O objetivo deste protocolo é descrever a coleta e processamento de amostras cirúrgicas humanas para múltiplas aplicações a jusante no schwannoma vestibular e na pesquisa de células de Schwann.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Um quadro metodológico unificado para pesquisa de Schwannoma vestibular
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os schwannomas vestibulares são as neoplasias mais comuns do ângulo cerebelopontino, constituindo 6-8% de todos os crescimentos intracranianos. Embora esses tumores causem perda auditiva neurossensorial em até 95% dos indivíduos afetados, os mecanismos moleculares subjacentes a essa perda auditiva permanecem indescritíveis. Este artigo descreve as etapas estabelecidas em nosso laboratório para facilitar a coleta e processamento de várias amostras primárias de tecido humano para aplicações de pesquisa a jusante integrantes ao estudo de schwannomas vestibulares. Especificamente, este trabalho descreve um quadro metodológico unificado para a coleta, processamento e cultura de células de Schwann e Schwannoma a partir de amostras cirúrgicas. Isso é integrado a etapas de processamento paralelo, agora consideradas essenciais para a pesquisa atual: a coleta de secreções tumorais e nervosas, a preservação do RNA e a extração de proteínas dos tecidos coletados, a fixação do tecido para a preparação de seções, umaD a exposição de células humanas primárias a vírus adeno-associados para aplicação na terapia genética. Além disso, este trabalho destaca a abordagem cirúrgica translocrítica para colecionar este tumor como uma oportunidade única para obter o epitélio sensorial humano da orelha interna e perilimia. São fornecidas dicas para melhorar a qualidade experimental e destacadas armadilhas comuns.
Introdução
Os schwannomas vestibulares (VSs) são as neoplasias mais comuns do ângulo cerebelopontino, diagnosticadas em 1 em cada 100.000 indivíduos. Embora não metastáticos, esses tumores afetam gravemente a qualidade de vida de um paciente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Indivíduos afetados geralmente vivem com perda auditiva, zumbido e um sentimento de plenitude auditiva. Os sintomas tornam-se cada vez mais debilitantes à medida que o tumor cresce, causando problemas de equilíbrio, paral....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
O consentimento informado escrito para a coleta de todas as amostras foi obtido antes da cirurgia e os experimentos foram realizados de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsinque). Todas as seções do protocolo de estudo foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional do Massachusetts Eye Hospital e Hospital Geral de Massachusetts.
NOTA: As seções 1-7 abaixo são projetadas para serem realizadas sequencialmente após o recebimento de uma amostra VS ou GAN humana primária da sala de operação. O processamento deve sempre começar com a seção 1. Em seguida, como regra, o RNA deve ser preservado prim....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
As células VS humanas primárias em cultura, conforme estabelecido na seção 5, podem ser tratadas como modelos informativos para processos associados a doenças em muitos aplicativos de pesquisa a jusante ( Figura 1 ). As células saudáveis de Schwann cultivadas na seção 6 fornecem um ponto de comparação direto e instrutivo. Conforme descrito abaixo, dados extensivos de VSs e GANs processados de acordo com este quadro metodológico unificado estão disponívei.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este manuscrito descreve um quadro metodológico unificado para pesquisas VS, descrevendo o processamento simultâneo de espécimes humanos VS e GAN para aplicações de pesquisa a jusante. À medida que a pesquisa VS entra na idade da medicina de precisão, preparar a mesma amostra em formas capazes de responder a inúmeras questões de pesquisa possibilitará a descoberta de informações moleculares, celulares, genéticas e proteômicas específicas para pacientes individuais.
A pureza das células human.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo RIEDC015824 (KMS) e T32DC00038 (apoiando JES e SD), o Departamento de Defesa concede W81XWH-14-1-0091 (KMS), a Fundação Bertarelli (KMS) , A Fundação Nancy Sayles Day (KMS), o Centro de Pesquisa Lauer Tinnitus (KMS) e a Fundação Barnes (KMS).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 Lamínula de Vidro Alemã | Corning | 354087 | Ou prepare lamínulas com Corning Laminin (CB-40232) e Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| Tubos de Centrífuga CELLSTAR 15 mL, fundo cônico, Graduação, Greiner Estéril | Bio-One | 188161 | |
| Tubos de Centrífuga CELLSTAR 50 mL, fundo cônico, Graduação, Greiner Estéril | Bio-One | 227261 | |
| Placa de Cultura de Células CELLSTAR, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Colagenase de Clostridium histolyticum, Sigma-Aldrich | C1639 | ||
| Costar 24 Placas de Poços Múltiplos Tratadas com TC Bem Transparente, Corning | 3526 | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, glicose alta, piruvato, sem glutamina, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Fórceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave antes do uso |
| Dumont #5 Fórceps, ponta padrão, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave antes do uso |
| Soro Fetal Bovino, qualificado, regiões aprovadas pelo USDA, 500 mL | Alíquota Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | em tubos de 50 mL e armazenar em -20° C freezer |
| Hialuronidase de Testículos Bovinos, Tipo I-S, Pó Liofilizado | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP, 0.22 µ m, polietersulfona, 33 mm, | EMD Millipore | estéril SLGP033RS | |
| Paraformaldeído, Grau de Reagente, Cristalino | Sigma-Aldrich | P6148 | Antes de usar: Estabeleça Procedimentos Operacionais Padrão com base em protocolos disponíveis online |
| PBS, pH 7,4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave antes de usar |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Comprimidos Inibidores de Fosfatase PhosSTOP | Comprimidos Inibidores | Roche 04906845001 | |
| Pierce Pipetas | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| 5/10/25 mL | Pilão | ||
| para Microtubos de 1,5/2,0 mL | E& K Scientific | EK-10539 | |
| Agulhas PrecisionGlide, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (solução de estabilização de RNA) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 0.5 mL | Autoclave 022363719 Eppendorf | antes do uso | |
| Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave antes do uso |
| Solução salina - Injeção de cloreto de sódio a 0.9%, bacteriostático, 20 mL | Hospira | 0409-1966-05 | |
| - #15 | Ferramentas de Ciência Fina | 10015-00 | |
| Tubo de Sucção Schuknecht 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Útil para a abordagem cirúrgica (além de instrumentos cirúrgicos otológicos comuns) e e.g. um marcador cirúrgico azul |
| Recipiente de Amostras, OU estéril, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Microscópio Estéreo Stemi 2000-C | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Combinação de Seringa/Agulha, Ponta Luer-Lok, 5 mL, 22 G x 1 pol. | BD | 309630 | |
| Somente seringa de tuberculina, ponta deslizante, 1 mL | BD | 309659 | |
| seringa tuberculínica apenas, ponta deslizante, 3 mL | BD | 309656 | |
| homogeneizador ultrassônico, série 4710, sonda CV18 | Cole-Parmer | CP25013 |
Referências
- Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
- Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and manage....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
