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Artigo de método

Um quadro metodológico unificado para pesquisa de Schwannoma vestibular

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DOI:

10.3791/55827

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20 de junho de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O objetivo deste protocolo é descrever a coleta e processamento de amostras cirúrgicas humanas para múltiplas aplicações a jusante no schwannoma vestibular e na pesquisa de células de Schwann.

Resumo

Os schwannomas vestibulares são as neoplasias mais comuns do ângulo cerebelopontino, constituindo 6-8% de todos os crescimentos intracranianos. Embora esses tumores causem perda auditiva neurossensorial em até 95% dos indivíduos afetados, os mecanismos moleculares subjacentes a essa perda auditiva permanecem indescritíveis. Este artigo descreve as etapas estabelecidas em nosso laboratório para facilitar a coleta e processamento de várias amostras primárias de tecido humano para aplicações de pesquisa a jusante integrantes ao estudo de schwannomas vestibulares. Especificamente, este trabalho descreve um quadro metodológico unificado para a coleta, processamento e cultura de células de Schwann e Schwannoma a partir de amostras cirúrgicas. Isso é integrado a etapas de processamento paralelo, agora consideradas essenciais para a pesquisa atual: a coleta de secreções tumorais e nervosas, a preservação do RNA e a extração de proteínas dos tecidos coletados, a fixação do tecido para a preparação de seções, umaD a exposição de células humanas primárias a vírus adeno-associados para aplicação na terapia genética. Além disso, este trabalho destaca a abordagem cirúrgica translocrítica para colecionar este tumor como uma oportunidade única para obter o epitélio sensorial humano da orelha interna e perilimia. São fornecidas dicas para melhorar a qualidade experimental e destacadas armadilhas comuns.

Introdução

Os schwannomas vestibulares (VSs) são as neoplasias mais comuns do ângulo cerebelopontino, diagnosticadas em 1 em cada 100.000 indivíduos. Embora não metastáticos, esses tumores afetam gravemente a qualidade de vida de um paciente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Indivíduos afetados geralmente vivem com perda auditiva, zumbido e um sentimento de plenitude auditiva. Os sintomas tornam-se cada vez mais debilitantes à medida que o tumor cresce, causando problemas de equilíbrio, paralisia facial e comprometimento de outras funções do nervo craniano. Complicações potencialmente fatais devido à compressão do tronco encefálico também podem ocorrer 7 .

As opções de gerenciamento de VS são essencialmente limitadas à espera atenta de tumores estáticos e terapia de radiação estereotáxica ou ressecção cirúrgica para tumores em crescimento 8. A remoção cirúrgica destes tumores em hospitais afiliados à pesquisa apresenta a oportunidade de adquirir e analisar o tecido tumoral fresco coletado durante as cirurgias do paciente. Uma abordagem cirúrgica específica para VS, a ressecção translaberina, pode mesmo oferecer acesso a um epitélio sensorial humano valioso da orelha interna e perilimia.

Como os VS provêm de um nervo sensorial periférico ( ou seja, o nervo vestibular), é importante comparar as observações associadas ao VS com as derivadas de um nervo de controle apropriado, como o grande nervo auricular humano (GAN). GANs saudáveis ​​são regularmente sacrificados durante a parotidectomia ou dissecção do pescoço e podem ser usados ​​como modelos robustos para a fisiologia das células de Schwann saudáveis 9 .

Como não há medicamentos aprovados pela FDA para o tratamento ou prevenção de VS esporádicos, é imperativo que os pesquisadores elucidem o mecanismo molecular subjacenteNismos da doença para identificar alvos terapêuticos. As proteínas que demonstraram desempenhar um papel na patogênese VS incluem merlin, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), ciclooxigenase 2 (COX-2), fator nuclear kappa B (NF-kB), fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) , Receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e moléculas de sinalização relacionadas 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Avanços recentes expandiram e melhoraram os protocolos para a coleta, processamento, cultura e investigação a jusante de schwannomas vestibulares humanos primários e tecidos nervosos saudáveis 18 , 19 . No entanto, a maioria dos protocolos existentes são projetados para acomodar a preparaçãoDe tais tecidos para um único pedido de pesquisa a jusante ( isto é, cultura celular sozinho). Este artigo apresenta um quadro metodológico unificado para o processamento simultâneo de uma única amostra humana primária VS ou GAN para múltiplas aplicações a jusante: cultura específica do tipo celular, extração de proteínas, preservação de ARN, coleta de secreção de tumor e fixação de tecido. Este trabalho também detalha a coleta e processamento cirúrgico do líquido cefalorraquidiano (CSF) humano e perilymph durante a ressecção VS translabyrintin, uma vez que estes tecidos intimamente relacionados podem servir como fontes importantes de biomarcadores para VS. Finalmente, este protocolo apresenta etapas para a transdução viral de células VS humanas primárias em cultura como uma nova aplicação deste tecido para uso na terapia de genes.

