Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e Xenopus Desenvolvimento embrionário

Resumo

Este protocolo descreve uma estratégia optogenética para modular a atividade da proteína quinase ativada por mitógenos (MAPK) durante a diferenciação celular e o desenvolvimento embrionário de Xenopus . Este método permite a ativação reversível da via de sinalização MAPK na cultura de células de mamíferos e em organismos vivos multicelulares, como embriões Xenopus , com alta resolução espacial e temporal.

Resumo

A atividade da cinase é crucial para uma infinidade de funções celulares, incluindo proliferação celular, diferenciação, migração e apoptose. Durante o desenvolvimento embrionário precoce, a atividade quinasa é altamente dinâmica e generalizada em todo o embrião. As abordagens farmacológicas e genéticas são comumente usadas para sondar atividades de quinase. Infelizmente, é desafiador alcançar uma resolução espacial e temporal superior usando essas estratégias. Além disso, não é viável controlar a atividade quinasa de forma reversível em células vivas e organismos multicelulares. Essa limitação continua a ser um gargalo para alcançar uma compreensão quantitativa da atividade quinasa durante o desenvolvimento e a diferenciação. Este trabalho apresenta uma estratégia optogenética que tira proveito de um sistema bicistrônico contendo proteínas fotoativáveis Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) e o domínio N-terminal da híbrida-hélice-hélice básica interativa criptocromo (CIBN). ReversiA ativação da ativação da via de sinalização da proteína quinase ativada por mitogeno (MAPK) é conseguida através da translocação da proteína mediada por luz em células vivas. Esta abordagem pode ser aplicada a culturas de células de mamíferos e embriões de vertebrados vivos. Este sistema bicistrônico pode ser generalizado para controlar a atividade de outras quinases com mecanismos de ativação semelhantes e pode ser aplicado a outros sistemas modelo.

Introdução

Os fatores de crescimento estão envolvidos em um amplo espectro de funções celulares, incluindo proliferação, diferenciação, migração e apoptose, e desempenham papéis fundamentais em muitos eventos biológicos, incluindo desenvolvimento embrionário, envelhecimento e regulação do estado mental ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . Muitos fatores de crescimento indicam através de cascatas de sinalização intracelular complexas. Esses eventos de sinalização são freqüentemente operados por fosforilação protéica reversível de forma regulada com precisão ^{6 , 7} . Assim, uma compreensão dos resultados de sinalização das proteínas quinases, que são responsáveis ​​pela fosforilação de proteínas, é fundamentalmente importante.

Diferentes fatores de crescimento agem através de uma rede de sinalização intracelular bastante comum, embora estimulem distInct celular respostas ^{8 , 9} . Os mediadores intracelulares comuns das tirosina cinases receptoras incluem Ras, Raf, cinase regulada por sinal extracelular (ERK), proteína quinase activada por mitogeno (MAPK) / ERK quinase (MEK), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), Akt e fosfolipase C gama (PLCγ) ^{10 , 11} . A evidência de acumulação sugere que a diversidade e a especificidade da sinalização dependem da regulação espacial e temporal da atividade de sinalização ¹² . Por exemplo, em células de feocromocitoma de ratos (PC12), a estimulação do fator de crescimento epidérmico (EGF), que resulta na proliferação celular, ativa a via ERK ⁹ transitória. Por outro lado, a estimulação com o fator de crescimento nervoso (NGF), que leva à diferenciação celular, ativa a via ERK de forma sustentada ^{9 , 13} . Em culturaNos neurônios do hipocampo, a sinalização transitória por fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) promove a proliferação primária dos neurites, enquanto a sinalização sustentada leva ao aumento da ramificação dos neurites ¹⁴ . Durante o desenvolvimento embrionário precoce, a atividade ERK fosforilada é temporariamente dinâmica e está disseminada em todo o embrião ⁶ . Uma tela genética recente durante a embriogênese precoce de Xenopus mostrou que as cascatas de sinalização de ERK e Akt, duas vias do factor de crescimento primário a jusante, exibiam os perfis de ativação específicos do estágio ⁷ . Assim, uma compreensão dos resultados da sinalização da quinase requer ferramentas que possam investigar as características espaciais e temporais da atividade quinasa com resolução suficiente.

