É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Produção de produtos químicos por

8.6K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/55828

⸱

29 de junho de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lab of Biorefinery, Shanghai Advanced Research Institute, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences, 3Biorefinery Research Center, Jeonbuk Branch Institute, Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB), 4School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University

Neste artigo

Resumo

O pó de bambu foi pré-tratado com NaOH e hidrolisado enzimaticamente. O hidrolisado de bambu foi utilizado como matéria-prima para ácido 2,3-butanodiol, R -acetato, ácido 2-cetoglucónico e produção de ácido xilónico por Klebsiella pneumoniae .

Resumo

O bambu é uma biomassa importante e o hidrolisado de bambu é usado por Klebsiella pneumoniae como matéria-prima para produção química. Aqui, o pó de bambu foi pré-tratado com NaOH e lavado até um pH neutro. A celulase foi adicionada ao pó de bambu pré-tratado para gerar o hidrolisado, que continha 30 g / L de glicose e 15 g / L de xilose e foi utilizado como fonte de carbono para preparar um meio para produção química. Quando cultivadas em condições microaeróbicas, 12,7 g / L de 2,3-butanodiol foi produzido pelo tipo selvagem K. pneumoniae . Em condições aeróbicas, 13,0 g / L de R- acetona foi produzida pelo mutante BudC de K. pneumoniae . Uma mistura de 25,5 g / L de ácido 2-cetoglucónico e 13,6 g / L de ácido xilónico foi produzida pelo mutante BudA de K. pneumoniae em uma fermentação controlada com pH de dois estágios com alta suplementação com o ar. Na primeira fase de fermentação, a cultura foi mantida a um pH neutro; Após o crescimento celular, a fermentaçãoN prosseguiu para o segundo estágio, durante o qual a cultura foi deixada a tornar-se ácida.

Introdução

Klebsiella pneumoniae é uma bactéria que cresce bem em condições aeróbicas e anaeróbicas. K. pneumoniae é um importante microorganismo industrial usado para produzir muitos produtos químicos. 1,3-propanodiol é um produto químico valioso que é usado principalmente como um monómero para sintetizar tereftalato de politrimetileno. O tereftalato de politrimetileno é um poliéster biodegradável que apresenta melhores propriedades do que o 1,2-propanodiol, o butanodiol ou o etilenoglicol 1 . 1,3-propanodiol é produzido por K. pneumoniae utilizando glicerol como substrato em condições de oxigenação limitada 2 . O 2,3-butanodiol e os seus derivados têm aplicações no domínio dos plásticos, da produção de solventes e da borracha sintética e podem ser utilizados como biocombustíveis 3 . Com a glicose como substrato, o 2,3-butanodiol é o principal metabolito da linhagem 4 do tipo selvagem. 2,3-butanodiol é sintetizadoDe piruvato. Em primeiro lugar, duas moléculas de piruvato se condensam para produzir o a-acetolactato; Esta reação é catalisada pela a-acetolactato sintase. O α-acetolactato é então convertido em acetoin por a-acetolactato descarboxilase. A R- acetona pode ser ainda reduzida ao 2,3-butanodiol quando catalisada pela butanodiol desidrogenase. Um método eficiente de substituição de genes adequado para K. pneumoniae foi explorado, e muitos mutantes foram construídos 5 , 6 , 7 . Um mutante de budC , que perdeu a sua 2,3-butanodiol desidrogenase, acumula níveis elevados de acetoin em caldo de cultura. A aceetona é utilizada como aditivo para aumentar o sabor dos alimentos 8 . Quando BudA , que codifica α-acetolactato descarboxilase, é mutado, o ácido 2-cetoglucônico se acumula no caldo. O ácido 2-cetoglucónico é utilizado para a síntese de ácido eritórbico (ácido isoascórbico), Um antioxidante usado na indústria alimentar 9 . O ácido 2-cetoglucónico é um intermediário da via de oxidação da glicose; Nesta via, localizado no espaço periplásmico, a glicose é oxidada para o ácido glucônico e depois oxidada para o ácido 2-cetoglucônico. O ácido glucónico e o ácido 2-cetoglucônico produzido no periplasma podem ser transportados para o citoplasma para o metabolismo adicional. A acumulação de ácido 2-cetoglucônico é dependente de condições ácidas e uma suplementação aérea mais favorável à produção de ácido 2-cetoglucônico 10 . Gluconato desidrogenase, codificado por gad , Catalisa a conversão de ácido glucônico em ácido 2-cetolgucônico. O mutante gad de K. pneumoniae produziu altos níveis de ácido glucônico em vez de ácido 2-cetoglucônico, e esse processo também depende de condições ácidas. O ácido glucónico é um ácido orgânico a granel e é usado como aditivo para aumentar as propriedades do cimento 11. A oxidação de glicose para o ácido glucónico é catalisada pela glicose desidrogenase. A xilose também é um substrato adequado de glicose desidrogenase. Quando a xilose é utilizada como substrato, K. pneumoniae produz ácido xilónico 12 .

