL de caldo nutriente e em seguida, adicionar um adicional 5 mL de caldo de carne.
   2. Aplicam-se 100 µ l desta solução para uma placa de ágar e raia utilizando uma ansa de inoculação estéril, seguida de incubação a 37 ° C por 24 h.
   3. Após 24 h, selecione uma colônia isolada da placa de ágar e adicioná-lo a um 15 mL de caldo de cultura. Incubar a 37 ° C, durante 4-6 h, enquanto monitora o valor de densidade óptica (absorvância a 600 nm).
   4. Uma vez um valor de densidade óptica de 0.1 obtido, pare de cultivo e realizar diluições em série.
2. Diluições em série
   1. Adicionar 900 µ l de caldo nutriente para oito tubos estéreis microcentrifuga.
   2. Adicione 100 µ l da suspensão bacteriana ao primeiro tubo (diluição 10 ^-1).
   3. Levar 100 µ l do primeiro tubo e adicioná-lo para o segundo, para obter uma diluição de 10 ^-2. Continue este padrão para os tubos restantes, terminando com uma diluição final de 10 ^-8.
   4. Transferir 100 µ l de cada tubo para separar as placas de ágar e incubar por 24 h a 37 ° C.
   5. No dia seguinte, contar as unidades (CFUs) formadoras em cada prato. Selecione a placa com CFUs ~ 100. Usar as correspondentes diluições para novas experiências (100 µ l = CFUs ~ 100).
      Nota: Aqui era a diluição de 10 ^-6 que resultou em 100 ~ CFUs.

3. Rápida deteção de E. coli O157: H7 usando MFnS

1. Spike várias soluções de PBS (1. X, pH 7,4, 300 µ l) com a quantidade crescente do estoque de 10 ^-6 bacteriana, resultando em CFU varia de 1-100. Adicionar uma quantidade consistente de MFnS (100 µ l) para essas soluções.
2. Criar uma solução de linha de base que contém somente PBS (1. X, pH 7,4, 300 µ l) e MFnS (100 µ l).
3. Incubar soluções por 30 min a 37 ° C e então deixe-os arrefecer à temperatura ambiente.
4. Transferência de soluções individuais para o relaxometer magnético (Tesla 0,47) e gravar alterações nos tempos de relaxamento (T2) em relação as CFUs em cada solução.
   1. Para gravar as alterações em valores de T2, Comece medindo o valor de T2 da solução de linha de base que contém somente PBS e MFnS. Relaxometer
      1. lugar a solução em magnética. Abra o respectivo software, selecione o " relaxamento T2 " definição e pressione " medida. "
   2. seguindo a coleção de linha de base T2, medir os valores de T2 das soluções adicionais que foram cravados com vários concentrações de bactérias.
      Nota: A mudança em T2 é equivalente à linha de base de T2 subtraída a T2 cravado.
5. Remover amostras da relaxometer magnética e centrifugar os tubos a 2880 x g durante 10 min.
6. Decante o sobrenadante e ressuspender pelotas bacterianas em 100 µ l de PBS (1. X, pH 7,4).
7. Adicionar 80 µ l de cada ressuspensão de uma placa de 96 poços e intensidades de fluorescência recorde em 595 nM.
   Nota: Teste pode ser repetido usando solventes diferentes, incluindo a água do lago, leite e outros, conforme descrito na seção de resultados

Results

O mecanismo de ação MFnS é representado na Figura 1. O agrupamento de MFnS em torno da superfície de bactérias contaminantes interfere com as interações entre os magnetic cores dos MFnS e os núcleos de hidrogênio circundante. Como resultado deste relaxamento de clustering, magnético valores aumentam. À medida que aumenta a concentração de bactérias contaminantes, reduz a clusterização e a alteração nos valores de T2 diminui. Portanto, a adição de uma modalidade fluorescente é crucial. À medi...

Discussion

Este protocolo foi projetado para produzir MFnS totalmente funcionais como simplesmente possível. No entanto, existem muitos pontos-chave em que a alteração do protocolo pode ser útil, dependendo do objetivo do final do usuário. Por exemplo, o uso de anticorpos diferentes permitiria segmentação dos muitos outros patógenos. Além disso, este protocolo não é limitado ao uso de anticorpos como alvo moléculas. Qualquer molécula que tem afinidade de ligação específica para patógenos alvo, tais ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloreto Ferroso Tetrahidratado	Fisher Scientific	I90-500
Cloreto Férrico Hexahidratado	Fisher Scientific	I88-500
Hidróxido de Amônio	Fisher Scientific	A669S-500
Ácido Clorídrico	Fisher Scientific	A144S-500
Ácido Poliacrídrico	Sigma-Aldrich	323667-100G
EDC	Thermofisher Scientific	22980
NHS	Fisher Scientific	AC157270250
Anti-E. coli O111 anticorpo	sera care	5310-0352
Anticorpo anti-E. coli O157:H7 [P3C6]	Abcam	ab75244
DiI Stain	Caldo de Nutrientes Fisher Scientific	D282
	Difco	233000
Liofilizado E. coli O157:H7 pellet	ATCC	700728
Relaxomteter Magnético	Leitor	mq20
Zetasizer	Malvern	NANO-ZS90
	Coluna Magnética Tecan	Infinite M200 PRO
	QuadroMACS	130-090-976
Centrífuga	Eppendorf		5804
(accuSpin Micro 17)	Fisher Scientific	13-100-676
Modelo de Piso Incubadora	Agitadora SHEL LAB	SSI5
Balança Analítica	Metler Toledo	ME104E
Misturador de Vórtice Digital	Fisher Scientific	02-215-370
Agitador de balanço ao ar livre	Fisher Scientific	02-217-765