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Protocolo

O consentimento informado escrito para a coleta de todas as amostras foi obtido antes da cirurgia e os experimentos foram realizados de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsinque). Todas as seções do protocolo de estudo foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional do Massachusetts Eye Hospital e Hospital Geral de Massachusetts.

NOTA: As seções 1-7 abaixo são projetadas para serem realizadas sequencialmente após o recebimento de uma amostra VS ou GAN humana primária da sala de operação. O processamento deve sempre começar com a seção 1. Em seguida, como regra, o RNA deve ser preservado primeiro (seção 2), seguido da preparação de tecido para a coleta de secreções (seção 3) e extração de proteína (seção 4). O tecido a ser cultivado (seção 5 para VS, seção 6 para GAN) pode se sentar em meio de cultura suplementado enquanto as seções 2, 3 e 4 são realizadas. A fixação do tecido para seção (seção 7) é muito curta e cUm ser realizado durante qualquer passo de centrifugação. A seção 8 (processamento de perilimitação) e a seção 9 (processamento CSF) podem ser realizadas após o recebimento de perilymph ou CSF da sala de operação durante uma ressecção VS translabyrinthine. A seção 10 (transdução viral) pode ser realizada em células VS ou Schwann em cultura.

1. Preparação e recebimento de uma amostra cirúrgica

NOTA: As seguintes etapas devem ser realizadas em um ambiente estéril, como um capuz de cultura de tecidos ou capa de fluxo laminar. É esperada familiaridade com a técnica estéril básica.

  1. Preparação de meio para VS humano primário ou cultura de células de Schwann
    1. Destilar uma alíquota de 50 mL de soro de bovino fetal congelado (FBS) em um banho de água a 37 ° C.
    2. Adicione 5 mL de mistura de penicilina / estreptomicina a um frasco de 500 mL de DMEM / F-12, resultando em uma diluição final de 1: 100.
    3. Adicione os 50 mL de FBS descongelado ao frasco de 500 mL de DMEM / F-12,Resultando em uma diluição final de 1:10.
    4. Escreva a data, as iniciais do pesquisador e informações suplementares ( por exemplo, 1% P / S, 10% FBS) no frasco.
    5. Coloque o novo meio de cultura na geladeira (4 ° C).
  2. Recebimento e limpeza da amostra VS ou GAN
    1. Na sala de operação, coloque a amostra VS ou GAN recentemente colhida em solução salina estéril em um recipiente de amostra. Transporte a amostra no gelo da sala de operação para um capô de fluxo laminar no laboratório.
      NOTA: Os tamanhos e pesos das amostras variam significativamente entre os pacientes com base no tamanho do tumor relevante ou na quantidade de nervo excisado.
    2. Remova as alíquotas de solução-estoque de hialuronidase (25 000 U / mL) e colagenase (3.200 U / mL) do congelador e deixe descongelar as enzimas à temperatura ambiente (necessário para as etapas 5.1.4 ou 6.1.6, dependendo da amostra Um VS ou um GAN).
      NOTA: A ressuspensão de enzimas liofilizadas iS descritos em detalhes nas folhas de informações do produto. A colagenase pode ser ressuspensa em qualquer solução de sal equilibrada isenta de cálcio e hialuronidase numa solução de tampão de fosfato 0,02 M (pH 7,0), NaCl 77 mM e 0,01% de 1 mg / mL de albumina de soro bovino. A atividade específica para cada enzima liofilizada varia com o lote e deve ser verificada antes da ressuspensão.
    3. Usando uma série de três tubos de 1,5 mL preenchidos com 1,4 mL de 1x PBS estéril, lave a amostra VS ou GAN três vezes. Transmita cuidadosamente o espécime de tubo a tubo com pinça estéril. Feche cada tubo uma vez que contém o espécime e agite suavemente para lavar.
      NOTA: Para evitar inundações nos tubos de 1,5 mL, pode usar-se menos de 1,4 mL de PBS por tubo se a peça do tumor for grande.
    4. Coloque a amostra em uma placa seca de Petri de 60 mm e use fórceps para remover todo o tecido morto (por exemplo , porções cauterizadas, que geralmente são de cor branca ou opaca) e áreas com vasos sanguíneos proeminentes.
    5. Use fOrceps ou uma lâmina de bisturis para dividir a amostra em peças separadas para preservação de ARN, extração de proteínas, coleta de secreção, fixação e cultura de células (ver seções 2 a 6 abaixo).
    6. Transfira a peça do espécime designada para cultura celular (seção 5/6) para um novo prato de cultura de 60 mm que contenha 5-8 mL de meio DMEM / F-12 frio e suplementado (em alternativa, a tampa do primeiro prato de cultura pode ser Usado para este passo).
      NOTA: A quantidade de meio DMEM / F-12 necessário (a partir do passo 1.1) dependerá do tamanho do tumor ou nervo, mas deve cair entre 5 e 8 mL. Esta peça pode se sentar em meio de cultura enquanto as etapas subseqüentes são realizadas.

