Um quadro metodológico unificado para pesquisa de Schwannoma vestibular

Summary

O objetivo deste protocolo é descrever a coleta e processamento de amostras cirúrgicas humanas para múltiplas aplicações a jusante no schwannoma vestibular e na pesquisa de células de Schwann.

Abstract

Os schwannomas vestibulares são as neoplasias mais comuns do ângulo cerebelopontino, constituindo 6-8% de todos os crescimentos intracranianos. Embora esses tumores causem perda auditiva neurossensorial em até 95% dos indivíduos afetados, os mecanismos moleculares subjacentes a essa perda auditiva permanecem indescritíveis. Este artigo descreve as etapas estabelecidas em nosso laboratório para facilitar a coleta e processamento de várias amostras primárias de tecido humano para aplicações de pesquisa a jusante integrantes ao estudo de schwannomas vestibulares. Especificamente, este trabalho descreve um quadro metodológico unificado para a coleta, processamento e cultura de células de Schwann e Schwannoma a partir de amostras cirúrgicas. Isso é integrado a etapas de processamento paralelo, agora consideradas essenciais para a pesquisa atual: a coleta de secreções tumorais e nervosas, a preservação do RNA e a extração de proteínas dos tecidos coletados, a fixação do tecido para a preparação de seções, umaD a exposição de células humanas primárias a vírus adeno-associados para aplicação na terapia genética. Além disso, este trabalho destaca a abordagem cirúrgica translocrítica para colecionar este tumor como uma oportunidade única para obter o epitélio sensorial humano da orelha interna e perilimia. São fornecidas dicas para melhorar a qualidade experimental e destacadas armadilhas comuns.

Introduction

Os schwannomas vestibulares (VSs) são as neoplasias mais comuns do ângulo cerebelopontino, diagnosticadas em 1 em cada 100.000 indivíduos. Embora não metastáticos, esses tumores afetam gravemente a qualidade de vida de um paciente ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Indivíduos afetados geralmente vivem com perda auditiva, zumbido e um sentimento de plenitude auditiva. Os sintomas tornam-se cada vez mais debilitantes à medida que o tumor cresce, causando problemas de equilíbrio, paral....

Protocol

O consentimento informado escrito para a coleta de todas as amostras foi obtido antes da cirurgia e os experimentos foram realizados de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsinque). Todas as seções do protocolo de estudo foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional do Massachusetts Eye Hospital e Hospital Geral de Massachusetts.

NOTA: As seções 1-7 abaixo são projetadas para serem realizadas sequencialmente após o recebimento de uma amostra VS ou GAN humana primária da sala de operação. O processamento deve sempre começar com a seção 1. Em seguida, como regra, o RNA deve ser preservado prim....

Results

As células VS humanas primárias em cultura, conforme estabelecido na seção 5, podem ser tratadas como modelos informativos para processos associados a doenças em muitos aplicativos de pesquisa a jusante ( Figura 1 ). As células saudáveis ​​de Schwann cultivadas na seção 6 fornecem um ponto de comparação direto e instrutivo. Conforme descrito abaixo, dados extensivos de VSs e GANs processados ​​de acordo com este quadro metodológico unificado estão disponívei.......

Discussion

Este manuscrito descreve um quadro metodológico unificado para pesquisas VS, descrevendo o processamento simultâneo de espécimes humanos VS e GAN para aplicações de pesquisa a jusante. À medida que a pesquisa VS entra na idade da medicina de precisão, preparar a mesma amostra em formas capazes de responder a inúmeras questões de pesquisa possibilitará a descoberta de informações moleculares, celulares, genéticas e proteômicas específicas para pacientes individuais.

A pureza das células human.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 Lamínula de Vidro Alemã	Corning	354087	Ou prepare lamínulas com Corning Laminin (CB-40232) e Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
Tubos de Centrífuga CELLSTAR 15 mL, fundo cônico, Graduação, Greiner Estéril	Bio-One	188161
Tubos de Centrífuga CELLSTAR 50 mL, fundo cônico, Graduação, Greiner Estéril	Bio-One	227261
Placa de Cultura de Células CELLSTAR, 60 mm	Greiner Bio-One	628160
Colagenase de Clostridium histolyticum, Sigma-Aldrich		C1639
Costar 24 Placas de Poços Múltiplos Tratadas com TC Bem Transparente, Corning		3526
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato)	Thermo Fisher Scientific	D1306
DMEM, glicose alta, piruvato, sem glutamina, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	10313-039
DMEM/F-12, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	11320-033
Dumont #3 Fórceps, Dumoxel	Fine Science Tools	11231-30	Autoclave antes do uso
Dumont #5 Fórceps, ponta padrão, Inox	Fine Science Tools	11251-20	Autoclave antes do uso
Soro Fetal Bovino, qualificado, regiões aprovadas pelo USDA, 500 mL	Alíquota Thermo Fisher Scientific	10437-028	em tubos de 50 mL e armazenar em -20° C freezer
Hialuronidase de Testículos Bovinos, Tipo I-S, Pó Liofilizado	Sigma-Aldrich	H3506
Millex-GP, 0.22 µ m, polietersulfona, 33 mm,	EMD Millipore	estéril SLGP033RS
Paraformaldeído, Grau de Reagente, Cristalino	Sigma-Aldrich	P6148	Antes de usar: Estabeleça Procedimentos Operacionais Padrão com base em protocolos disponíveis online
PBS, pH 7,4, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	10010-023	Autoclave antes de usar
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL), 100 mL	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Comprimidos Inibidores de Fosfatase PhosSTOP	Comprimidos Inibidores	Roche 04906845001
Pierce Pipetas	Thermo Fisher Scientific	88666
5/10/25 mL	Pilão
para Microtubos de 1,5/2,0 mL	E& K Scientific	EK-10539
Agulhas PrecisionGlide, 27 G x 1 1/2 in	BD	301629
RIPA Buffer	Boston BioProducts	BP-115
RNAlater (solução de estabilização de RNA)	Thermo Fisher Scientific	AM7021
Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 0.5 mL	Autoclave 022363719 Eppendorf		antes do uso
Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 1.5 mL	Eppendorf	022363204	Autoclave antes do uso
Solução salina - Injeção de cloreto de sódio a 0.9%, bacteriostático, 20 mL	Hospira	0409-1966-05
- #15	Ferramentas de Ciência Fina	10015-00
Tubo de Sucção Schuknecht 24 gauge	Bausch + Lomb	N1698 42	Útil para a abordagem cirúrgica (além de instrumentos cirúrgicos otológicos comuns) e e.g. um marcador cirúrgico azul
Recipiente de Amostras, OU estéril, 4OZ	Medline	DYND30331H
Microscópio Estéreo Stemi 2000-C	Zeiss	000000-1106-133
Combinação de Seringa/Agulha, Ponta Luer-Lok, 5 mL, 22 G x 1 pol.	BD	309630
Somente seringa de tuberculina, ponta deslizante, 1 mL	BD	309659
seringa tuberculínica apenas, ponta deslizante, 3 mL	BD	309656
homogeneizador ultrassônico, série 4710, sonda CV18	Cole-Parmer	CP25013