A produção química usando biomassa como matéria-prima é um tema candente na biotecnologia 13 . Os principais componentes da biomassa são celulose, hemicelulose e lignina. No entanto, estes compostos macromoleculares não podem ser catabolizados diretamente pela maioria dos microorganismos (incluindo K. pneumoniae ). A celulose e as hemiceluloses na biomassa devem ser hidrolisadas para glicose e xilose e podem então ser utilizadas por microorganismos. A presença de lignina em lignoceluloses cria uma barreira protetora que impede a hidrolização de biomassa por enzimas. Assim, um processo de pré-tratamento que remove lignina e hemicelulose e reduz a cristalinidade da celulose é sempre realizado durante a utilização da biomassa por microfoneRoorganismos. Muitos métodos de pré-tratamento foram desenvolvidos: pré-tratamentos ácidos, alcalinos, amoníacos e a vapor são comuns.

O bambu é abundante em regiões tropicais e subtropicais e é um importante recurso de biomassa. Aqui, a preparação de hidrolisado de bambu e produção química usando hidrolisado de bambu são apresentados

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Preparação de hidrolisado de bambu

  1. Adicione 5 g de pó de bambu a 40 mL de uma solução de NaOH para se obter uma concentração final de 10% (g / g) num balão de 250 mL. Use uma série de soluções de NaOH variando de 0,05 M a 0,50 M em incrementos de 0,05 M.
    1. Incubar a mistura durante 60 minutos a 60 ° C ou 100 ° C num banho de água. Incubar a 121 ° C em uma autoclave.
  2. Após a incubação, deixe a mistura em repouso durante 4 horas à temperatura ambiente. Em seguida, retire o sobrenadante. Adicione 100 mL de água fresca e misture.
    1. Repita esta lavagem 5-6 vezes, até que o pH do sobrenadante atinja 6,8. Use o sólido obtido para o próximo passo de hidrólise enzimática.
  3. Para hidrólise, ajuste 50 mL da mistura acima a pH 5,0 usando H 2 SO 4 a 98%. Em seguida, adicione 0,5 mL de atividade de papel de filtro 200 (FPU) / mL de celulase.
    NOTA: A proporção final de celulase para bambu shSeriam 20 FPU por 1 g de bambu.
  4. Incubar a mistura a 50 ° C por 36 h em um agitador.
    NOTA: Após a hidrólise, alguns sólidos permanecerão na mistura.
  5. Obter um hidrolisado claro por centrifugação a 7.690 xg durante 5 min.
  6. Quantifique a glicose, a xilose e outros produtos químicos com um sistema de cromatografia líquida de alta pressão equipado com um detector de índice de refração e um detector de matriz de fotodiodo. Use uma coluna HPX-87H (300 mm x 7,8 mm) e uma fase móvel de solução 5 mM de H 2 SO 4 a uma taxa de fluxo de 0,8 mL / min 12 .
  7. Para um grande volume de preparação de hidrolisado, misture 2 kg de pó de bambu e 18 L de NaOH 0,25 M em um tanque de aço inoxidável de 30 L.
    1. Incubar o tanque a 121 ° C em uma autoclave durante 60 min. Após a incubação, lave a mistura com 40 L de água em um tanque de plástico de 60 L. Repita esta lavagem 5 vezes.
    2. Use água para ajustar o bambu lavado total a um volume de 20 L.Ajuste o pH da mistura para 5,0 utilizando 98% de H 2 SO 4 .
    3. Hidrolisar enzimicamente a mistura em um banho de água de agitação modificado, equipado com um agitador mecânico para garantir que a mistura esteja bem distribuída. Adicionar 200 mL de celulase de 200 FPU / mL e incubar a mistura a 50 ° C durante 36 h.
    4. Após hidrólise, centrifugar a mistura a 4.700 xg durante 10 min.