2. Preservação de RNA de tecido VS e GAN (também válido para o epitélio sensorial humano)

  1. Sob o capô de fluxo laminar, transfira 1-1,2 mL de solução de estabilização de ARN para um novo tubo de 1,5 mL.
  2. Depois de lavar o espécime com PBS (passo 1.2.3), mergulhe brevemente a torta pequenaCe do tecido designado para a preservação de RNA (aproximadamente 3 mm 3 de VS ou um comprimento de 5 mm de GAN) na solução de estabilização de ARN. Certifique-se de que o espécime está completamente imerso na solução.
  3. Prepare e rotule um novo tubo de 1,5 mL. Recupere o espécime da solução de estabilização de ARN, transfira-o para o novo tubo e guarde-o em um congelador de -80 ° C.

3. Coleção das secreções VS e GAN

  1. Dia 1
    1. Depois de lavar o espécime com PBS (passo 1.2.3), coloque o pedaço de VS ou GAN designado para a coleta de secreções em um tubo vazio de 1,5 mL.
    2. Prepare dois tubos adicionais de 1,5 mL e pipette 500 μL de DMEM (não suplementado com FBS) em cada tubo.
      NOTA: O primeiro tubo de DMEM será usado para coletar as secreções tumorais e o segundo tubo de DMEM servirá como controle combinado. As secreções podem ser coletadas no DMEM, qualquer outro meio de cultura típico nãoSuplementado com soro, ou PBS.
    3. Coloque um dos tubos contendo DMEM em uma escala digital calibrada. Tare a escala, de modo que quando o tubo se encaixa no topo da escala, ele lê 0 mg.
    4. Remova o tubo de DMEM da escala, coloque o pedaço de amostra designado para a coleta de secreções no tubo e pesá-lo. Observe o resultado, que representará o peso do tecido sozinho.
    5. Sob um capô de fluxo laminar, ajuste o volume de DMEM no tubo para 100 μL por 10 mg de espécime.
    6. Coloque o tubo contendo a amostra de tecido e seu controle combinado (DMEM sozinho) na incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 ) por um período consistente com os planos para esta experiência. Incube o tecido por pelo menos 72 h para coletar quantidades biologicamente úteis de secreções tumorais ou nervosas 15 .
  2. Dia 4
    1. Após a incubação por 72 h, remova o meio contendo secreção doEspécime ( ou seja, meio condicionado com tecido) usando uma pipeta de 1 mL. Para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento, aliquote o meio em novos tubos de acordo com as análises a jusante previstas ( por exemplo, para executar um ELISA com 4 poços que requerem 50 μL cada, podem ser preparadas alíquotas de 210 μL).
    2. Se necessário, congele a peça de tecido restante no tubo original (já rotulada no Dia 1) a -80 ° C para análises adicionais, como a extração de DNA, em uma data posterior.
    3. Armazene o tecido, as secreções e controle o DMEM em um congelador de -80 ° C até as aplicações a jusante serem iniciadas ( por exemplo, ELISAs, LC-MS / MS, matrizes de citocinas, etc. ).