As abordagens experimentais convencionais para investigar a natureza dinâmica da transdução de sinal durante o desenvolvimento não possuem a resolução espacial e temporal desejável. Por exemplo, as abordagens farmacológicas utilizamMoléculas histológicas ou biológicas para estimular ou suprimir a transdução de sinal em células e tecidos. A natureza difusiva dessas moléculas pequenas torna desafiador restringir sua ação a uma região específica de interesse ¹⁵ . As abordagens genéticas ( por exemplo, transgênese, sistema Cre-Lox ou mutagênese) geralmente levam à ativação ou à repressão irreversível da expressão do gene alvo ou da atividade protéica ^{16 , 17 , 18} . O sistema Tet-On / Tet-Off ¹⁹ oferece um controle temporal melhorado da transcrição genética, mas não possui controle espacial rigoroso porque depende da difusão da tetraciclina. Desenvolvimentos recentes na dimerização de proteína induzida quimicamente ²⁰ ou foto-uncaging ^{21 , 22 , 23 , 24} aumentaram bastanteO controle temporal das redes de sinalização. O controle espacial, no entanto, continua desafiando devido à natureza difusiva dos produtos químicos enjaulados.

As recentes abordagens optogenéticas emergentes, que aproveitam o poder da luz para controlar as interações proteína-proteína, permitem a modulação de caminhos de sinalização com alta precisão espaciotemporal e reversibilidade. Pouco depois do seu sucesso inicial no controle do disparo neuronal ^{25 , 26 , 27} , a optogenética foi estendida para controlar outros processos celulares, como transcrição de genes, tradução, migração celular, diferenciação e apoptose ^{28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34} . Uma estratégia usando a pO pino proteico de hotoactividade da proteína Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) e o domínio N-terminal da hélice-laço-hélice básica (CIBN) que interage criptocromo foi recentemente desenvolvido para controlar a atividade da quinase Raf1 em células de mamíferos e embriões Xenopus ³⁵ . CRY2 liga-se a CIBN após a estimulação de luz azul e o complexo de proteína CRY2 / CIBN dissocia espontaneamente no escuro ³⁴ . A luz azul excita o cofactor CRY2, o dinucleótido de flavina adenina (FAD), o que leva a uma mudança conformacional em CRY2 e sua subsequente ligação à CIBN. Os mutantes de CRY2 deficientes em flavina (D387A) podem ser produzidos através de mutações no bolso de ligação ao FAD: o mutante CRY2 ^W374A liga-se a CIBN independentemente da luz, enquanto que o mutante CRY2 ^D387A não se liga à CIBN sob o azul Estimulação luminosa ^{36 , 37} . O sistema optogenético descrito iN este protocolo usa CRY2 e CIBN de tipo selvagem para induzir ativação Raf1 mediada por translocação de proteínas em células vivas. Sabe-se que o recrutamento de membranas de Raf1 aumenta sua atividade ³⁸ . Neste sistema, um módulo CIBN em tandem é ancorado na membrana plasmática e CRY2-mCherry é fundido com o N-terminal de Raf1 ³⁵ . Na ausência de luz azul, CRY2-mCherry-Raf1 permanece no citoplasma e Raf1 está inativo. A estimulação de luz azul induz a ligação CRY2-CIBN e recruta Raf1 para a membrana plasmática, onde Raf1 é ativado. A ativação do Raf estimula uma cascata de sinalização Raf / MEK / ERK. As proteínas de fusão CRY2 e CIBN são codificadas em um sistema genético bicistrônico. Essa estratégia pode ser generalizada para controlar outras quinases, como Akt, cujo estado de ativação também pode ser ativado pela translocação de proteínas nas células ³⁹ . Este trabalho apresenta protocolos detalhados para implementar esta estratégia optogenética em cultu de células de mamíferosRes e organismos multicelulares.

Protocolo

A pesquisa com animais foi conduzida de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais de Illinois (IACUC) e pelo Departamento de Recursos Animais da Universidade de Illinois (DAR).