2. Produção de 2,3-butanodiol por Wildtype K. pneumoniae

  1. Use 3 L de hidrolisado de bambu como solvente para preparação média.
  2. Preparar um meio de fermentação contendo 4 g / L de licor íngreme de milho, 2 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 6 g / LK 2 HPO 4 , 3 g / L KH 2 PO 4 e 0,2 g / L de MgSO4. Ajuste o pH do meio para neutro usando NaOH 2,5 M. Use um biorreator de 5 L contendo 3 L de meio de fermentação autoclavada para fermentação.
  3. Use K. pneumoniaeCélulas armazenadas em um refrigerador de baixa temperatura de -80 ° C.
  4. Para a cultura de semente, incubar um balão de 250 mL contendo 50 mL de meio Luria-Bertani (LB) durante a noite a 37 ° C, com agitação a 200 rpm. Use meio LB contendo 10 g / L de triptona, extracto de levedura 5 g / L e NaCl 10 g / L.
    NOTA: A densidade celular da cultura de semente deve atingir OD 2 (densidade óptica a 600 nm).
  5. Inocular um balão de 50 mL da cultura de semente no biorreator. Manter a cultura a pH 6,0 e 37 ° C. Use uma taxa de suplementação de ar de 2 L / min e uma taxa de agitação de 250 rpm, criando uma condição microaeróbica.
  6. Coletar amostras de 5 mL a cada 2 h durante a fermentação e analisá-las com cromatografia líquida de alta pressão para determinar as concentrações químicas no caldo 4 .
    1. Monitore o álcali adicionado ao biorreator online usando MFCS / DA.
      NOTA: Os ácidos orgânicos são produzidos no processo de fermentação, umE adiciona-se NaOH para manter o pH da cultura estável. O volume de álcali adicionado representa a quantidade de ácido produzido. Quando os planaltos de linha alcalina, o processo é concluído, quer por causa do esgotamento da fonte de carbono ou morte celular.

3. Produção de R- acetona pelo mutante BudC de K. pneumoniae

  1. Prepare um meio para a produção de acetoinina contendo 4 g / L de licor de milho, 2 g / L (NH4) 2SO4, 3 g / L de acetato de sódio, 0,4 g / L de KCl e 0,1 g / L de MgSO4.
  2. Use K. pneumoniae-ΔbudC para a produção de R- acetato. Repita as etapas 2.4-2.5.
    NOTA: o budC codifica 2,3-butanodiol desidrogenase. K. pneumoniae-ΔbudC perde a atividade de 2,3-butanodiol desidrogenase e produz R- acetona em vez de 2,3-butanodiol.
  3. Manter a cultura a pH 6,0 e 37 ° C. Use uma taxa de suplementação de ar de 4 L / min e uma agitaçãoN taxa de 450 rpm, uma condição aeróbica.
    NOTA: A suplementação de oxigênio é maior do que a produção de 2,3-butanodiol.
  4. Ensaiar as amostras como no passo 2.6.

4. Produção de ácido 2-Ketogluconic pelo budA Mutant de K. pneumoniae

  1. Para a produção de ácido 2-cetoglucônico, use o mesmo meio que a produção de R- acetato.
  2. Use K. pneumoniae-ΔbudA para produção de ácido 2-cetoglucônico. Repita as etapas 2.4-2.5.
    NOTA: budA codifica α-acetolactate descarboxilase. K. pneumoniae-ΔbudA perde a atividade da α-acetolactato descarboxilase e produz ácido 2-cetoglucônico, usando glicose como substrato.
    NOTA: a síntese de ácido 2-cetoglucônico é um processo dependente da condição ácida. Uma fermentação em dois estágios foi desenvolvida para a produção de ácido 2-cetoglucônico 10 ; Na primeira fase, a cultura de semente é inoculada no biorreator.
  3. Mantenha a cultura a pH 7,0 e 37 ° C. Use uma taxa de suplementação de ar de 4 L / min e uma taxa de agitação de 500 rpm.
    NOTA: Nessas condições, as células crescem muito rapidamente (a densidade celular atinge OD7 em cerca de 4 h). Então, a fermentação avança para o segundo estágio, durante o qual o pH da cultura diminui para 5,0. Não é adicionado ácido; Os ácidos orgânicos produzidos na cultura conduzem naturalmente à diminuição do pH. Nessas condições ácidas, o crescimento celular pára, mas o ácido 2-cetoglucônico é sintetizado e se acumula no caldo.
  4. Ensaiar as amostras como no passo 2.6. Usando o hidrolisado de bambu como fonte de carbono.
    NOTA: A glicose no meio é convertida em ácido 2-cetoglucônico, e a xilose é convertida em ácido xilônico. Assim, é obtida uma mistura de ácido 2-cetoglucónico e ácido xilónico.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Neste protocolo, o bambu foi pré-tratado usando álcali. Os parâmetros de incubação ótimos - uma temperatura de 121 ° C e 0,25 M de NaOH - foram determinados nas Figuras 1 e 2 . O bambu pré-tratado foi hidrolisado enzimaticamente e as concentrações de glicose e xilose obtidas no hidrolisado foram medidas. Temperaturas mais altas favoreceram a produção de açúcar, portanto, 121 ° C foi selecionada como a temperatura ideal. A glicose e a xilose produzidas no...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