4. Extração de proteínas de tecido VS ou GAN

  1. Preparação do tampão RIPA fortificado
    1. Adicione um comprimido de inibidor de fosfatase e um comprimido de inibidor de protease a 10 mL de tampão RIPA em um tubo de 15 mL; Isso é fortificadoTampão RIPA.
      NOTA: Armazene o buffer RIPA a 4 ° C e adicione os comprimidos imediatamente antes da utilização.
  2. Extração de proteínas
    1. Transfira 210 μL de tampão RIPA fortificado (passo 4.1.1) para um novo tubo de 1,5 mL.
    2. Depois de lavar o espécime com PBS (passo 1.2.3), transfira o pequeno pedaço de tecido designado para extração de proteína (aproximadamente 3 mm3 de VS ou 5 mm de comprimento de GAN) para o tubo contendo tampão RIPA e coloque-o sobre gelo Durante pelo menos 10 min. Se estiver estudando formas de proteínas fosforiladas, complete o tampão RIPA com inibidores da protease e da fosfatase 14 . Entretanto, podem ser realizadas etapas para outros componentes do processamento de tecidos, como a fixação (seção 7).
    3. Pré-esfriar a centrífuga para 4 ° C.
    4. Usando um pilão plástico, homogeneize o tecido no tubo contendo tampão RIPA. Sonicate o tecido por 10-15 s com uma amplitude de 20%. Certifique-se de que o espécimePermanece no gelo, mesmo durante a sonicação.
    5. Centrifugar durante 10 min a 15,000 xg e 4 ° C.
    6. Alíquota o sobrenadante em incrementos de 50 μL em novos tubos de 0,5 mL (dependendo das aplicações a jusante pretendidas, qualquer tamanho de incremento pode ser escolhido).
    7. Armazene as alíquotas do lisado de proteína em um congelador de -80 ° C até que as aplicações a jusante sejam iniciadas ( por exemplo, ELISA ou Western blots) 20 , 21 .