1. Indução optogenética da localização de proteínas na cultura celular BHK21 de mamífero

NOTA: As etapas 1.1-1.3 fornecem um método para montar uma câmara de cultura celular para imagens com objetivos de alta ampliação ( por exemplo, 63X ou 100X), que tipicamente têm curtas distâncias de trabalho. Esses objetivos exigem uma lamínula de vidro fina ( por exemplo, # 1,5, espessura de 170 um) como o substrato de imagem. Alternativamente, pode usar-se um prato de cultura de células de fundo de vidro. Nesse caso, as etapas 1.1-1.3 podem ser ignoradas.

1. Limpando lâminas de vidro
   1. Coloque 30 lamelas de vidro em um porta-lamínulas.
   2. Em um copo de plástico de 600 mL, adicione 20 g de detergente e 400 mL de água quente da torneira. PlacE o copo em um agitador magnético e mexa até dissolver todo o detergente. Remova a espuma com papel de seda.
   3. Use o fundo de uma placa de Petri de 100 mm x 15 mm como um espaçador da barra de agitação e como uma superfície para o porta-lamínulas. Para manter o fluxo adequado durante o processo de limpeza, faça 3-4 furos de drenagem na placa de Petri.
   4. Para fazer os buracos de drenagem, aquecer um ferro de solda e queimar através do plástico em um capuz ventilado.
      CUIDADO: Não toque no ferro de solda aquecido com as mãos nuas.
   5. Coloque o suporte da lamínula na placa de Petri no copo. Mexa durante 2 h até a noite à temperatura ambiente.
   6. Lave três vezes com 500 mL de água DI num copo de 1000 mL. A solução de detergente pode ser reutilizada.
   7. Pegue lamínulas individuais usando fórceps. Mergulhe os lamínulos em etanol à prova de 190 (95%) durante 1 min.
   8. Seque os lamínulas dentro de um capô estéril. Armazene os lamínulas em um recipiente de plástico estéril até o uso.
2. Fabricação de lâminas revestidas de poli-L-lisina (PLL)
   1. Faça um tampão de borato 0,1 M dissolvendo 1,24 g de ácido bórico e 1,9 g de tetraborato dissódico em 400 mL de água. Ajuste o pH para 8,5 com NaOH 10 M.
   2. Dissolver PLL no tampão borato até uma concentração final de 1 mg / mL. Alíquota da solução PLL em tubos de centrífuga estéril de 50 ml.
   3. Adicione 50 mL de solução de revestimento PLL a um prato de cultura de tecido de 10 cm. Coloque o prato em uma incubadora de 37 ° C para aquecer a solução PLL.
   4. Abra o recipiente de lamínula (etapa 1.1.8) em um capô estéril.
   5. Mergulhe os cobertores limpos, um a um, na solução pré-aquecida de PLL no prato de cultura de tecidos. Evite a formação de bolhas para imergir todas as superfícies.
   6. Coloque o prato com a lamínula em uma incubadora de CO _{2 de} 37 ° durante a noite. Retire cada lamínula e coloque-o em um suporte de lamínula estéril. Enxaguar três vezes com água ultrapura autoclavada (18,2 MΩ e #183; cm de resistividade) num copo de 1000 mL em um capuz estéril.
   7. Seque os lamínulas no suporte da lamínula na capa estéril. Armazene os lamínulas em um recipiente de plástico estéril até o uso.
3. Montagem de câmaras de cultura celular de polidimetilsiloxano (PDMS)
   1. Em um recipiente de plástico, pesa 40 g de base de PDMS e adicione 4 g de agente de cura para atingir uma proporção de 10: 1 p / p de PDMS e agente de cura. Misture o PDMS / agente de cura agitando com uma ponta de pipeta durante 2 min. Alternativamente, use um misturador centrífugo.
   2. Use um copo com um diâmetro de 4 polegadas como modelo para fazer um suporte com um pedaço de papel alumínio. Coloque o suporte de alumínio em uma placa de Petri de 15 cm. Coloque uma bolacha de silicone de 4 polegadas dentro deste suporte de alumínio.
   3. Despeje a solução de PDMS misturada no suporte. Use uma vara de vidro fino para tocar a borda da bolacha suavemente. Remova as bolhas de ar presas sob a bolacha.
   4. Insira a placa de Petri de 15 cm em um chambe de vácuoR para desgastar a solução PDMS. Continue a desgaseificar por cerca de 20 min, até que não sejam geradas bolhas. Enquanto isso, pré-aqueça um forno de convecção a 65 ° C.
   5. Coloque cuidadosamente a placa de Petri de 15 cm no forno. Incubar durante 2 h.
   6. Retire a placa do forno. Use uma haste de vidro para tocar suavemente a borda do PDMS e assegurar uma reticulação completa. Caso contrário, incuba mais, até o PDMS ser sólido e não pegajoso.
   7. Retire a folha de alumínio da placa e descasque-a da bolacha de silício. Partindo da borda, remova com cuidado o PDMS curado da bolacha de silício.
      CUIDADO: Evite aplicar muita força, pois pode quebrar a bolacha.
   8. Corte o PDMS em peças retangulares de 20 mm x 30 mm para caber a lamela de 24 mm x 40 mm com uma lâmina de barbear.
   9. Use uma lâmina em forma de cinzel para cortar uma abertura retangular de 10 mm x 20 mm do centro de cada peça PDMS.
   10. Limpe as câmaras PDMS usando o protocolo de detergente descrito no passo 1.1.
   11. Secar as câmaras PDMS em uma capa limpa. Coloque as câmaras secas em um recipiente autoclavável coberto com papel alumínio.
   12. Autoclave o recipiente usando gravidade (121 ° C, 15 psi) por 30 min e armazene o recipiente à temperatura ambiente.