K. pneumoniae pertence ao gênero Klebsiella na família Enterobacteriaceae . K. pneumoniae é distribuído amplamente em ambientes naturais, como solo, vegetação e água 14 . A cepa de K. pneumoniae de tipo selvagem utilizada nesta pesquisa foi isolada do solo e é usada para a produção de 1,3-propanodiol 15 . K. pneumoniae e os mutantes desta espécie produzem muitos produtos químicos sob diferentes condições.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21576279, 20906076) e o Programa de Iniciativa de Pesquisa KRIBB (KGM2211531).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
autoclaveSANYO3780
biorreatorSartorius stedim biotechBostat Aplus
agitadorIKARW 20
agitador de banho-mariaZhichengZWY-110X50
sistema de cromatógrafo líquido de alto desempenhoShimadzu Corp20AVP
centrífugaHitachiCR22G III
Pó de bambucomprado da província de Zhejiang, Chinanúmero de malha, 50
celulaseYoutell Biochemical, Shandong, China200 PFU / mL

Referências

  1. Zeng, A. P., Biebl, H. Bulk chemicals from biotechnology: the case of 1, 3-propanediol production and the new trends. Adv Biochem Eng Biotechnol. 74, 239-259 (2002).
  2. Wei, D., Wang, M., Jiang, B., Shi, J., Hao, J. Role of dihydroxyacetone kinases I and II in the dha regulon of Klebsiella pneumoniae. J Biotechnol. 177, 13-19 (2014).
  3. Celińska, E., Grajek, W. Biotechnological production of 2,3-butanediol-current state and prospects. Biotechnol Adv. 27 (6), 715-725 (2009).
  4. Chen, C., Wei, D., Shi, J., Wang, M., Hao, J. Mechanism of 2, 3-butanediol stereoisomer formation in Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 98 (10), 4603-4613 (2014).
  5. Wei, D., Wang, M., Shi, J., Hao, J. Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (8), 1219-1226 (2012).
  6. Wei, D., Sun, J., Shi, J., Liu, P., Hao, J. New strategy to improve efficiency for gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (5), 523-527 (2013).
  7. Chen, C., et al. Inhibition of RecBCD in Klebsiella pneumoniae by Gam and its effect on the efficiency of gene replacement. J Basic Microbiol. 56 (2), 120-126 (2016).
  8. Wang, D., et al. R-acetoin accumulation and dissimilation in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 42 (8), 1105-1115 (2015).
  9. Wei, D., Xu, J., Sun, J., Shi, J., Hao, J. 2-Ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (6), 561-570 (2013).
  10. Sun, Y., et al. Two-stage fermentation for 2-ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae. J Microbiol Biotechnol. 24 (6), 781-787 (2014).
  11. Wang, D., et al. Gluconic acid production by gad mutant of Klebsiella pneumoniae. World J Microbiol Biotechnol. 32 (8), 1-11 (2016).
  12. Wang, C., et al. Production of xylonic acid by Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 100 (23), 10055-10063 (2016).
  13. Kumar, P., Barrett, D. M., Delwiche, M. J., Stroeve, P. Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production. Ind Eng Chem Res. 48 (8), 3713-3729 (2009).
  14. Brisse, S., Grimont, F., Grimont, P. A. The genus Klebsiella. The Prokaryotes. , Springer. 159-196 (2006).
  15. Hao, J., Lin, R., Zheng, Z., Liu, H., Liu, D. Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1, 3-propanediol under aerobic conditions. World J Microbiol Biotechnol. 24 (9), 1731-1740 (2008).
  16. Hong, E., et al. Optimization of alkaline pretreatment on corn stover for enhanced production of 1.3-propanediol and 2, 3-butanediol by Klebsiella pneumoniae AJ4. Biomass Bioenerg. 77, 177-185 (2015).
  17. Pienkos, P. T., Zhang, M. Role of pretreatment and conditioning processes on toxicity of lignocellulosic biomass hydrolysates. Cellulose. 16 (4), 743-762 (2009).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Produção de 23-ButanodiolProdução de AcetoinÁcido 2-CetoglicônicoÁcido XilônicoHidrólise EnzimáticaFermentação MicroaeróbicaFermentação AeróbicaCromatografia Líquida de Alta Eficiência
Produção de produtos químicos por
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.