5. Cultura humana primária

  1. Dia 1
    1. Separe o tecido VS designado para a cultura de células (que está sentado no meio de cultura, como descrito no passo 1.2.6) em aproximadamente 1 mm 3 de peça usando um par de fórceps em cada mão.
    2. Aspirar o meio contendo um tumor com uma pipeta sorológica de 10 mL e transferir todos os teores para um tubo cônico de 15 mL.
    3. Centrifugar por 3 min a1000 xg e 25 ° C.
    4. Prepare o meio de desintegração em um novo prato de cultura de 60 mm, combinando 4,7 mL de meio DMEM / F-12 suplementado com 250 μL de colagenase (concentração final: 160 U / mL) e 50 μL de hialuronidase (concentração final: 250 U / mL) , Para um volume final de 5 mL.
      NOTA: ambas as enzimas devem ser armazenadas em um congelador de -20 ° C, mas descongeladas antes da preparação deste meio (passo 1.2.2).
    5. Após a centrifugação, os pedaços de tumor formarão uma pelota no fundo do tubo cônico. Deixe uma pipeta com cuidado e descarte o sobrenadante.
    6. Adicionar 2 mL do meio de desintegração contendo enzima recém-fabricado (passo 5.1.4) ao sedimento do tumor. Pipete para cima e para baixo várias vezes para mobilizar o tecido e transferir a peça de tumor contendo meio para o prato de cultura de 60 mm.
    7. Coloque o prato de cultura na incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 ) durante 18 h.
  2. Dia 2
    1. D quenteMeio MEM / F-12 suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina (preparado no passo 1.1) num banho de água a 37 ° C.
    2. Remova a placa de Petri contendo a cultura VS da incubadora (passo 5.1.7). Usando uma agulha de 22 G anexada a uma seringa de 6 mL, aspirar o meio contendo cultura e transferi-lo para um novo tubo cônico de 15 mL.
    3. Centrifugar durante 5 min a 1000 xg e 37 ° C.
    4. Entretanto, use fórceps estéreis para colocar o número necessário de lamelas de vidro revestidas de poli-D-lisina e laminina em uma placa de cultura de 24 poços.
      NOTA: O número de poços a serem cultivados depende do tamanho da amostra; Aproximadamente 24-32 poços podem ser cultivados a partir de um tumor de 1 cm 3 , portanto, para a maioria dos tumores menores, o planejamento de 8-16 poços de células cultivadas é apropriado.
    5. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante ( ou seja, meio enriquecido em enzima) e ressuspenda o sedimento celular residual em meio DMEM / F-12 fresco, suplementado, pré-aquecidoEd no passo 5.2.1.
      NOTA: O volume para ressuspender o sedimento é determinado pelo número de poços planejado no passo 5.2.4, estimando 1 mL de meio por poço planejado.
    6. Aspirar 2 mL do meio celular ressuspenso (passo 5.2.5) usando uma pipeta sorológica de 5 mL. Deposite 1 mL do meio contendo células tumorais em cada poço preparado da placa de 24 poços.
    7. Continue aspirando e depositando o meio contendo células tumorais (aspirando em incrementos de 2 mL, dos quais 1 mL é depositado em cada poço planejado) até a suspensão das células tumorais ser dividida igualmente entre todos os poços preparados.
    8. Coloque a placa de 24 poços na incubadora a 37 ° C durante a noite.
  3. Dia 3
    1. Se os restos significativos forem observados na parte inferior dos poços, altere cuidadosamente o meio em cada poço para o novo meio de cultura de DMEM / F-12 suplementado, tomando cuidado para não desalojar as células aderentes. Caso contrário, devolva a placa à incubadora e altere-a.E médio pela primeira vez no dia 5.
  4. Dias 5-7 e depois
    1. Mude o meio a cada 3 dias.
      NOTA: As células primárias VS e GAN humanas são geralmente mantidas em cultura até seu uso em aplicações a jusante, em ou cerca de 14 dias de idade. A pureza da cultura diminui depois disso 19 .

6. Cultura GAN humana primária

  1. Dia 1
    1. Sob um microscópio de dissecação, isolar fascículos do tecido designado para a cultura GAN (que foi sentado em meio de cultura, como descrito no passo 1.2.6).
      1. Isolar os fascículos do epineuro e bainha fibrosa, puxando o perineuro usando o nº. 5 pinças enquanto se agarra o epineuro com o n. 3 fórceps.
    2. Uma vez que os fascículos estão suficientemente isolados do epineuário circundante, transfira-os para um novo prato de cultura contendo 2 mL de suco frescoMeio médio.
    3. Corte os fascículos em segmentos de 1 a 2 mm usando a lâmina do bisturi.
    4. Pipetar os pequenos pedaços de fascículo e o meio circundante em um tubo de 15 mL contendo 3 mL de meio de cultura suplementado fresco, de modo que o volume total no tubo de 15 mL se torne 5 mL.
    5. Centrifugue o espécime por 3 min a 1000 xg e 25 ° C.
    6. Enquanto isso, faça um meio de cultura de células de Schwann em uma nova placa de Petri de 60 mm combinando 4,7 mL de meio DMEM / F-12 suplementado, 250 μL de colagenase e 50 μL de hialuronidase, para um volume final de 5 mL.
      NOTA: Armazene ambas as enzimas a -20 ° C; Descongelá-los à temperatura ambiente antes de preparar este meio (passo 1.2.2).
    7. Após a centrifugação do espécime, os fascículos se condensarão em um pequeno grânulo no tubo cônico. Descarte o sobrenadante.
    8. Adicionar 2 mL do meio de desintegração contendo enzima recém-fabricado (passo 6.1.6) ao sedimento do nervo. Pipetar e dVárias vezes para mobilizar o tecido e transferi-lo para um novo prato de cultura de 60 mm.
    9. Coloque o prato na incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 ) durante 20-22 h.
      NOTA: Esta é uma incubação mais longa do que é necessário para amostras VS (passo 5.1.7).
  2. Dia 2
    1. Meio DMEM / F-12 suplementado quente em banho-maria a 37 ° C.
    2. Usando uma agulha de 22 G anexada a uma seringa de 6 mL, aspirar o meio contendo a cultura de células e transferi-lo para um novo tubo cônico de 15 mL.
    3. Centrifugar durante 5 min a 1000 xg e 37 ° C.
    4. Descarte o sobrenadante e ressuspenda a amostra em meio de cultura DMEM / F-12 novo, pré-aquecido, suplementado.
    5. Use pinças estéreis para colocar o número necessário de lamínulas revestidas nos poços de uma placa de cultura de 24 poços.
      NOTA: O cálculo de dois poços de células cultivadas por amostra de nervo de 1 cm promove o crescimento robusto da cultura.
    6. Adicione 1 mL do meio contendo cultura a cadaBem designado na placa de 24 poços.
    7. Coloque a placa de 24 poços na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 .
  3. Dia 3
    1. Se forem detectados detritos significativos nos poços, substitua cuidadosamente o meio com novo meio de cultura de DMEM / F-12 suplementado, tomando cuidado para não desalojar as células aderentes. Caso contrário, devolva a placa à incubadora e mude o meio pela primeira vez no dia 5.
  4. Dias 5-7 e depois
    1. Mude o meio a cada 3 dias.