4. Cultivo e transfecção de células BHK21
   1. Faça 500 mL de meio para cultura de células BHK21 misturando 445 mL de DMEM com 50 mL de FBS e 5 mL de Penn-Strep-Glutamina 100 × (10 000 U / mL de penicilina, 10 mg / mL de estreptomicina e 29,2 mg / mL de L -glutamina). Certifique-se de que a concentração final do FBS seja de 10%.
   2. Alíquota 10 mL de meio não dependente de HEPES CO ₂ para imagens de células vivas.
      NOTA: O meio independente de CO ₂ suporta o crescimento celular sem uma incubadora de CO ₂ e é ideal para células de imagem em condições atmosféricas. Consulte a Lista de Materiais para obter informações detalhadas. Além da linha celular BHK21, outros tipos de células de mamíferos também devemResultados semelhantes.
   3. Monte um dispositivo de cultura de células, colocando uma câmara PDMS esterilizada em autoclave (etapa 1.3) em uma lamínula estéril revestida com PLL (passo 1.2) em uma capa estéril.
   4. Coloque cada dispositivo em uma placa de Petri estéril de 60 mm.
   5. Use 0,5 mL de tripsina a 0,25% para separar as células de um poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços. Contagem de densidade celular com um hemocitómetro. Placa 20 000 células BHK21 na câmara (cerca de 10 000 células / cm ² ) com 200 μL de meio de cultura de células.
   6. Prepare o plasmídeo de DNA com um kit de preparação de plasmídeo (veja a Lista de Materiais).
      NOTA: O design e a funcionalidade do CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX são mostrados na Figura 1A - 1B .
   7. Vinte e quatro (24) h após o revestimento celular, transfiram as células com 50-100 ng de plasmídeo CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX, de acordo com o protocolo do fabricante.
   8. Três (3) horas após a transfecção, mude o mEdium para 200 μL de meio de cultura fresco (passo 1.4.1) e permitir que as células se recuperem durante a noite incubando a cultura em uma incubadora de CO _{2 de} 37 ° C e 5%.
5. Fluorescência de imagens de células vivas
   1. Ligue um computador, fonte de luz, microscópio e câmera. Use um microscópio de fluorescência confocal (equipado com um objetivo de imersão em óleo de 100X) para o resto do protocolo.
      NOTA: Um microscópio de epifluorescência invertido também pode ser usado.
   2. Substitua o meio de cultura celular por 200 μL de meio independente de CO ₂ .
   3. Configure o protocolo de aquisição de dados antes de colocar as células no microscópio. Use um canal FITC de excitação de 488 nm para estimulação optogenética. Use um canal TRITC de excitação de 561 nm para localizar células transfectadas e rastrear a localização celular da proteína marcada com mCherry.
   4. Defina o ganho dos canais FITC e TRITC como 120 e 200, respectivamente. Use um tempo de pixel-moradia de 2.21; s e tamanho de 512 x 512 pixels.
   5. Medir a potência da luz de 488 nm, colocando um medidor de energia perto da janela objetiva. Uma potência total de 2 μW (cerca de 10 000 W / cm ² no foco) é suficiente para induzir associação CIBN-CRY2PHR.
   6. Configure uma aquisição de timestamp com um intervalo de 5 s e um tempo de aquisição total de 2 min.
   7. Aplique material apropriado de correspondência de índice (óleo de imersão) na janela do objetivo. Use o modo de contraste de fase para focar as células na superfície da lamínula.
   8. Localize uma célula transfectada sob luz de 561 nm movendo o estágio do microscópio.
      CUIDADO: Evite usar luz azul durante esta etapa, pois ativará a associação entre proteínas fotoativáveis.
   9. Uma vez que uma célula transfectada está localizada, inicie a aquisição de dados.
      NOTA: as células transfectadas com sucesso devem mostrar fluorescência nos canais FITC (de 2CIBN-GFP-CaaX) e TRITC (de CRY2-mCherry-Raf1) ( Figura 1C-D
   10. Grave uma série de imagens marcadas no horário nos canais FITC e TRITC ( Figura 1D ).
   11. Para sondar a dissociação espontânea do complexo de proteínas CRY2-CIBN, registre outro timestamp com o canal Txred sozinho durante 20 min, com um intervalo de 30 s.
   12. Salve a imagem marcada no horário para análise de dados.
6. Análise de imagem
   1. Abra as imagens com um software de análise de imagem que pode extrair a intensidade de uma imagem ⁴⁰ .
   2. Selecione dois instantâneos representativos: um antes da exposição à luz azul e a outra exposição pós-luz azul.
   3. Desenhe uma linha através da célula que abaixa o fundo, a membrana plasmática e o citoplasma. Projeto a intensidade ao longo desta linha. Salve os valores e traçá-los para comparar a diferença antes e depois da exposição à luz ( Figura 1D ).
   4. Para analisar a cinética da associação de proteínas, selecioneT uma região representativa de interesse (ROI) na membrana plasmática, um ROI no citoplasma e um ROI em segundo plano.
   5. Adquirir as intensidades médias da membrana plasmática (I _PM ), do citoplasma (I _CYT ) e do fundo (I _BKD ) para a pilha de imagens.
   6. Calcule a proporção de intensidade de membrana / citosolic para cada imagem usando a seguinte equação:
      