7. VS & GAN Tissue Fixation

  1. Pipetar 1-1.2 mL de paraformaldeído a 4% (PFA, CUIDADO) em um novo tubo de 1,5 mL.
  2. Após a lavagem do tumor ou nervo com PBS (passo 1.2.3), transfira um pequeno pedaço de tecido (aproximadamente 3 mm3 de VS ou um comprimento de 5 mm de GAN) em 4% de PFA e coloque o tubo em um agitador a 4 ° C. Certifique-se de que o espécime está completamente imerso em tEle solução.
  3. Após pelo menos 2 h de fixação, retire o tubo do agitador e proceda ao processamento posterior ( por exemplo, incorporação em parafina ou composto de temperatura de corte ideal (OCT) para imuno-histoquímica ou imunofluorescência subsequente 22 , 23 , 24 . Alternativamente, o tecido pode ser congelado instantaneamente, como descrito anteriormente 25 , 26 .

8. Coleta e Armazenamento de Perilymph Humano durante o Resecção de Translavértina VS

  1. Coloque três tubos esterilizados de 1,5 mL em gelo.
    NOTA: Um tubo será mantido como um backup em caso de contaminação.
  2. Encha um tubo de 1,5 mL com aproximadamente 1,2 mL de solução de PBS que foi filtrada duas vezes usando um filtro de 0,22 μm.
    NOTA: Para coletar perilymph durante uma ressecção VS translabyrinthine, o cirurgião deve primeiro garantir que o surgiO campo cal está livre de poeira do osso, sangue ou solução salina. O cirurgião pode usar um tubo de aspiração Schuknecht 21 ou 24 G na mão não dominante para esse propósito.
    Um local típico para extrair perilymph é o canal semicircular lateral (no entanto, o canal semicircular posterior ou a membrana da janela redonda também podem ser acessados, dependendo da preferência do cirurgião). O cirurgião deve remover cuidadosamente o osso labiríntico com uma broca de diamante (ao usar irrigação por sucção contínua) para identificar a linha azul ( ou seja, o labirinto membranoso) do canal semicircular. O canal semicircular é penetrado através da linha azul usando uma agulha longa de 27 G anexada a uma seringa de tuberculina de 1 mL.
  3. Peça ao cirurgião para suavemente aspirar uma pequena quantidade de perilymph e, em seguida, passar a seringa e anexar a agulha à enfermeira cirúrgica.
    NOTA: Normalmente, uma gota de perilymph ou menos é coletada. Se o volume observado for maior, a amostra provavelmente será contaminada com outra fLuid.
  4. Abra o tubo vazio de 1,5 mL preparado e o tubo cheio com PBS diretamente antes de usar. Tenha cuidado para não tocar no interior das tampas do tubo enquanto as abre.
  5. Receba a seringa e a agulha anexada da enfermeira cirúrgica e purgue o líquido completamente no tubo vazio, tomando cuidado para não tocar o próprio tubo com a agulha.
  6. Desconecte cuidadosamente a agulha da seringa. Não contamine a ponta da agulha e continue a segurá-la em uma mão.
    NOTA: Um volume muito pequeno de perilymph foi coletado, portanto, algum líquido pode permanecer na ponta longa da agulha.
  7. Por outro lado, use a própria seringa (sem a agulha) para sugar 0,2 mL de solução de PBS filtrada do tubo preparado no corpo da seringa.
  8. Volte a colocar a agulha na seringa. Evacue completamente a seringa no tubo que contém perilymph, usando o PBS estéril para liberar a ponta da agulha.
  9. Feche o tubo que contém perilymph e PBS e coloque No gelo.
  10. Descarte a agulha em um recipiente cortante.
  11. Coloque o tubo contendo perilymph no congelador -80 ° C o mais rápido possível.