   7. Traçar a relação versus tempo e determinar a cinética de ligação ou dissociação de CRY2-CIBN ( Figura 1E- F ).

2. Construção de uma matriz de LED para estimulação de luz a longo prazo em uma incubadora de CO ₂

NOTA: O esquema geral da configuração experimental é mostrado na Figura 2A .

1. Faça a matriz LED inserindo 12 LEDs azuis em dois panosDs e conectando resistores limitadores de corrente.
   NOTA: com uma fonte de alimentação de 30 V, quatro LEDs podem ser conectados em série e seu brilho pode ser controlado por um resistor de limitação de corrente.
2. Coloque as placas de pão em uma caixa de alumínio.
   NOTA: A altura da caixa de alumínio deve ser de 2 pol. Esta altura é ideal para iluminar uma placa de cultura de tecidos de 12 poços, porque o tamanho do ponto de luz divergente é o mesmo que um único poço.
3. Use dois fios metálicos para conectar a fonte de alimentação. Certifique-se de que o comprimento do fio é suficiente quando a caixa de luz é colocada dentro de uma incubadora de CO ₂ .
4. Use um difusor de luz transparente como a capa da caixa de luz ( Figura 2C ).
5. Calibre a saída de energia de cada LED em uma faixa de entradas de tensão. Use uma potência de 0,2 mW / cm ² para o ensaio de diferenciação de células PC12 de 24 h. Use uma potência de 5 mW / cm ² para embriões ou explantes Xenopus ao vivoEnsaios.

3. Indução optogenética da diferenciação celular PC12

1. Cultivo celular e transfecção
   1. Faça 500 mL de meio para uma cultura de células de feocromocitoma de ratos (PC12) misturando 407,5 mL de F12K com 75 mL de soro de cavalo + 12,5 mL de FBS + 5 mL de 100 × Penn-Strep-Glutamina (concentrações finais de soro de cavalo e FBS : 15% e 2,5%, respectivamente). Faça um meio de baixo teor de soro misturando 1 volume de meio completo em 99 volumes de meio F12K.
   2. Placa de células PC12 em uma placa de 12 poços com uma densidade de 300.000 células / poço ou 75.000 células / cm2.
   3. Transfecte as células com CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX 24 h após o revestimento celular (semelhante ao passo 1.4.7). Use 1,2 μg de DNA para cada poço. Permitir que as células se recuperem durante a noite em meio de cultura numa incubadora a 37 ° C suplementada com 5% de CO ₂ . Verifique a eficiência de transfecção 16 h após a transfecção.
      NOTA: Uma transfecção de 30 a 50%A ciência deve ser alcançada para garantir uma contagem de células suficiente.
   4. Mude o meio médio para baixo do soro 24 h após a transfecção. Use 1 mL de meio por poço de uma placa de 12 poços.
2. Diferenciação de células PC12 induzida por luz
   1. Coloque a matriz LED em uma incubadora de CO ₂ . Conecte-o à fonte de alimentação usando um par de fios. Defina a potência do LED para 0.2 mW / cm ² . Coloque a placa de 12 poços contendo células PC12 transfectadas (passo 3.1.3) na janela da matriz LED. Aplique iluminação de luz contínua durante 24 h em uma incubadora a 37 ° C suplementada com 5% de CO ₂ .
3. Imagens de células vivas de fluorescência
   1. Siga as etapas 1.5.1-1.5.4 para microscópio e preparação da amostra.
   2. Configure a aquisição de dados de instantâneo único. Use 200 ms para o canal GFP e Txred.
   3. Capture imagens das células transfectadas nos canais GFP e Txred. Gravar cerca de 200 celÉ por cada condição. Salve os arquivos para análise de dados.
4. Análise de imagem
   1. Contar a porcentagem de células diferenciadas sobre o número total de células transfectadas.
   2. Use qualquer módulo de contagem de células no software de análise de imagem para contar as células.
   3. Contar manualmente as células diferenciadas.
      NOTA: As células diferenciadas são definidas como aquelas em que pelo menos um neurite é discernivelmente mais longo do que o corpo celular ( Figura 3A- 3B ).
   4. Repita o passo 3.4.3 com células indiferenciadas.
   5. Calcule o índice de diferenciação usando a seguinte equação:
      