9. Coleta e Armazenamento de LCR Humano

  1. Coloque três (ou mais) tubos esterilizados de 1,5 mL em gelo.
    NOTA: Um tubo será um backup em caso de contaminação ou um volume de amostra maior que o esperado.
  2. Depois de abrir a dura-máter, pergunte ao cirurgião para coletar CSF com uma seringa de 3 mL (sem uma agulha em anexo).
    NOTA: Para evitar a contaminação, a coleta do LCR deve ocorrer imediatamente após a abertura da dura-máter.
  3. Peça ao cirurgião que entregue a seringa à enfermeira cirúrgica.
  4. Receba a seringa da enfermeira cirúrgica e evacue completamente o volume necessário de LCR no (s) tubo (s).
  5. Feche o (s) tubo (s) e coloque-os sobre gelo.
  6. Coloque o (s) tubo (s) no congelador -80 ° C o mais rápido possível.
E "> 10. Experimentos de transdução viral para células VS primárias

  1. Usando a concentração de estoque viral como referência, calcular o número desejado de contagem de genoma (gc) e a multiplicidade de infecção (MOI) necessárias para o experimento de transdução proposto; O estoque de vírus pode ser diluído diretamente no meio de cultura suplementado.
    NOTA: Qualquer vector viral adequado para a transdução de células primárias pode ser usado; Ver Landegger et al. (2017) para uma comparação detalhada de seis sorotipos de vírus adeno-associados diferentes 27 . Além disso, ao cultivar células primárias humanas, as contagens de células não são tipicamente determinadas antes do revestimento em lamínulas. As células VS primárias não respondem bem à tripsinização e ao passando, portanto, para um cálculo MOI confiável, o número de células aderentes por poço pode ser estimado usando um microscópio de contraste de fase. Alternativamente, se as células estão próximas da confluência, seus números podem ser estimados de forma confiável usando valores de densidade celular padrão paraUma placa de 24 poços ( por exemplo, 5 x 10 4 células por poço).
  2. Sob uma camada de fluxo laminar, prepare um meio suplementado contendo a quantidade desejada de vírus em um tubo de laboratório cônico de 15 mL, de modo que seja preparado 1 mL de meio contendo vírus para cada poço de células a serem transduzidas. Pipetar o meio contendo vírus para cima e para baixo para misturar suavemente, mas completamente.
  3. Usando fórceps estéril, transfira os lamínulas contendo células VS primárias (passo 5.2.8) da placa original de 24 poços para uma nova placa de 24 poços. Após a transferência de cada lamínula individual, adicione 1 mL de meio contendo vírus. Reduzir a placa cada vez que o meio é adicionado para garantir que as células estejam revestidas uniformemente com o vírus.
  4. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante a duração do experimento planejado.
    NOTA: Incubações variando de 48-120 h apresentaram resultados de transdução promissores 27 .

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Resultados

As células VS humanas primárias em cultura, conforme estabelecido na seção 5, podem ser tratadas como modelos informativos para processos associados a doenças em muitos aplicativos de pesquisa a jusante ( Figura 1 ). As células saudáveis ​​de Schwann cultivadas na seção 6 fornecem um ponto de comparação direto e instrutivo. Conforme descrito abaixo, dados extensivos de VSs e GANs processados ​​de acordo com este quadro metodológico unificado estão disponívei...