4. Controle optogenético da atividade do quinases em embriões Xenopus

1. Preparação de buffers
   1. Prepare 1 L de 1x Marced Modified Ringer (MMR): 100 mMNaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2 e 5 mM de HEPES; PH 7,5.
2. Preparação de mRNA
   1. Digerir o DNA do plasmídeo CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX (2 μg) com 1 μL de ApaI (unidade 50) a 37 ° C durante 2 h.
   2. DNA linearizado com precipitado em 60 μL de etanol a 100%. Girar a 12 000 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente para sedimentar o DNA. Retire cuidadosamente o sobrenadante e lave o sedimento novamente com 60 μL de etanol a 70%. Gire a 12,000 × g por mais 5 minutos à temperatura ambiente. Retire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o sedimento de DNA em 6 μL de H2O livre de RNase.
   3. Realize a transcrição in vitro incubando 1 μg de DNA linearizado com 2 μL de ARN polimerase SP6 fornecida, uma mistura de ribonucleótidos (ATP 10 mM, CTP e UTP, GTP 2 mM e análogo de tampão 8 mM) e 20 μL de nuclease- Água livre à temperatura ambiente durante 1 h.
   4. Remova o DModelo NA por digestão com DNase I a 37 ° C durante pelo menos 15 minutos e purificar o ARN sintetizado utilizando uma coluna de rotação de sílica-membrana.
   5. Pare a reação e precipite o RNA adicionando 30 μL de água livre de nuclease e 30 μL de solução de precipitação de LiCl. Misture bem e relaxe durante 30 min a -20 ° C.
   6. Centrifugar a 4 ° C durante 15 minutos a 12 000 × g para sedimentar o ARN.
   7. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Lavar o ARN uma vez com 1 mL de etanol a 70% e ressuspender em 40 μL de água livre de nuclease.
   8. Carregue 40 μL de RNA numa coluna de rotação. Centrifugar a 4 ° C durante 1 min a 12 000 × g para remover os nucleotídeos e tampas não incorporados.
3. Colher Xenopus embriões
   1. Siga o protocolo descrito por Sive et al. ⁴¹ para obter os embriões Xenopus .
4. Microinjeção de mRNA
   1. FabricarAs agulhas para microinjecção puxando os capilares de vidro com um extractor capilar. Defina o programa de puxar para: calor = 355, força de tração = 80, velocidade = 50 e tempo = 100.
   2. Remova o revestimento de geléia dos embriões tratando-os com 3% de cisteína (diluída em 0.2x MMR).
   3. Transfira os embriões para 3% de polissucrose e solução de MMR 0,5x para microinjecção. Injecte 500 pg a 1 ng de ARN CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX em cada embrião.
      NOTA: A injeção de uma dose superior a 1 ng resulta em ativação independente da luz azul da sinalização MAPK.
5. Estimulação optogenética da atividade quinasa
   1. Cultura de embriões microinjetados em 3% de polissucrose, solução de MMR 0,5x à temperatura ambiente até atingir o estádio da gastrula média (estágio 12). Em seguida, cultura os embriões na solução de MMR 0,2x.
   2. Transfira os embriões ou explantes para uma placa de 12 poços. Coloque a placa de 12 poços na matriz de LED construída na casa (etapa 2.5) para azul-lighTratamento de t (475 nm).
   3. Coloque um espelho na parte superior da placa de 12 poços para garantir a iluminação azul-clara dos embriões ou explantes.
   4. Ajuste a potência da luz azul para 5 mW / cm ² .
      NOTA: O tratamento com luz azul pode ser realizado a qualquer momento desejado, em solução de polissonfa a 3%, solução de MMX 0,5x ou solução de MMR 0,2x.
   5. Colher os embriões em qualquer momento desejado. Use-os para análise histológica, Western-blot ou de expressão de genes.

Resultados

Expressão raatiométrica de pares de proteínas fotoativáveis: a Figura 1A mostra o projeto de uma construção optogenética bicistrônica, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (referido como CRY2-2A-2CIBN), com base no teschovirum porcino- 1 péptido 2A (P2A), que mostra a maior eficiência de picos de ribossoma entre as linhas celulares de mamíferos ⁴² . No trabalho anterior, determinou-se que a razão ideal para CIBN-GFP-CaaX: CRY2-mCh...