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Discussão

Este manuscrito descreve um quadro metodológico unificado para pesquisas VS, descrevendo o processamento simultâneo de espécimes humanos VS e GAN para aplicações de pesquisa a jusante. À medida que a pesquisa VS entra na idade da medicina de precisão, preparar a mesma amostra em formas capazes de responder a inúmeras questões de pesquisa possibilitará a descoberta de informações moleculares, celulares, genéticas e proteômicas específicas para pacientes individuais.

A pureza das células human...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo RIEDC015824 (KMS) e T32DC00038 (apoiando JES e SD), o Departamento de Defesa concede W81XWH-14-1-0091 (KMS), a Fundação Bertarelli (KMS) , A Fundação Nancy Sayles Day (KMS), o Centro de Pesquisa Lauer Tinnitus (KMS) e a Fundação Barnes (KMS).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 Lamínula de Vidro AlemãCorning354087Ou prepare lamínulas com Corning Laminin (CB-40232) e Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
Tubos de Centrífuga CELLSTAR 15 mL, fundo cônico, Graduação, Greiner EstérilBio-One188161
Tubos de Centrífuga CELLSTAR 50 mL, fundo cônico, Graduação, Greiner EstérilBio-One227261
Placa de Cultura de Células CELLSTAR, 60 mmGreiner Bio-One628160
Colagenase de Clostridium histolyticum, Sigma-AldrichC1639
Costar 24 Placas de Poços Múltiplos Tratadas com TC Bem Transparente, Corning3526
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato)Thermo Fisher ScientificD1306
DMEM, glicose alta, piruvato, sem glutamina, 500 mLThermo Fisher Scientific10313-039
DMEM/F-12, 500 mLThermo Fisher Scientific11320-033
Dumont #3 Fórceps, DumoxelFine Science Tools11231-30Autoclave antes do uso
Dumont #5 Fórceps, ponta padrão, InoxFine Science Tools11251-20Autoclave antes do uso
Soro Fetal Bovino, qualificado, regiões aprovadas pelo USDA, 500 mLAlíquota Thermo Fisher Scientific10437-028em tubos de 50 mL e armazenar em -20° C freezer
Hialuronidase de Testículos Bovinos, Tipo I-S, Pó LiofilizadoSigma-AldrichH3506
Millex-GP, 0.22 µ m, polietersulfona, 33 mm,EMD Milliporeestéril SLGP033RS
Paraformaldeído, Grau de Reagente, CristalinoSigma-AldrichP6148Antes de usar: Estabeleça Procedimentos Operacionais Padrão com base em protocolos disponíveis online
PBS, pH 7,4, 500 mLThermo Fisher Scientific10010-023Autoclave antes de usar
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL), 100 mLThermo Fisher Scientific15140-122
Comprimidos Inibidores de Fosfatase PhosSTOPComprimidos InibidoresRoche 04906845001
Pierce PipetasThermo Fisher Scientific88666
5/10/25 mLPilão
para Microtubos de 1,5/2,0 mLE& K ScientificEK-10539
Agulhas PrecisionGlide, 27 G x 1 1/2 inBD301629
RIPA BufferBoston BioProductsBP-115
RNAlater (solução de estabilização de RNA)Thermo Fisher ScientificAM7021
Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 0.5 mLAutoclave 022363719 Eppendorfantes do uso
Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 1.5 mLEppendorf022363204Autoclave antes do uso
Solução salina - Injeção de cloreto de sódio a 0.9%, bacteriostático, 20 mLHospira0409-1966-05
- #15Ferramentas de Ciência Fina10015-00
Tubo de Sucção Schuknecht 24 gaugeBausch + LombN1698 42Útil para a abordagem cirúrgica (além de instrumentos cirúrgicos otológicos comuns) e e.g. um marcador cirúrgico azul
Recipiente de Amostras, OU estéril, 4OZMedlineDYND30331H
Microscópio Estéreo Stemi 2000-CZeiss000000-1106-133
Combinação de Seringa/Agulha, Ponta Luer-Lok, 5 mL, 22 G x 1 pol.BD309630
Somente seringa de tuberculina, ponta deslizante, 1 mLBD309659
seringa tuberculínica apenas, ponta deslizante, 3 mLBD309656
homogeneizador ultrassônico, série 4710, sonda CV18Cole-ParmerCP25013
Unidade de Filtro de Seringa de Protease e pontas de pipeta , de Homogeneização Plástica Variável Lâminas de bisturi

Referências

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