Discussão

Ao construir a caixa de luz, a potência dos LEDs individuais deve ser medida. Com base na experiência anterior, a potência pode variar entre LEDs individuais devido a variação de fabricação. Selecione um conjunto de LEDs que tenham uma saída de energia dentro de 10% uns dos outros. O número de LEDs, o resistor de limitação de corrente e a entrada de energia podem ser modificados para diferentes tipos de recipientes de cultura celular ( por exemplo, uma placa de 6 poços ou de 24 poços). Uma iluminação de 24 h de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lamínula de vidro	VWR	48393 230	Substrato para imagem de células vivas
Porta-lamínulas	Newcomer Supply	6817B	Suporte para lamínulas
Detergente	ThermoFisher	16 000 104	Para limpeza de lamínulas
Ácido bórico	Sigma-Aldrich	B6768-500G	Para fazer tampão PLL
Tetraborato dissódico	Sigma-Aldrich	71996-250G	Para fazer  Copo de plástico Nalgene
		1201-1000	Para limpeza de lamínulas
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	221465-2.5KG	Para ajustar o pH
Bromidrato de hidrossina de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P1274-500MG	Para revestimento de lamínula
Água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC)	ThermoFisher Scientific	750024	Para preparação de DNA
Pinça de vidro de cobertura Ted	Pella	5645	Manuseio de vidro de cobertura
Prato de cutlure de tecido	Thermofisher	12565321	Placa de cultura de células
Tubos de centrífuga estéreis	ThermoFisher	12-565-271	Armazenamento de tampão
Reagente de transfecção	ThermoFisher	R0534	Meio de transfecção
CO2-independente	ThermoFisher	18045088	Para imagens de células vivas
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Forma de fazer câmara celular
Plasmídeo Maxiprep kit	Qiagen	12965	Preparação de plasmídeo
Meio DMEM	ThermoFisher	11965-084	Componente médio de cultura celular
F12K	ThermoFisher	21127022	Componente médio de cultura celular
Soro de cavalo	ThermoFisher	16050122	Componente médio de cultura celular
Soro Fetal Bovino	Signa-Aldrich	12303C-500 mL	Componente médio de cultura
Penicilina-Estreptomicina-Glutamina	ThermoFisher	10378016	Componente médio de cultura
celular Tripsina (0,25%), vermelho de fenol	ThermoFisher Scientific	15050065	Para dissociação de células de mamíferos
Agarose	Fisher Scientific	BP1356-100	Para preparação de DNA
Ficoll PM400	GE Heathcare Life Sciences	17-5442-02	Para tampão embrionário
Cloridrato de L-cisteína monohidratado	Sigma-Aldrich	1.02839.0025	Preparação de oócitos
ApaI	ThermoFisher	FD1414	Para linearização de plasmídeos
Dnase I	ThermoFisher	AM2222	Para remover o molde de DNA no ensaio de transcrição in vitro
Materiais de correspondência de índice (óleo de imersão)	Thorlabs	MOIL-20LN	Para combinar o índice entre o substrato da amostra e a objetiva
LED azul	Adafruit	301	Fonte de luz para estimulação optogenética
Kit de resistores	Resistor limitador de corrente	Amazon	EPC-103
Caixas de alumínio	BUD Industries	AC-401	caixa de luz
BreadBoard	Jekewin	837654333686	Para fazer Fio de Conexão de Matriz de LED
	Electronix Express	27WK22SLD25	Para Fazer Matriz de LED
Módulo de Relé	Jbtek	SRD-05VDC-SL-C	Para controle de luz intermitente
Fonte de Alimentação DC	TMS	DCPowerSupply-LW-(PS-305D)	Fonte de alimentação para LED
Silicon  Potência Cabeça	Thorlabs	S121C	Para medição de intensidade de luz
Medidor de potência	Thorlabs	PM100D	Para medição de intensidade de luz
Microscópio	Leica Biosystems	DMI8	Para imagem de células vivas
Gabinete de Biossegurança	ThermoFisher	1300 Série A2	Para manuseio de células de mamíferos
Incubadora de CO2	ThermoFisher	Isotemp	Para cultura de células de mamíferos
Microscópio estéreo	Leica	M60	Para micromanipulação de embriões
Microinjetor	Narishige	IM300	Para microinjeção de embriões
Extrator de micropipetas	Sutter Instruments	P87	Extrator de agulhas
in vitro kit de transcrição	ThermoFisher	AM1340	Para transcrição in vitro. O kit inclui água livre de nuclease, RNA SP6  Polimerase, mistura de ribonucleotídeos, análogo de tampa, solução de precipitação de coreto de lítio e coluna de rotação
Kit de purificação de RNA	Qiagen	74104	Coluna de spin de membrana de sílica para purificação de RNA sintetizado
Forno de convecção	MTI corporation	EQ-DHG-9015	Cura PDMS
Misturador centrífugo e recipiente de teflon	THINKY	AR310	Para misturar wafer de silício PDMS
	UniversityWafer	452	Base para fazer dispositivos PDMS
Lâmina	Techni Edge	01-801	Para cortar PDMS
Vidro capilar	Sutter Instruments	BF100-58-10	Para fabricação de agulhas de injeção.& nbsp;